Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

Hola, soy Jersey. Hola, mi nombre es Shabi y ambos somos investigadores postdoctorales en el Imperial College de Londres, trabajando con el profesor Andrew Di Melo y el Dr. Josh Del en plataformas de gotas microfluídicas. Las plataformas microfluídicas basadas en gotas son candidatas prometedoras para la experimentación de mayor rendimiento porque se pueden generar a volúmenes muy altos definidos con precisión y sus competidores, la frecuencia de generación puede ser tan alta como varios kilo pers.

Además, dado que la región de interés se puede encapsular en compartimentos a partir de unos pocos litros, se pueden eliminar tanto la diafonía como la dispersión, y los procesos analíticos se pueden cronometrar con mayor precisión. En nuestro grupo, ya hemos implementado con éxito plataformas de micro gotas para muchas aplicaciones. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa, la síntesis de nanopartículas y el ensayo de célula molecular única.

Las grandes cantidades de información generada dentro de estos sistemas deben extraerse, aprovecharse y utilizarse de manera eficiente. A este respecto, el método de detección elegido debe ser el adecuado, proporcionar una alta sensibilidad y bajos límites de detección, ser aplicable a una serie de especies moleculares, ser no destructivo y poder integrarse con dispositivos microfluídicos de manera sencilla. Para abordar esta necesidad, hemos desarrollado un conjunto de herramientas y protocolos experimentales que permiten la extracción de grandes cantidades de información física de entornos de pequeño volumen, y son aplicables al análisis de una amplia gama de factores físicos, químicos y biológicos.

En este protocolo, presentaremos los métodos que se aplican a la detección de celdas individuales y el mapeo de procesos de mezcla en Dropbox. Los chips microfluídicos se fabrican tradicionalmente en polidimetil Sloane PGMS utilizando métodos de fotolitografía. Este proceso debe llevarse a cabo en una instalación de sala limpia para obtener canales microfluídicos Spinco, SU eight 50 en una oblea de silicona hornear suavemente en una placa caliente a 65 grados y 95 grados para evaporar el solvente y densificar la película después de enfriarse, exponer el SU ocho, resistir con la radiación UV bajo la máscara adecuada, y luego hornee la oblea a 65 grados y 95 grados después de enfriar.

Revele las áreas no expuestas usando la solución de revelado adecuada mientras revuelve. Use solvente EC fresco para enjuagar la oblea y luego séquela con gas para generar una superficie limpia. Trate la oblea con lavados de hexano y metanol.

Además, para completar el proceso de fabricación maestro de esate, evapore un agente agarrotante en la superficie en un desecado durante 40 minutos. Para formar sustratos microfluídicos estructurados, mezclamos S guard 1 8 4 en una proporción de 10 a uno de reticulante de resina y lo pasamos por encima del maestro. Desgasificar esto en un desecado y curar el dispositivo a 65 grados.

Corta el PDMS curado y pélalo del maestro. Cree orificios de acceso para tubos fluídicos con un punzón de biopsia. Cura otra capa de PDMS durante 20 minutos a 65 grados.

Coloque la capa superior preparada sobre la capa inferior y cure durante la noche a 65 grados. Pela las fichas de la placa de Petri y córtalas en dados. Una vez que se han fabricado los chips, están listos para ser utilizados mediante la infusión de las soluciones de interés.

Llene las jeringas con las soluciones requeridas, asegurándose de que no queden burbujas de aire en ninguna parte del tubo. Para la generación de gotas, se utilizan dos fases. La fase acuosa dispersa contiene los reactivos de interés.

La fase oleosa actúa como un tubo de ajuste de fase continua del mismo diámetro interno que la jeringa, las puntas de la aguja en un extremo de las agujas montan las jeringas en una bomba de jeringa y definen el caudal de infusión deseado. Para cada fase, se recomienda una proporción mínima de caudales acuosos de aceite de uno para evitar la humectación del PDMS por la fase acuosa, lo que conduciría a la formación de gotas inestables. Conecte los otros extremos de la tubería directamente a los orificios perforados en el sustrato PDMS.

