Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Este método experimental se utiliza para revelar las propiedades de la entrada de calcio regulada por el almacén o SOCE en células cancerosas y musculares esqueléticas, empleando métodos basados en fluorescencia. Esto se logra registrando la fluorescencia de URA dos en células vivas, que es sensible a la concentración intracelular de calcio. Además, se mide la velocidad de atenuación de la fluorescencia mediante la adición de manganeso a una longitud de onda insensible a la concentración de calcio, lo cual refleja directamente la activación de SOCE para estudiar SOCE.

En células musculares esqueléticas estructuralmente especializadas, los músculos se disecan y se despojan de su cubierta. Se preparan fibras musculares. Luego, las fibras se tratan con indicadores de calcio de baja afinidad y se monitorea su fluorescencia interna.

Estos métodos demuestran que la entrada de calcio dependiente del almacenamiento (SOCE) existe tanto en células no excitables como en músculos esqueléticos, con una activación graduada y un acoplamiento estrecho al contenido del almacén intracelular de calcio. La principal ventaja de esta técnica basada en fluoresceína frente a otros métodos como la electrofisiología o el parche de clanes es que es fácil de usar y puede aplicarse al estudio de poblaciones celulares o a cribados de alto rendimiento. Es importante utilizar el esteticista S adecuado para el entorno métrico ritual y el ensayo de mag coning.

Por lo tanto, la calibración de cada instrumento es crucial porque cada uno es diferente. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el proceso mecánico de aislamiento de fibras musculares individuales es difícil de aprender, ya que requiere una formación práctica especializada, una comprensión profunda y el aprendizaje de técnicas de microdisección, observación cuidadosa y mucha paciencia. Antes de comenzar, calibre el sistema del microscopio para la medición de la fluorescencia de URA dos. Aunque las longitudes de onda de excitación para la unión de calcio y para el URA dos son 340 y 380 nanómetros, el mejor rango dinámico de la relación de URA dos para la medición de calcio puede ocurrir en otras longitudes de onda en un sistema microscópico particular.

Estos cambios en las longitudes de onda se deben a variaciones en la trayectoria óptica provocadas por los componentes ópticos adicionales. De manera similar, el punto espástico ISO para cada sistema también varía. Por lo tanto, es importante determinar estas longitudes de onda mediante el escaneo espectral.

Alternativamente, la selección Ming puede registrarse mediante fluorescencia a dos longitudes de onda cualesquiera, de tal manera que el valor final sea independiente de la concentración de calcio. Comience por transfectar cultivos de K Ys SE con un máximo de 50 células con plásmidos que expresen RFP y que contengan ya sea HRNA específicamente contra o I uno o una secuencia aleatorizada durante 48 horas. Cultive las células transfectadas en placas con fondo de vidrio.

Luego, retire el medio y lave las células con una solución salina equilibrada o BSS. Después del lavado, agregue un mililitro de BSS que contenga dos micromoles de RA 2:00 AM y mantenga la placa a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Deje las células a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir que la forma intracelular de URA 2:00 AM se convierta en URA dos.

Luego lave la placa dos veces con BSS bajo el microscopio. En el modo de visualización, seleccione las células que expresan RFP. Seleccione el modo de relación de excitación con la longitud de onda de emisión ajustada a 510 nanómetros y las longitudes de onda de excitación a 350 y 390 nanómetros.

La proporción se muestra en la tercera ventana. A continuación, registre la fluorescencia de las células seleccionadas a las longitudes de onda predeterminadas mientras las células se perfunden con cuatro soluciones diferentes.

De manera similar, las células KYSE 150 se cargan con fura-2 y se someten a grabación. En el modo de relación de excitación, a diferencia del procedimiento anterior, se selecciona el punto isosbestico de 360 nanómetros como longitud de onda de excitación. Luego se registra simultáneamente la fluorescencia a 360 y 390 nanómetros mientras las células se perfunden con cinco soluciones BSS diferentes.

Para este protocolo, las células C2C12, una línea celular miogénica de ratón, deben cultivarse en placas con fondo de vidrio hasta alcanzar la confluencia y luego diferenciarse en tubos miotubos en un medio de diferenciación que contiene 2,5 % de suero de caballo. Cargue los miotubos C2C12 con una concentración final de cinco micromoles de RA 2:00 AM en solución BSS e incúbelos durante 40 minutos. A continuación, agregue una concentración final de 20 micromoles de benzo p tolueno smida o BTS para inhibir las contracciones musculares y los artefactos de movimiento que ellas provocan.

Incube las células durante 15 minutos a temperatura ambiente y mantenga BTS en todas las soluciones. A continuación, cargue cuatro. Equilibre las soluciones salinas en el sistema de perfusión.

Como se describió previamente. Durante cada perfusión, registre la fluorescencia de las células seleccionadas a 360 y 390 nanómetros. En esta serie, se aplican juntos magnesio y tap argen para monitorear el apagado de iones de magnesio.

Mientras las reservas de calcio del retículo endoplásmico se agotan. Para diseccionar el músculo extensor de los dedos o músculo EDL, coloque la pata de un ratón sacrificado en posición lateral y retire la piel de la zona del tobillo hasta la rodilla. Corte las capas musculares superficiales del tejido para exponer el EDL y seccione ambos tendones, el superior y el inferior, para liberar el músculo EDL intacto.

Es importante mantener la longitud de los tendones lo más larga posible. Ahora, para prevenir cualquier contracción, transfiera el EDL a una solución T road que contenga 0,1 milimolar de EGTA y sin calcio bajo un microscopio estereoscópico. Separe los tendones de inserción de la rodilla en dos mitades y divida el músculo EDL en dos haces.

