Name: Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Aprende a medir la entrada de calcio dependiente de reservas en células vivas mediante indicadores fluorescentes. Este método permite estudiar la dinámica del calcio en células cancerosas y fibras musculares esqueléticas con alta resolución espacial y temporal.

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Agradecemos al Dr. Noah Weisleder para la lectura y la edición de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación Fundación UMDNJ 62-09 a ZP, la American Heart Association SDG2630086 de XZ, 0535555N a MB, y los Institutos Nacionales de Salud RC2AR058962-01 a MB.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Aunque las longitudes de onda de excitación para el Ca 2 +-unión y Ca 2 + libre Fura-2 son 340 nm y 380 nm, respectivamente, el rango dinámico mejor relación de Fura-2 para el Ca 2 + medición concentración puede ocurrir en otras longitudes de onda en un determinado microscopio sistema. Estos cambios en la longitud de onda son por lo general debido a los cambios en la trayectoria óptica con la adición de diversos componentes ópticos. En este estudio, las longitudes de onda de excitación para Fura-2 se determinó como 350 nm y 390 nm mediante la realización de análisis espectral de Fura-2 fluorescencia. El nivel intracelular de Ca 2 + en el citosol de los resultados de un saldo de varias fuentes, incluyendo intracelular de Ca 2 + en libertad, extracelular de Ca 2 + de entrada, así como de Ca 2 + mecanismo de exclusión en la membrana del RE y de plasma. Para aislar el unidireccional SOC mediada por Ca 2 + afluencia de Ca 2 + intracelular de liberación de Ca 2 + extrusion, el Mn 2 ensayo temple + puede utilizarse. Mn 2 + se sabe que es capaz de penetrar en las células a través SOCE pero es impermeable a la extrusión superficie de la membrana o la absorción de ER por Ca 2 + bombas. Por lo tanto, extinción de fluorescencia representa una medición de unidireccional Mn 2 + flujo en células que calcula el grado de activación de SOCE. Mn 2 + ensayo enfriamiento se realiza en el punto isosbéstico, en tal longitud de onda Fura-2 intensidad de fluorescencia es independiente de la concentración de Ca 2 +. El punto isosbéstico para cada sistema debe ser determinada por análisis de espectro. Alternativamente, Mn 2 + temple puede ser registrada por fluorescencia ajustada en cualquiera de las dos longitudes de onda de tal manera que el valor final es independiente de la concentración de Ca 2 + 13. Para obtener la información espacial y temporal de la actividad de SOCE en los músculos esqueléticos, se empleó un método de doble medio de contraste, que permite MeasureMe simultáneant de la actividad SOCE y SR Ca 2 + en el contenido de piel de mamíferos adultos fibras musculares EDL. La correlación entre los cambios en la SR Ca 2 + contenido y la actividad SOCE se pueden trazar para indicar el umbral y la sensibilidad de activación de SOCE al agotamiento de la Ca 2 + almacenamiento SR. La solución de TT de carga está optimizado para cargar, además, los túbulos T con Ca 2 + y para la maduración de los túbulos T y la solución de SR de carga está diseñada para promover la máxima SR Ca 2 + y de carga para cargar, además, los túbulos T con aproximadamente 500 mM de Ca 2 +. FCCP está incluido en la solución de TT / SR-carga y la solución SR agotan para eliminar los efectos de las mitocondrias.

Tabla de reactivos y equipos específicos: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10 a 040 CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10 a 080 CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio placa inferior </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 PM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, sellado hermético, protegido de la luz, se disolvió en DMSO </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, sellado hermético, protegido de lDERECHO </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, sellado hermético, protegido de la luz </td></tr><tr><td> Cubeta de cuarzo </td><td> Las células Starna </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa tipo I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Equipos: <ol><li> Un espectrofluorómetro (Photon International Technology, New Jersey): lámpara de xenón de arco, controlado por ordenador de alta velocidad monocromador de acceso aleatorio, basado en la cubeta de emisión monocromador, Nikon TE-200 de fluorescencia invertido microscópicasE, S Fluor 40x/1.30 objetivo de aceite, los detectores de PMT. </li><li> Microscopio confocal de barrido láser (BioRad Radiance2100): 453/477/488/514 con láser de argón, láser HeNe 543nm, Nikon TE2000 microscopio invertido, el objetivo de 60X (NA 1,4, el aceite). </li><li> Un microscopio estereoscópico con una potencia de magnificación&gt; 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo). </li></ol>

basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Tienda operada de Ca 2 + entrada (SOCE), antes denominado capacitiva de entrada de Ca 2 +, es un mecanismo estrictamente regulado por la afluencia de Ca 2 + extracelular en las células para reponer retículo agotado endoplasmático (ER) o retículo sarcoplásmico (SR) de Ca 2 + tiendas 1,2. Desde Ca 2 + es un segundo mensajero en todas partes, no es sorprendente ver que SOCE juega un papel importante en una variedad de procesos celulares, incluyendo la proliferación, la apoptosis la transcripción de genes, y la motilidad. Debido a su gran incidencia en casi todos los tipos de células, incluyendo las células epiteliales y de los músculos esqueléticos, esta vía ha recibido un gran interés 3,4. Sin embargo, la heterogeneidad de las características de Soce en diferentes tipos de células y la función fisiológica aún no están claras 5-7. Las propiedades funcionales de los canales de SOCE puede ser revelada por los estudios de patch-clamp, mientras que una gran cantidad de conocimiento acerca de thivía s se ha ganado por fluorescencia basados ​​en Ca 2 + intracelular mediciones debido a su conveniencia y la viabilidad de selección de alto rendimiento. El objetivo de este informe es un resumen de algunos de fluorescencia basada en métodos para medir la activación de SOCE en la monocapa de células, células en suspensión y fibras musculares 5,8-10. El más utilizado de estos métodos de fluorescencia es supervisar directamente la dinámica de la Ca 2 + intracelular utilizando la relación de F y F 340 nm 380 nm (510 nm para la emisión de longitud de onda) de la radiométrica de Ca 2 + indicador Fura-2. Para aislar la actividad de SOCE unidireccional de Ca 2 + intracelular de liberación de Ca 2 + de extrusión, un ensayo de Mn 2 + enfriamiento se utiliza con frecuencia. Mn 2 + se sabe que es capaz de penetrar en las células a través SOCE mientras que es impermeable a los procesos de extrusión de superficie de membrana o de la absorción de ER por Ca 2 + bombas, debido a su ingenio afinidad muy altah Fura-2. Como resultado, el temple de Fura-2 fluorescencia inducida por la entrada de Mn 2 + extracelular en las células representa una medición de la actividad de SOCE 9. Medición radiométrico y el Mn +2 ensayos enfriamiento se puede realizar en un espectrofluorómetro cubeta basado en un modo de población de células o en un sistema basado en microscopio para visualizar las células individuales. La ventaja de las mediciones de una sola célula es que las células individuales sometidos a manipulaciones genéticas se pueden seleccionar con las buenas prácticas agrarias o de los periodistas RFP, lo que permite estudios en células modificadas genéticamente o mutado. Las características espacio-temporales de SOCE en el músculo esquelético estructuralmente especializado se puede lograr en las fibras musculares de piel por simultáneamente el control de la fluorescencia de dos baja afinidad Ca 2 + indicadores destinados a los compartimientos específicos de la fibra muscular, tales como Fluo-5N en el RE y los Rhod 5N en la transversal túbulos 9,11,12.

La extensión de la tienda que funciona con Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Entrada (SOCE) se puede controlar usando fluorescentes Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicadores. Minnesota<sup&gt; 2 +</sup&gt; Temple de tales indicadores SOCE ensayos en células cultivadas y las fibras del músculo esquelético. Una técnica que permite la resolución espacial y temporal de SOCE por la imagen confocal de las fibras musculares mecánicamente aisladas, también se describe.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

La entrada de Ca2+ operada por depósitos (SOCE), anteriormente denominada entrada de Ca2+ capacitativa, es un mecanismo estrechamente regulado para el influjo de Ca2+ extracelular hacia las células para...