Para soluciones más complejas, también se pueden implementar sílice, puertos capilares o conectores. Conecte el puerto de salida del chip a la tubería y diríjalo a un colector para la recolección de desechos o el procesamiento de análisis posterior. Una vez que se configura esto, hay dos configuraciones principales de microcanales para generar el enfoque de flujo de gotas o un formato de unión en T como resultado de las fuerzas puras que surgen del uso de estas geometrías para unir los dos fluidos admisibles y las entradas capilares posteriores que se desarrollan en la interfaz.

Se generan espontáneamente gotas dispersas tan pequeñas como unos pocos femtolímetros. Una vez que se generan las gotas, se pueden sondear mediante una configuración óptica. El sistema óptico está configurado según el siguiente protocolo.

Utilice un microscopio confocal con capacidad de posicionamiento submicrónico automatizado y un láser que funcione a una longitud de onda que coincida con la absorción de las caídas de flúor involucradas. Para excitarlos, use un láser de pulso que funcione a tasas de repetición de varios megahercios para obtener imágenes fluorescentes de por vida. Los experimentos con flema utilizan espejos de dirección del haz y ópticas para controlar la altura del haz, así como la dirección del haz.

Utilice un espejo dicroico para reflejar el rayo láser en la lente del objetivo. Si se utilizan dos láseres simultáneamente, se puede instalar un espejo diic de doble banda. Para permitir la reflexión de los dos rayos láser, utilice un objetivo de microscopio NA de alta apertura numérica corregido al infinito para llevar la luz láser a un enfoque estricto dentro de un canal microfluídico.

Recoge la fluorescencia emitida por la muestra dentro del canal microfluídico, utilizando el mismo objetivo de NA alto y transmitida a través del mismo espejo dicroico. Elimine cualquier luz de excitación residual utilizando un filtro de emisión de banda simple o doble. Enfoca la emisión de fluorescencia en un agujero de alfiler de 75 micrómetros.

Usando una lente convexa plana. Coloque el orificio en el plano confocal del objetivo del microscopio. Utilice otro espejo dicroico para dividir la señal fluorescente en dos detectores.

Filtre la fluorescencia reflejada por el espejo dicroico con un filtro de emisión y enfóquela con una lente convexa plana en el primer detector. Para experimentos que involucren un fluor rojo secundario, filtre la fluorescencia transmitida por el espejo diic con otro filtro de emisión y luego enfóquela con otra lente convexa plana en el segundo detector. Utilice fotodiodos de avalancha para la detección de fotones de fluorescencia.

Para la adquisición de datos de fluorescencia, acople la señal electrónica del detector de fotodiodos de avalancha a un dispositivo DAQ multifunción para el registro de datos que se ejecuta en una computadora personal. Para experimentos con flema, use un láser de pulso y conecte los detectores a una tarjeta TCS PC de conteo de fotón único correlacionada en el tiempo que se ejecute en una PC separada. Esta tarjeta permite obtener los datos de la vida útil de los fluorescentes.

Utilizando una metodología TCS PC. Cada fotón fluorescente detectado se correlaciona con un pulso láser incidente y, por lo tanto, a cada fotón fluorescente emitido se le asigna un tiempo de retardo. Estos datos se pueden ajustar a una curva de decaimiento exponencial simple o múltiple para obtener una estimación de la tasa radiativa de los fluoróforos.

Ahora sabemos que las células son muy heterogéneas tanto desde el punto de vista biológico como físico y químico. Por lo tanto, lo ideal es analizar cada célula a la vez. Sin embargo, los ensayos deben realizarse con un mayor rendimiento para que podamos recopilar suficiente información cuantitativa para llegar a una conclusión fiable y significativa.

Aquí tenemos un ejemplo de un encapsulamiento de células de E. coli en una sola gota, de modo que se puede realizar tal cual. Use la cepa de E. coli top 10 que se haya cultivado durante la noche. Para detectar la viabilidad de las células, utilice cyto nine y yoduro de propidio.