Repita el proceso hasta obtener ocho haces. Si se pierden tendones de algún haz, deseche el haz. A continuación, sujete ambos tendones de una tira de haz EDL y estire cuidadosamente la tira hasta que queden intactas tres o cuatro fibras musculares individuales separadas, con tejido tendinoso en ambos extremos.

Coloque una gota de tampón Tyro sin calcio en un recipiente de vidrio con fondo de cristal. Coloque los fragmentos de EDL rectos sobre el recipiente y elimine rápidamente la mayor cantidad posible de solución. A continuación, sujete firmemente ambos tendones con cinta adhesiva resistente al agua.

Lave la fibra primero con la solución libre de calcio y luego dos veces con una solución de calcio de 2,5 milimolar. Si se observa hipercontracción o daño en la fibra, deseche la fibra; lave tres veces las fibras musculares sanas seleccionadas con la solución de lavado número uno, y luego sumérjalas en una solución de permeabilización modificada tipo intracelular durante cinco minutos. Usando una aguja de tungsteno sujeta a un portapinzas, permeabilice mecánicamente la fibra bajo un microscopio estereoscópico; las fibras se volverán a sellar y atraparán el colorante cinco n conjugado con calcio en los túbulos transversos.

Obtener fibras musculares individuales sanas e íntegras, o al menos haces de este tipo de fibras que aún tengan algo de tendón adherido, es, en mi opinión, uno de los pasos más difíciles, seguido siempre por la transferencia, muy complicada, de estas fibras a la cámara experimental final. Durante este proceso, las fibras podrían contraerse en exceso o incluso romperse. Por lo tanto, si se tienen fibras sanas, la inserción mecánica en la solución de desmijarización será mucho más sencilla. Incubar las fibras en la solución de desmijarización con 20 micromolar flow cinco N am.

Siga la incubación con lavados extensos y la solución de lavado número dos y 30 minutos de incubación adicional para permitir la desesterificación completa del colorante. Las fibras pueden visualizarse entonces mediante un microscopio confocal con un objetivo de 60 x en regiones de interés. Registre simultáneamente la fluorescencia de cada colorante mientras la fibra se perfunde con soluciones de carga y agotamiento de SR.

La actividad de SOCE en células KYS, SE una 50 se examinó mediante la medición de calcio intracelular. Las células fueron transfectadas simultáneamente con RFP y un ARN de interferencia tipo cabello corto contra el gen OR I uno, que codifica el canal A-S-O-C-E, en comparación con los controles representados por el trazado negro. La inhibición de la expresión de OR I uno resultó en una disminución de la actividad de SOCE. La participación de SOCE y KYC una 50 células también se confirmó mediante el ensayo de apagado con manganeso. Después de que TG agotó por completo las reservas de calcio en el retículo endoplásmico, la perfusión de manganeso provocó una disminución significativa de la fluorescencia.

La pendiente más pronunciada de la pérdida de señal de URA dos indica una SOC más activa. Por lo tanto, la disminución lenta de la fluorescencia en células tratadas con dos A PB indica que la actividad de SOC fue bloqueada por este compuesto. Las tasas de apagado por manganeso se determinaron a partir de los primeros 10 segundos, donde el apagado aún estaba dentro del rango lineal sin saturación; se realizó un ensayo de apagado por manganeso similar en células musculares cultivadas.

En este caso, se aplicó manganeso junto con tg. Mientras que TG agotaba las reservas de calcio del retículo sarcoplásmico, la pendiente de apagamiento fluorescente cambió gradualmente hasta alcanzar su velocidad máxima. La curva sigmoidea indicó la activación progresiva de la entrada de calcio mediada por canales de almacenamiento (SOCE) bajo estas condiciones experimentales.

Bajo imágenes confocales, el atrapamiento de fibra desprovista de membrana de road five y muerte en el compartimento TT mostró el patrón doble característico de mamíferos, como se observa en el canal rojo. Después de la carga del RS con flow five NM, el patrón típico y punteado del RS fue visible en el canal verde tras la perfusión de la fibra desprovista con la solución de carga TTSR; la intensidad de fluorescencia de road five N y flow five n aumentó tras la perfusión con la solución de agotamiento del RS. Los niveles de fluorescencia en el compartimento del RS y en el compartimento TT comenzaron a disminuir. Esto indicó que existía un acoplamiento entre el agotamiento del almacén de calcio del RS y la activación de SOCE, respectivamente.

Después de ver este video, debería tener una comprensión muy clara de cómo obtener fibras musculares viables, sanas e intactas. Estas deben tener suficiente tendón en sus extremos para permitirle un proceso de fijación efectivo, lo que finalmente permitirá al investigador contar con una preparación fisiológicamente relevante que tiene una ventaja increíble. No olvide que todos los colorantes fluorescentes utilizados en este estudio son generalmente sensibles a la luz, y se deben tomar precauciones, como la carga en placas oscuras y el lavado en habitaciones oscuras, que siempre deben practicarse al realizar este procedimiento.

Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en pocas horas. Lo que sugerimos es obtener primero varias fibras intactas para permitir un porcentaje mayor de éxito en los pasos mecánicos de disgregación, y también si se desea cultivar estas fibras durante la noche tras su aislamiento. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la señalización de calcio exploraran el papel de la entrada de calcio regulada por depósitos en el crecimiento y la muerte de células cancerosas.

La función fisiológica y patológica en el músculo.