Name: Murino linfáticos superficiales Cirugía de los ganglios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Aprenda la técnica quirúrgica para extraer ganglios linfáticos superficiales en ratones anestesiados. Este método permite obtener suspensiones celulares viables para análisis de citometría de flujo y estudiar respuestas inmunitarias temporales.

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Damos las gracias a Lesage Sylvie y todos los miembros del laboratorio para la lectura crítica del protocolo. Este trabajo fue apoyado por una beca (MOP-77545) de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). Nathalie Labrecque con el apoyo de una Beca Senior de FRSQ y Mélissa Mathieu recibió un NSERC Alexander Graham Bell Canada Becas de Posgrado.

1. Preparación Antes de la cirugía Los ratones fueron tratados de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales Directrices. <ol><li> Ratones anestesiar por inyección de ketamina / xilazina (150/300 mg / kg, ip) o por inhalación de isoflurano (2%, oxígeno 1L). Si está disponible, isoflurano se debe utilizar, ya que permite un mejor control de tiempo de anestesia y profundidad. Además, el oxígeno se administra al mismo tiempo que soporta las funciones fisiológicas de los animales. Además, isoflurano está directamente eliminado por los pulmones y por lo tanto no requiere metabolismo hepático o renal. </li><li> Inyectar buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) o analgésico otro. </li><li> Aplique una pomada en los ojos de ratón antes de la cirugía para evitar la sequedad del ojo (si isoflurano se utiliza). </li><li> Compruebe que el ratón está dormido apretando sus garras y rodando su cola. Si el ratón no reacciona, proceder con la cirugía. </li></ol> 2. La Cirugía <pclase es posible eliminar de los ganglios linf superficiales la cirug inguinales y el brazo aislamiento ln m f en peque ratones delgados semanas ya que presencia tejido adiposo viejos pueden interferir con ln. sin embargo esta limitaci se supera pr repetida. para comodidad cosechar un a vez cuando realizamos curso del tiempo experimentos cosechamos cada dos d adem prevenir infecci antibi podr dar al rat pero no lo hacemos las heridas est sanando bien. uno debe ser consciente dependiendo dise experimental uso influir resultado observado ejemplo si una respuesta bacteria mide n todos instrumentos esterilizados despu condiciones as mantienen durante todo procedimiento.><ol><li> Ponga el mouse sobre un costado. </li><li> Localización de la región donde se llevará a cabo una incision, dependiendo de la LN que desea cosechar. (Figura 1). </li><li> Aplicar clorhexidina, o desinfectante otro, a esa región. </li><li> Hacer una pequeña incisión con tijeras (aproximadamente 5 mm) o bien en la parte posterior de la extremidad anterior o por encima de la pata trasera cerca del abdomen (Figura 1). </li><li> Quitar los pelos sueltos que han cortado con las pinzas. Si lo prefiere, puede afeitarse el ratón antes de hacer la incisión. Sin embargo, se alarga el procedimiento y se encuentra que no es necesario puesto que, como se muestra aquí, no mejora la infección curación o disminución, que son muy raros. </li><li> Estirar la incisión con 2 pinzas con el fin de ver la LN. La incisión puede llegar a 10 mm. El LN parece gris o más oscuro que la grasa que rodea. </li><li> Apriete la fascia (la membrana delgada que cubre la grasa y el tejido) en la parte superior de la LN con una pinza y tire suavemente sin romper el tejido circundante. </li><li> Colocar las pinzas segunda medida de lo posible underneath la LN. Con las pinzas en primer lugar, romper la fascia y retire la LN. Si usted ha recogido con éxito la LN, una mancha de sangre debe aparecer en el lugar donde se encontraba la LN con anterioridad. Nótese que los disipadores de LN en solución isotónica. Esta simple prueba le permite comprobar que se han extraído una LN y el tejido no graso. </li><li> Compruebe que no hay pelos en la herida. </li><li> Cerrar la incisión por pegar las 2 partes de piel juntos (el interior de la piel) y por grapado con un clip. Utilizamos algunos Clip Michel con las pinzas se aplican. Instalar uno o dos clips, dependiendo del tamaño de la incisión. Muy a menudo, los clips se caen cuando el tejido se cura. </li></ol> 3. Cuidado Postoperatorio <ol><li> Añadir un poco de alimento húmedo en el fondo de la jaula por lo que los ratones pueden alimentar fácilmente después de la cirugía. </li><li> Acerca de 6 a 8 horas después de la cirugía, comprobar los ratones para asegurarse de que no experimenta dolor. Observe cuidadosamente su comportamiento (la postura, la marcha, eninteracción con los congéneres y la apariencia de la piel). Si el aspecto general de los ratones es pobre, administrar una segunda dosis de buprenorfina. Al día siguiente, los ratones deben recuperar su comportamiento normal de lo contrario continuar con la administración de buprenorfina. Los ratones nunca debe llegar a los extremos previamente determinados y aceptados por el Consejo de Protección de los Animales. Es posible que desee buscar consejo y ayuda de su técnico en animales vivero cuidado. </li></ol> 4. Manejo de los ganglios del nodo <ol><li> En el laboratorio, para obtener una suspensión de células individuales, disociar la LN como por su procedimiento habitual. Pulsamos LN contra los toboganes helados y rutinariamente obtienen 1-2 x 10 6 células por LN. Por otra parte, preparamos la LN para la extracción de RNA. </li><li> Teñir las células según el protocolo habitual. Usted debe obtener esperados LN perfiles de citometría de flujo. </li></ol> 5. Los resultados representativos Un ejemplo de p dispersión hacia adelante y el ladomucho se muestra para LNs cosechadas a partir de un ratón anestesiado mediante cirugía o de un ratón sacrificado (Figura 2). El perfil y los porcentajes de células en la puerta de linfocitos en vivo son las mismas que demuestra que la cirugía de LN es una técnica apropiada para las células de la cosecha. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Inguinal y localización LN braquial en el ratón. A. La LN inguinal se encuentra justo encima de la pata trasera, ligeramente hacia el vientre. B. La LN braquial se encuentra detrás de la pata delantera. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Perfil citometría de flujo de los linfocitos obtenidos después de la cirugía LN. Y la cara perfiles de dispersión se muestran para LN cosechadas a partir de un Anesthetized ratón mediante cirugía (A) o de un ratón sacrificado (B). LN han sido recolectados, disociado y se analizaron en un citómetro de flujo. Los porcentajes de células en la puerta de linfocitos en vivo se muestran. </pclase>