Este método experimental se utiliza para revelar las propiedades de la entrada de calcio regulada por el almacén o SOCE en células cancerosas y musculares esqueléticas, empleando métodos basados en fluorescencia. Esto se logra registrando la fluorescencia de URA dos en células vivas, que es sensible a la concentración intracelular de calcio. Además, se mide la velocidad de atenuación de la fluorescencia mediante la adición de manganeso a una longitud de onda insensible a la concentración de calcio, lo cual refleja directamente la activación de SOCE para estudiar SOCE.En células musculares esqueléticas estructuralmente especializadas, los músculos se disecan y se despojan de su cubierta. Se preparan fibras musculares. Luego, las fibras se tratan con indicadores de calcio de baja afinidad y se monitorea su fluorescencia interna.Estos métodos demuestran que la entrada de calcio dependiente del almacenamiento (SOCE) existe tanto en células no excitables como en músculos esqueléticos, con una activación graduada y un acoplamiento estrecho al contenido del almacén intracelular de calcio. La principal ventaja de esta técnica basada en fluoresceína frente a otros métodos como la electrofisiología o el parche de clanes es que es fácil de usar y puede aplicarse al estudio de poblaciones celulares o a cribados de alto rendimiento. Es importante utilizar el esteticista S adecuado para el entorno métrico ritual y el ensayo de mag coning.Por lo tanto, la calibración de cada instrumento es crucial porque cada uno es diferente. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el proceso mecánico de aislamiento de fibras musculares individuales es difícil de aprender, ya que requiere una formación práctica especializada, una comprensión profunda y el aprendizaje de técnicas de microdisección, observación cuidadosa y mucha paciencia. Antes de comenzar, calibre el sistema del microscopio para la medición de la fluorescencia de URA dos. Aunque las longitudes de onda de excitación para la unión de calcio y para el URA dos son 340 y 380 nanómetros, el mejor rango dinámico de la relación de URA dos para la medición de calcio puede ocurrir en otras longitudes de onda en un sistema microscópico particular.Estos cambios en las longitudes de onda se deben a variaciones en la trayectoria óptica provocadas por los componentes ópticos adicionales. De manera similar, el punto espástico ISO para cada sistema también varía. Por lo tanto, es importante determinar estas longitudes de onda mediante el escaneo espectral.Alternativamente, la selección Ming puede registrarse mediante fluorescencia a dos longitudes de onda cualesquiera, de tal manera que el valor final sea independiente de la concentración de calcio. Comience por transfectar cultivos de K Ys SE con un máximo de 50 células con plásmidos que expresen RFP y que contengan ya sea HRNA específicamente contra o I uno o una secuencia aleatorizada durante 48 horas. Cultive las células transfectadas en placas con fondo de vidrio.Luego, retire el medio y lave las células con una solución salina equilibrada o BSS. Después del lavado, agregue un mililitro de BSS que contenga dos micromoles de RA 2:00 AM y mantenga la placa a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Deje las células a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir que la forma intracelular de URA 2:00 AM se convierta en URA dos.Luego lave la placa dos veces con BSS bajo el microscopio. En el modo de visualización, seleccione las células que expresan RFP. Seleccione el modo de relación de excitación con la longitud de onda de emisión ajustada a 510 nanómetros y las longitudes de onda de excitación a 350 y 390 nanómetros.La proporción se muestra en la tercera ventana. A continuación, registre la fluorescencia de las células seleccionadas a las longitudes de onda predeterminadas mientras las células se perfunden con cuatro soluciones diferentes.De manera similar, las células KYSE 150 se cargan con fura-2 y se someten a grabación. En el modo de relación de excitación, a diferencia del procedimiento anterior, se selecciona el punto isosbestico de 360 nanómetros como longitud de onda de excitación. Luego se registra simultáneamente la fluorescencia a 360 y 390 nanómetros mientras las células se perfunden con cinco soluciones BSS diferentes.Para este protocolo, las células C2C12, una línea celular miogénica de ratón, deben cultivarse en placas con fondo de vidrio hasta alcanzar la confluencia y luego diferenciarse en tubos miotubos en un medio de diferenciación que contiene 2,5 % de suero de caballo. Cargue los miotubos C2C12 con una concentración final de cinco micromoles de RA 2:00 AM en solución BSS e incúbelos durante 40 minutos. A continuación, agregue una concentración final de 20 micromoles de benzo p tolueno smida o BTS para inhibir las contracciones musculares y los artefactos de movimiento que ellas provocan.Incube las células durante 15 minutos a temperatura ambiente y mantenga BTS en todas las soluciones. A continuación, cargue cuatro. Equilibre las soluciones salinas en el sistema de perfusión.Como se describió previamente. Durante cada perfusión, registre la fluorescencia de las células seleccionadas a 360 y 390 nanómetros. En esta serie, se aplican juntos magnesio y tap argen para monitorear el apagado de iones de magnesio.Mientras las reservas de calcio del retículo endoplásmico se agotan. Para diseccionar el músculo extensor de los dedos o músculo EDL, coloque la pata de un ratón sacrificado en posición lateral y retire la piel de la zona del tobillo hasta la rodilla. Corte las capas musculares superficiales del tejido para exponer el EDL y seccione ambos tendones, el superior y el inferior, para liberar el músculo EDL intacto.Es importante mantener la longitud de los tendones lo más larga posible. Ahora, para prevenir cualquier contracción, transfiera el EDL a una solución T road que contenga 