Name: Los ensayos de crecimiento para evaluar la toxicidad de poliglutaminas en la levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a evaluar la toxicidad de proteínas con expansión de poliglutamina en Saccharomyces cerevisiae mediante ensayos de crecimiento en placa, spotting y cultivo líquido. Estos métodos cuantitativos permiten estudiar mecanismos de toxicidad proteica.

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Trabajo en el laboratorio se Duennwald apoyado por becas de la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento (AFAR), la Fundación de Enfermedades Hereditarias (HDF) y la Fundación William Wood.

1. Expresión de Tóxicos de expansión polyQ-proteínas en la levadura Un análisis sistemático ha establecido la secuencia precisa de aminoácidos de una proteína polyQ-expansión que se requiere para producir toxicidad en la levadura 7. Este tóxico polyQ-expansión proteína contiene un amino-terminal-FLAG etiqueta seguido por 17 aminoácidos de la secuencia original de la proteína huntingtina, una región polyQ, y una fusión carboxi-terminal a una proteína fluorescente (GFP o bien PPC, véase la Figura 1 a). La expresión de las proteínas con las expansiones polyQ de 46 glutaminas o más (por ejemplo, 72 y 103 glutaminas) produce toxicidad en la levadura cuando se expresa bajo el control de la inducible y relativa fuerte promotor GAL1 7, 9. Como se describió anteriormente, la toxicidad polyQ en la levadura es sólo aparente en las células que llevan el Rnq1p proteína prión en su conformación, [RNQ +], por ejemplo, la cepa de levadura W303 9. El tóxico polyQ expansión de proteínas recapitulates aspectos centrales de la polyQ-biología en la levadura, tales como polyQ duración que dependen de la toxicidad (ver abajo) y la agregación (Figura 1 B). En particular, tóxicos expansión polyQ proteínas no matan a las células de levadura de inmediato, sino que más bien poner en peligro o detener el ciclo celular y devision celular, por lo tanto disminuir o inhibir el crecimiento de colonias de levaduras en las placas o cultivos líquidos (nuestros datos no publicados). 2. Posibles problemas con las células de levadura que expresan tóxicos de expansión polyQ proteínas Las células de levadura que expresan las proteínas polyQ otra tóxicos de expansión pueden no mostrar ningún defecto de crecimiento 9. La naturaleza genética de estos supresores de polyQ-toxicidad no parece estar basado en simples mutaciones mendelianas y por lo tanto puede ocurrir con una frecuencia relativamente alta (nuestros resultados no publicados). Los autores especulan que estos supresores espontáneos son causados ​​por el endurecimiento de los priones no identificadas que funcionan de manera similar a [RNQ +] en la determinación de toxicity.Thes polyQe supresores espontáneos polyQ de toxicidad puede poner en peligro el éxito de cualquier experimento que tiene como objetivo caracterizar la toxicidad polyQ o para identificar y caracterizar los modificadores de la toxicidad polyQ. Con el fin de evitar la ocurrencia frecuente de estos supresores espontáneas, seguir las medidas de precaución se describen a continuación, que han demostrado ser muy eficaz: <ol><li> Usar células frescas de levadura para los experimentos de toxicidad. No almacenar levadura durante períodos prolongados de tiempo. Frecuentemente recuperar las colonias de levadura fresca de material congelado. </li><li> Frecuentemente controlar la expresión y la agregación de expansión tóxicos polyQ-proteínas por microscopía de fluorescencia. </li><li> Mantener las células de levadura en los medios que reprimen la expresión de la toxicidad tóxico polyQ en todo momento (es decir, en medios selectivos que contienen glucosa como única fuente de carbono) antes de iniciar cualquier medición de toxicidad. </li><li> Use al menos tres transformantes independientes para cada experimento polyQ toxicidad. &lt;/ Li&gt; </li></ol> 3. Los ensayos de crecimiento <ol><li> Para cada condición experimental, inocular una colonia de cada tres transformantes independientes de células de levadura que albergan el tóxico polyQ-expansión de proteínas en 3 ml de medio de levadura selectivos con glucosa como única fuente de carbono. </li><li> Incubar estas culturas durante la noche a 30 ° C. Bajo estas condiciones, las células no se expresa la proteína polyQ-expansión debido a que la glucosa en el medio reprime su expresión. No deje que estos crecen en exceso las culturas; mantener el OD 600 (de absorción de luz de longitud de onda de 600 nm) de los cultivos de una noche por debajo de 1. </li><li> Habitualmente usamos tres ensayos diferentes para controlar los defectos de crecimiento de las células de levadura que expresan el tóxico polyQ expansión de proteínas: </li></ol> 3,1 Crecimiento en placas <ol><li> Diluir los cultivos de levaduras durante la noche (cultivados con agitación 220 rpm) hasta una DO 600 de 0.0005 (es decir, una dilución 1:1000 de un OD 600 = 0,5 la cultura) en selectiva mídia 7 de glucosa que contiene. </li><li> Repartir uniformemente 50 l (que resulta en ca. 700 colonias por placa) de cada cultivo diluido en una placa (10 cm de diámetro) con medio selectivo que contiene glucosa como única fuente de carbono y una placa con medio selectivo que contiene galactosa como única fuente de carbono. </li><li> Incubar las placas durante tres o cuatro días a 30 ° C. Después de la