<ol><li>Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+but+curtailed+T-cell+response+to+very+low-affinity+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen.</a> Nature. 458, 211-214 (2009).</li>
<li>Vezys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8+T-cell+compartment+grows+in+size+with+immunological+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience.</a> Nature. 457, 196-199 (2009).</li>
<li>Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+persistence+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+depend+on+T+cell+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1.</a> Immunity. 33, 229-240 (2010).</li>
<li>Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+central+memory+CD8+T+cells+is+independent+of+CD62L-mediated+trafficking+to+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes.</a> J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).</li>
<li>Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+complementation+of+MHC+class+II+deficiency+by+intrathymic+delivery+of+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses.</a> Immunity. 7, 123-134 (1997).</li>
<li>Witherden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-controllable+selection+of+CD4%28%2B%29+T+cells%3A+half-life+and+survival+signals+in+the+absence+of+major+histocompatibility+complex+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules.</a> J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).</li>
<li>Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+TCR+does+a+T+cell+need%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">How much TCR does a T cell need.</a> Immunity. 15, 71-82 (2001).</li>
<li>Leignadier, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+density+influences+CD8%2B+memory+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation.</a> PLoS One. 5, e13740(2010).</li>
<li>Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T-lymphocyte+survival+does+not+require+T-cell+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).</li>
<li>Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+persistence+is+required+throughout+the+expansion+phase+of+a+CD4%28%2B%29+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response.</a> J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).</li>
<li>Bassett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell+expansion+and+maintenance+after+recombinant+adenovirus+immunization+rely+upon+cooperation+between+hematopoietic+and+nonhematopoietic+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells.</a> Blood. 117, 1146-1155 (2011).</li>
<li>Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+receptor+expression+levels+do+not+identify+CD8%2B+memory+T+lymphocyte+precursors+following+peptide+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization.</a> J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).</li>
<li>Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+TCR+expression+on+naive+CD8%2B+T+cells+does+not+affect+memory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation.</a> Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito un protocolo de cirugía LN que puede aplicarse a muchos sistemas experimentales. Aunque es muy útil para seguir la respuesta inmune o la homeostasis de las células inmunitarias, esta técnica tiene algunas limitaciones. En primer lugar, sólo cuatro LN pueden ser cosechadas. En segundo lugar, estudió la respuesta inmune debe ser sistémica u ocurre en las inguinales superficiales o braquial (piel de drenaje) LNS. Finalmente, el número de células recolectadas se ve influida por la calidad de la eliminación LN...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Graefe Bellas Pinzas de primera calidad de patrón </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 52-2144 </td><td> Fuertemente curvado, de 10 cm (4 pulgadas), 0,8 mm de la punta </td></tr><tr><td> Clip Michel Aplicar y eliminar Pinzas </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 52-3779 </td><td> 12,5 cm (5 pulgadas) </td></tr><tr><td> Michel Clip 100 </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 52-3746 </td><td> 7,5-1,75 mm </td></tr><tr><td> Temgesic (hidrocloruro de buprenorfina) </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetalar (clorhidrato de ketamina) </td><td> Boniche de Salud Animal </td><td></td><td> DIN: 01989529 </td></tr><tr><td> Rompun (xilazina) </td><td> Bayer </td> &lt;td&gt; </td><td> DIN: 02169592 </td></tr><tr><td> El isoflurano </td><td> ABBOTT </td><td></td><td> DIN: 02032384 </td></tr><tr><td> Hypotears pomada para los ojos </td><td> Novartis Ophtalmics </td><td></td><td> DIN: 02133288 </td></tr><tr><td> Baxedin (gluconato de clorhexidina al 2% en alcohol isopropílico al 70%) </td><td> Omega </td><td> L0000017 </td><td> DIN: 02251477 </td></tr></tbody></table>