0,1 milimolar de EGTA y sin calcio bajo un microscopio estereoscópico. Separe los tendones de inserción de la rodilla en dos mitades y divida el músculo EDL en dos haces.Repita el proceso hasta obtener ocho haces. Si se pierden tendones de algún haz, deseche el haz. A continuación, sujete ambos tendones de una tira de haz EDL y estire cuidadosamente la tira hasta que queden intactas tres o cuatro fibras musculares individuales separadas, con tejido tendinoso en ambos extremos.Coloque una gota de tampón Tyro sin calcio en un recipiente de vidrio con fondo de cristal. Coloque los fragmentos de EDL rectos sobre el recipiente y elimine rápidamente la mayor cantidad posible de solución. A continuación, sujete firmemente ambos tendones con cinta adhesiva resistente al agua.Lave la fibra primero con la solución libre de calcio y luego dos veces con una solución de calcio de 2,5 milimolar. Si se observa hipercontracción o daño en la fibra, deseche la fibra; lave tres veces las fibras musculares sanas seleccionadas con la solución de lavado número uno, y luego sumérjalas en una solución de permeabilización modificada tipo intracelular durante cinco minutos. Usando una aguja de tungsteno sujeta a un portapinzas, permeabilice mecánicamente la fibra bajo un microscopio estereoscópico; las fibras se volverán a sellar y atraparán el colorante cinco n conjugado con calcio en los túbulos transversos.Obtener fibras musculares individuales sanas e íntegras, o al menos haces de este tipo de fibras que aún tengan algo de tendón adherido, es, en mi opinión, uno de los pasos más difíciles, seguido siempre por la transferencia, muy complicada, de estas fibras a la cámara experimental final. Durante este proceso, las fibras podrían contraerse en exceso o incluso romperse. Por lo tanto, si se tienen fibras sanas, la inserción mecánica en la solución de desmijarización será mucho más sencilla. Incubar las fibras en la solución de desmijarización con 20 micromolar flow cinco N am.Siga la incubación con lavados extensos y la solución de lavado número dos y 30 minutos de incubación adicional para permitir la desesterificación completa del colorante. Las fibras pueden visualizarse entonces mediante un microscopio confocal con un objetivo de 60 x en regiones de interés. Registre simultáneamente la fluorescencia de cada colorante mientras la fibra se perfunde con soluciones de carga y agotamiento de SR.La actividad de SOCE en células KYS, SE una 50 se examinó mediante la medición de calcio intracelular. Las células fueron transfectadas simultáneamente con RFP y un ARN de interferencia tipo cabello corto contra el gen OR I uno, que codifica el canal A-S-O-C-E, en comparación con los controles representados por el trazado negro. La inhibición de la expresión de OR I uno resultó en una disminución de la actividad de SOCE. La participación de SOCE y KYC una 50 células también se confirmó mediante el ensayo de apagado con manganeso. Después de que TG agotó por completo las reservas de calcio en el retículo endoplásmico, la perfusión de manganeso provocó una disminución significativa de la fluorescencia.La pendiente más pronunciada de la pérdida de señal de URA dos indica una SOC más activa. Por lo tanto, la disminución lenta de la fluorescencia en células tratadas con dos A PB indica que la actividad de SOC fue bloqueada por este compuesto. Las tasas de apagado por manganeso se determinaron a partir de los primeros 10 segundos, donde el apagado aún estaba dentro del rango lineal sin saturación; se realizó un ensayo de apagado por manganeso similar en células musculares cultivadas.En este caso, se aplicó manganeso junto con tg. Mientras que TG agotaba las reservas de calcio del retículo sarcoplásmico, la pendiente de apagamiento fluorescente cambió gradualmente hasta alcanzar su velocidad máxima. La curva sigmoidea indicó la activación progresiva de la entrada de calcio mediada por canales de almacenamiento (SOCE) bajo estas condiciones experimentales.Bajo imágenes confocales, el atrapamiento de fibra desprovista de membrana de road five y muerte en el compartimento TT mostró el patrón doble característico de mamíferos, como se observa en el canal rojo. Después de la carga del RS con flow five NM, el patrón típico y punteado del RS fue visible en el canal verde tras la perfusión de la fibra desprovista con la solución de carga TTSR; la intensidad de fluorescencia de road five N y flow five n aumentó tras la perfusión con la solución de agotamiento del RS. Los niveles de fluorescencia en el compartimento del RS y en el compartimento TT comenzaron a disminuir. Esto indicó que existía un acoplamiento entre el agotamiento del almacén de calcio del RS y la activación de SOCE, respectivamente.Después de ver este video, debería tener una comprensión muy clara de cómo obtener fibras musculares viables, sanas e intactas. Estas deben tener suficiente tendón en sus extremos para permitirle un proceso de fijación efectivo, lo que finalmente permitirá al investigador contar con una preparación fisiológicamente relevante que tiene una ventaja increíble. No olvide que todos los colorantes fluorescentes utilizados en este estudio son generalmente sensibles a la luz, y se deben tomar precauciones, como la carga en placas oscuras y el lavado en habitaciones oscuras, que siempre deben practicarse al realizar este procedimiento.Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en pocas horas. Lo que sugerimos es obtener primero varias fibras intactas para permitir un porcentaje mayor de éxito en los pasos mecánicos de disgregación, y también si se desea cultivar estas fibras durante la noche tras su aislamiento. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la señalización de calcio exploraran el papel de la entrada de calcio regulada por depósitos en el crecimiento y la muerte de células cancerosas.La función fisiológica y patológica en el músculo.