incubación, tomar fotografías de cada placa y contar el número de colonias en la glucosa y el número de colonias en las placas de galactosa. Bajo condiciones ideales, no debe haber ninguna o sólo muy pocas colonias en la placa de galactosa utilizando las células de levadura que expresa un altamente tóxico polyQ-expansión proteína (103 octodecies, la Figura 2a). </li></ol> 3.2 Los ensayos Spotting Este ensayo es más cuantitativa que el ensayo de placas se ha descrito anteriormente y por lo tanto puede revelar incluso las diferencias sutiles en la toxicidad polyQ con el mismo experimento en la misma placa. <ol><li> Diluir el Overnculturas ight crecer en medio con glucosa a una DO 600 de 0,1. </li><li> Pipetear 200 l de estas culturas estériles diluidas en placas de 96 pocillos y preparar cinco diluciones en serie cinco veces en agua estéril utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Usando un Frogger, (también llamado un observador, con 8 x 6 pines para la transferencia de las suspensiones celulares) transferir las suspensiones de células sobre placas que contienen medios selectivos con glucosa como única fuente de carbono y placas que contienen medios selectivos con galactosa como única fuente de carbono. </li><li> Dejar que las placas se seque antes de su incubación a 30 ° C durante tres a cuatro días. </li><li> Después de la incubación, tome fotografías de cada plato (Figura 2b). </li></ol> 3,3. Seguimiento de la toxicidad polyQ en la levadura por el crecimiento de cultivos líquidos Este protocolo es el más cuantitativo (OD 600 números) de los tres ensayos descritos aquí y puede incluso detectar diferencias muy sutiles en la toxicidad polyQ. Lo anterior ocCurrence de supresores de espontáneos, sin embargo, lo que potencialmente puede producir resultados engañosos. Por lo tanto, recomendamos que la combinación de este ensayo con al menos uno de los dos ensayos de galvanoplastia descritos anteriormente. Se propone utilizar el instrumento BioscreenC para estos experimentos. El BioscreenC es un instrumento que mide automáticamente la densidad óptica de cultivos de levadura en 100-placas mientras se incuba a temperaturas definidas con agitación definido. Otros métodos para el cultivo de células de levadura y la medición de su densidad óptica también se pueden aplicar. <ol><li> Lavar las células de levadura de medio mínimo que contienen glucosa como única fuente de carbono tres veces en 3 ml de agua estéril. </li><li> Diluir los cultivos de una noche que crecen en medio con galactosa a un OD 600 de 0,1. </li><li> Llenar cada pocillo de la placa 100-BioscreenC bien con 300 l de los cultivos de levaduras. </li><li> Abra el programa Easy Experimento Bioscreen. Determinar el número de muestras que desea monitorear (incluyendo espacios en blanco y único medio-controles), ajustar la temperatura a 30 ° C, fijar la duración de los experimentos de 3 días, establezca los intervalos de medición de 15 minutos, configurar el filtro para 600 nm / Brown, y establecer el modo de agitación a 15 segundos antes de cada medición en el de tipo medio. </li><li> El instrumento BioscreenC y el software adjunto, va a producir hojas de cálculo Excel de cada punto de datos tomados durante el experimento. </li><li> Preparar las curvas de crecimiento con Excel para cada muestra y comparar el crecimiento de diferentes muestras (Figura 2c). Una descripción detallada del análisis de los datos producidos por los experimentos BioscreenC se ha proporcionado antes 10. </li></ol> 4. Los resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La levadura polyQ modelo. a) Representación esquemática de la expansión tóxica polyQ proteínas. b) La microscopia de fluorescencia que muestra las células de levadura que expresan un corto, no tóxico polyQlas células de proteínas de expansión (25Q, panel izquierdo) y la levadura que expresa una larga, tóxico-polyQ expansión de las proteínas (panel de 103 octodecies, derecha). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Los resultados representativos de los ensayos de crecimiento de células de levadura que expresan expansión polyQ-proteínas. a) Revestimiento de ensayo. Aproximadamente 700 células de levadura se extendió en placas y se incuba durante tres días a 30 ° C. El panel superior muestra una placa que contiene medio de glucosa, es decir, la expresión de la tóxico-polyQ expansión proteína (103 octodecies) no es inducida. El panel inferior muestra una placa de levadura que contiene el medio galactosa, es decir, la expresión de la tóxico-polyQ expansión proteína es inducida. Nótese que en el experimento mostrado aquí, no se produjo supresor espontánea. B) Manchado ensayo. Cinco serie de cinco diluciones de células de levadura albergar ya sea una proteína no tóxica polyQ (25Q) o un tóxico Protei polyQ-expansiónn (103 octodecies) fueron detectados en las placas de glucosa que reprimen la expresión de las proteínas (panel izquierdo) o en placas de galactosa que inducen su expresión. Las placas se incubaron entonces durante tres días a 30 ° C. c) experimento BioscreenC. El crecimiento de cultivos de células de levadura que expresan bien una proteína no tóxica polyQ (25Q) o un tóxico polyQ-expansión proteína (103 octodecies) fueron controlados por el instrumento BioscreenC. Las condiciones experimentales y el análisis de los experimentos BioscreenC se describen en el texto principal.