murino linfáticos superficiales cirugía de los ganglios

Murine Superficial Lymph Node Surgery

En el campo de la inmunología, para entender la progresión de una respuesta inmune contra una vacuna, una infección o un tumor, la respuesta es seguido a menudo con el tiempo. Del mismo modo, el estudio de la homeostasis de los linfocitos se requieren experimentos en curso. Realizar estos estudios dentro del mismo ratón es ideal para reducir la variabilidad experimental, así como el número de ratones utilizados. La extracción de sangre permite un rendimiento de experimentos de tiempo, pero sólo se da información sobre los linfocitos circulantes y proporciona un número limitado de células 1-4. Dado que los linfocitos que circulan por el cuerpo y que residen en los ganglios linfáticos tienen propiedades diferentes, es importante examinar ambas localidades. La eliminación secuencial de los ganglios linfáticos mediante cirugía ofrece una oportunidad única para seguir una respuesta inmune o la expansión de células inmunes en el mismo ratón a través del tiempo. Además, esta técnica produce entre 1-2x10 6 células por ganglio linfático que es suficiente para PErform caracterización fenotípica y / o ensayos funcionales. La cirugía secuencial de los ganglios linfáticos o linfadenectomía ha sido utilizado con éxito por nosotros y otros 5-11. Aquí se describe cómo los nódulos linfáticos inguinales braquial y se puede quitar haciendo una pequeña incisión en la piel de un ratón anestesiados. Dado que la cirugía es superficial y se hace rápidamente, el ratón se recupera muy rápidamente, cura bien y no experimenta dolor excesivo. Cada segundo día, es posible cosechar uno o dos ganglios linfáticos permitiendo experimentos de tiempo. Esta técnica es por tanto adecuado para estudiar las características de los ganglios linfáticos de linfocitos que residen en el tiempo. Este enfoque es adecuado para diferentes diseños experimentales y creemos que muchos laboratorios se beneficiarán de la realización de cirugías secuenciales de los ganglios linfáticos.

Para seguir la progresión de una respuesta inmune con el tiempo dentro del mismo ratón, los ganglios linfáticos se pueden extirpar mediante cirugía secuencial. Aquí se describe cómo esta técnica se puede realizar.

Murino linfáticos superficiales Cirugía de los ganglios

En el campo de la inmunología, para comprender la progresión de una respuesta inmunitaria frente a una vacuna, una infección o un tumor, la respuesta es a menudo...