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Investigación

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Biología

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Source: Heredia, D. J., et. al. Imágenes ex vivo de la señalización de calcio específica de la célula en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón. J. Vis. Exp. (2018) Este video demuestra imágenes de fluorescencia de la dinámica del calcio en las uniones neuromusculares (NMJs) en un ratón transgénico expresando indicadores de calcio codificados genéticamente. Un MNJ se identifica por receptores de acetilcolina marcados con fluorescencia en el diafragma con el nervio frénico. Un divisor de...

Imágenes de fluorescencia de la dinámica del calcio en las uniones neuromusculares en el diafragma de un ratón transgénico

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Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

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Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .

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Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

El presente artículo describe la realización de un enfoque de imagen intravital para observar la señalización de calcio inducida mecánicamente de osteocitos incrustados in vivo en tiempo real en respuesta a la carga mecánica a nivel tisular del tercer metatarsiano del ratón.

Un enfoque de imagen intravital fluorescente para estudiar la dinámica de señalización de calcio inducida por la carga en osteocitos de ratón

La fluorometría funcional dirigida al sitio es un método para estudiar los movimientos del dominio de la proteína en tiempo real. La modificación de esta técnica para su aplicación en células nativas ahora permite la detección y el seguimiento de movimientos de un solo sensor de voltaje de canales Ca2+ dependientes de voltaje en fibras musculares esqueléticas aisladas murinas.

Fluorometría funcional dirigida al sitio en células nativas para estudiar la excitabilidad del músculo esquelético

Este artículo presenta un método para el monitoreo cuantitativo en tiempo real de las concentraciones de iones de calcio (Ca2+) en células utilizando imágenes de Ca2+ de una sola célula con el colorante Fura-2 / AM. Esta técnica permite una carga eficiente de colorante y un cálculo preciso de los niveles de Ca2+ a través de las relaciones de intensidad de fluorescencia, lo que la convierte en un enfoque simple y rápido para aplicaciones de investigación.

Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

Aprende a medir la entrada de calcio dependiente de reservas en células vivas mediante indicadores fluorescentes. Este método permite estudiar la dinámica del calcio en células cancerosas y fibras musculares esqueléticas con alta resolución espacial y temporal.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética (Video) | JoVE Journal

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

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