Ambos colorantes son colorantes intercotejantes de ADN y su intensidad de fluorescencia aumenta en más de 20 veces. Al unirse al ADN, el cito nueve es un tinte verde fluorescente que es permeable a la membrana y yoduro de propidio. Es un tinte rojo fluorescente, que es impermeable a la membrana.

Por lo tanto, las células vivas emiten fluorescencia verde, mientras que las células muertas exhiben emisiones verdes y rojas. Aquí podemos ver la generación de gotas y una encapsulación de una sola celda con una unión en T. Este video fue grabado con una cámara de alta velocidad, pero se pueden generar gotas a una velocidad de miles por segundo.

Al encapsular células, hay que asegurarse de que el cultivo de las células se diluya para que haya menos células que gotitas generadas, que se evite que las células se sedimenten, lo que puede ocurrir en la jeringa o el tubo. Use una barra de agitación magnética dentro de la jeringa para mantener las células distribuidas uniformemente en la solución. Utilice un tubo muy delgado, de 50 micrómetros, para conectar la jeringa al microchip.

Esto asegura un caudal rápido dentro de la tubería y, por lo tanto, evita que las células se sedimenten. Estos son los ejemplos típicos de recuentos de fotos en función del tiempo para los experimentos basados en células. Para mapear los procesos de mezcla dentro de las gotas.

Las gotas se pueden generar utilizando dos fluoro cuatro diferentes con diferentes tiempos de vida. Dentro de una gota que fluye, se genera un campo de flujo, que finalmente mezcla las dos soluciones originalmente separadas para mejorar el proceso de mezcla. La simetría del campo de flujo se puede alterar mediante el uso de canales de bobinado.

Para sondear las gotas, enfoque el volumen de la sonda óptica a la mitad de la altura de un microcanal a lo largo del cual fluyen las gotas, comenzando desde un lado del canal, realice cada experimento a lo largo de todo el ancho del canal. A intervalos de un micrómetro. Implemente un algoritmo para diferenciar las ráfagas individuales asociadas con las gotas del ruido de fondo de la fase oleosa y para establecer la duración de cada ráfaga.

Implemente un segundo algoritmo para extraer los valores de tiempo de retardo e intensidad a lo largo de la longitud de cada gota en el ancho particular donde se ha llevado a cabo el experimento. A continuación, utilice un algoritmo MLE de estimador de máxima verosimilitud para evaluar la vida útil de fluorescencia de cada gota en el experimento. El promedio de los valores de vida útil de todas las gotas del experimento reduce el error final del cálculo de MLE.

Cuantas más gotas se paldeen, menor será el error una vez que se ha obtenido una trayectoria de por vida. Para cada ancho, combine todas las trayectorias en un mapa 2D. Dado que cada valor de vida está asociado con una mezcla particular de los dos cuatro de la flora, se puede obtener un mapa de concentración o mezcla.

Hemos descrito la fabricación de un microdispositivo y la configuración experimental y los protocolos asociados para la formación de microgotas y la encapsulación de la región y la detección óptica del proceso, las gotas. En los dos ejemplos se seleccionó la detección de células individuales en gotas y el mapeo de los procesos de mezcla. En su interior, la gota que fluye representa aplicaciones comunes que se están investigando actualmente con la microfluídica de gotas.

Como ilustran los experimentos presentados, el uso de plataformas microfluídicas de gotas presenta ciertas características atractivas como el alto rendimiento que provocan el confinamiento perfecto y una mayor reproducibilidad. La gran cantidad de información producida y la velocidad máxima a la que se genera esta información. El uranio empobrecido requirió el uso de métodos de detección rápidos con la resolución espacio-temporal más alta si se quería obtener el máximo provecho de estas plataformas miniaturizadas.

En este caso, demostramos que esto es posible utilizando técnicas espectroscópicas fluoradas de alta precisión.