El objetivo general de este procedimiento es extirpar quirúrgicamente los ganglios linfáticos de un ratón anestesiado. Esto se logra primero localizando los ganglios linfáticos. Luego se recolectan los ganglios linfáticos y a continuación se cierra la incisión.Finalmente, se puede obtener una suspensión de células individuales para el análisis experimental. En última instancia, las poblaciones viables de linfocitos pueden evaluarse mediante citometría de flujo. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que es necesario observar la localización y la extracción del ganglio linfático para poder dominarlas.Después de anestesiar al ratón, aplique pomada ocular, inyecte buprenorfina y confirme la sedación mediante el pellizco del dedo del pie, luego gire al ratón sobre su costado. Primero, localice el ganglio linfático braquial y luego afeite la región que será diseccionada. Después de retirar cualquier pelo suelto, aplique un desinfectante a la zona y luego realice una pequeña incisión de aproximadamente cinco milímetros en la espalda de las cuatro patas.Utilice dos pares de fórceps para estirar la incisión hasta que se visualice el ganglio linfático braquial, que puede presentar un aspecto grisáceo o más oscuro que la grasa circundante. A continuación, pinche la fascia que cubre el ganglio linfático con un par de fórceps. Coloque el segundo par de fórceps lo más debajo posible del ganglio linfático y tire suavemente de la membrana sin romper el tejido circundante.Luego, utilice el primer par de pinzas para romper la fascia y extraer el ganglio linfático. Si el ganglio linfático se ha obtenido con éxito, aparecerá una mancha de sangre en el lugar donde anteriormente se ubicaba el ganglio. Coloque el ganglio linfático extirpado en una solución isotónica; si se hunde, esto confirmará que el tejido obtenido es un ganglio linfático y no grasa.A continuación, verifique que no haya pelos en la herida y cierre la incisión uniendo las dos caras internas de la piel y sujetándolas con uno o dos clips, según el tamaño de la incisión. Ahora localice un ganglio linfático inguinal y afeite la región que será disecada. Después de eliminar cualquier pelo suelto con un cepillo, aplique un desinfectante en la zona y luego realice una pequeña incisión de aproximadamente cinco milímetros por encima de la pata trasera cerca del abdomen.Después de abrir la incisión con dos pares de fórceps como se acaba de mostrar para el nódulo linfático braquial, identifique el nódulo linfático inguinal alojado dentro del tejido adiposo circundante. Luego, retire el nódulo linfático con los dos pares de fórceps tal como se demostró anteriormente. Nuevamente, confirme la recolección exitosa del nódulo linfático observando la mancha de sangre que aparece en el lugar donde anteriormente se ubicaba el nódulo linfático, y a continuación coloque el nódulo linfático inguinal en un recipiente separado con solución isotónica.Después de haber extraído todos los ganglios linfáticos, coloque el ratón en una jaula y agregue alimento húmedo para que pueda alimentarse fácilmente. Aproximadamente entre seis y ocho horas después de la cirugía, revise al ratón para asegurarse de que no esté experimentando dolor. Observe cuidadosamente que la postura, la marcha, la interacción con los congéneres y el aspecto del pelaje sean similares a los de un ratón sano normal.Finalmente, disocie el ganglio linfático presionándolo contra portaobjetos esmerilados en una placa de Petri y luego transfiera el tejido a un tubo para obtener una suspensión de células individuales. Después de teñir las células con los anticuerpos contra los antígenos de superficie celular de interés, analice las células mediante citometría de flujo. Aquí se muestran gráficos de dispersión de dispersión hacia adelante y lateral para ganglios linfáticos obtenidos de animales anestesiados o sacrificados.Los perfiles y porcentajes de células en las puertas de linfocitos viables de los dos diagramas de dispersión son idénticos. Esto demuestra que la cirugía de ganglios linfáticos es una técnica adecuada para obtener células. Una vez dominada, la cirugía de ganglios linfáticos puede realizarse en cinco a diez minutos por ratón si se lleva a cabo correctamente.

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Investigación

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Una técnica para la realización de microscopía intravital del ganglio linfático inguinal (LN) se describe. Dicha técnica permite en tiempo...

Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

Este video muestra el procedimiento de aislamiento quirúrgico del ganglio linfático de drenaje inguinal de un modelo de ratón. La incisión de la región abdominal proporciona acceso al ganglio linfático inguinal, que se extrae quirúrgicamente. El ganglio linfático inguinal translúcido recolectado se puede utilizar para estudios inmunológicos.

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A continuación, describimos una técnica laparoscópica mínimamente invasivo para el muestreo de serie del hígado y los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) en macacos que permite una mayor frecuencia de muestreo, y reduce el potencial de complicaciones quirúrgicas en comparación con la realización de una laparotomía.

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Este modelo animal permite a los investigadores inducir linfedema secundario estadísticamente significativo en la extremidad posterior de los ratones, que dura al menos 8 semanas. El modelo se puede utilizar para estudiar la fisiopatología del linfedema e investigar nuevas opciones de tratamiento.

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Se presenta un protocolo para bloquear el flujo linfático mediante la sutura quirúrgica de los vasos linfáticos aferentes.

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El linfedema es la hinchazón de las extremidades causada por una disfunción linfática. Describimos un modelo de cola murina crónica de linfedema y el uso novedoso de la tecnología de nanotransfección tisular (TNT) para la entrega de carga genética a la cola.

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Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía renal bilateral murina segura y bien tolerada.

Linfodenectomía renal bilateral murina

Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía mesentérica murina segura y bien tolerada en cada una de las cuatro estaciones a lo largo de la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos. Este procedimiento es adaptable para permitir la interrupción selectiva de la comunicación linfática con el colon distal, el colon proximal y/o el intestino delgado.

Linfodenectomía mesentérica murina por alteración selectiva de la comunicación linfática con el intestino específico de la región

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