<ol><li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li>
<li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li>
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<li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+bread+to+brains+and+beyond%3A+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li>
<li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+%28-%29-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este manuscrito describe tres enfoques complementarios experimentales destinados a medir polyQ de toxicidad en el organismo modelo la levadura sobre la base de la reducción del crecimiento de células de levadura que expresan tóxicos de expansión polyQ proteínas. Trabajo en la levadura se ofreció reflexiones profundas sobre los mecanismos celulares y moleculares básicos de mal plegamiento de proteínas y su toxicidad resultante, incluyendo el mal plegamiento y la toxicidad de las proteínas de expansión polyQ-9,11,12....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del instrumento </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 pines) </td><td> V &amp; P Científica, en San Diego </td><td> VP 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves EE.UU. </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100 y placas alveolares </td><td> Growthcurves EE.UU. </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

los ensayos de crecimiento para evaluar la toxicidad de poliglutaminas en la levadura

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Mal plegamiento de proteínas se asocia con muchas enfermedades humanas, especialmente enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington 1. La enfermedad de Huntington (HD) es causada por la expansión anormal de una poliglutaminas (polyQ) región dentro de la huntingtina proteína. La proteína huntingtina polyQ expandido alcanza una conformación aberrante (es decir, misfolds) y causa la toxicidad celular 2. Al menos ocho enfermedades neurodegenerativas adicionales son causados ​​por las expansiones polyQ, incluyendo la espinocerebelosa Ataxias y la enfermedad de Kennedy 3. El organismo modelo la levadura ha facilitado una mejor aproximación a las bases celulares y moleculares de polyQ toxicidad, incluyendo el impacto de los factores intra-e inter-molecular de polyQ toxicidad, y la identificación de las vías celulares que se dañan en las células que expresan polyQ expansión proteínas 3-8. Importantemente, muchos aspectos de la polyQ de toxicidad que se encuentran en la levadura se reproduce en otros sistemas experimentales y en cierta medida en las muestras de los pacientes en HD, lo que demuestra la importancia del modelo de levadura para el descubrimiento de los mecanismos básicos que sustentan polyQ toxicidad. Una forma directa y relativamente simple para determinar polyQ de toxicidad en la levadura es la medición de los defectos de crecimiento de las células de levadura que expresan las proteínas polyQ expansión. Este manuscrito describe tres enfoques complementarios experimentales para determinar polyQ-toxicidad en la levadura mediante la medición del crecimiento de células de levadura que expresan expansión polyQ-proteínas. Los dos primeros métodos experimentales monitorear el crecimiento de levaduras en las placas, el tercer enfoque monitorea el crecimiento de cultivos de levaduras líquidas utilizando el instrumento BioscreenC. Por otra parte, este manuscrito se describen las dificultades experimentales que pueden ocurrir cuando el manejo de los modelos de levadura polyQ y describe las estrategias que ayuden a evitar ominimizar estas dificultades. Los protocolos descritos aquí se pueden utilizar para identificar y caracterizar vías genéticas y pequeñas moléculas que modulan polyQ-toxicidad. Por otra parte, los ensayos descritos pueden servir de modelo para análisis precisos de la toxicidad causada por otras enfermedades asociadas a proteínas mal plegadas en los modelos de la levadura.

Este trabajo describe tres protocolos complementarios para evaluar la toxicidad de poliglutaminas (polyQ)-expansión proteínas en la levadura<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Estos protocolos pueden ser fácilmente modificado para controlar la toxicidad de otras proteínas plegadas incorrectamente en la levadura.

Los ensayos de crecimiento para evaluar la toxicidad de poliglutaminas en la levadura

El plegamiento incorrecto de las proteínas está asociado con numerosas enfermedades humanas, especialmente enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la levadura como una plataforma experimental para evaluar y analizar la toxicidad asociada con las proteínas de expansión de poliglutamina. Las proteínas de expansión tras el crecimiento de levadura en condiciones que reprimen la expresión de poliglutamina. Tres ensayos de crecimiento complementarios de células de levadura que expresan una proteína de expansión de poliglutamina tóxica se realizan para evaluar de forma confiable la toxicidad en el primer ensayo de crecimiento demostrado.Aquí, la toxicidad de la poliglutamina se monitorea mediante un ensayo de siembra en placa. Como segundo ensayo de crecimiento complementario, se utiliza un ensayo de microdistribución para detectar incluso diferencias sutiles en el crecimiento celular. El enfoque más cuantitativo se muestra en el tercer ensayo, donde las células de levadura se cultivan en cultivos líquidos y la toxicidad se monitorea mediante la observación de la densidad óptica a 600 nanómetros, obteniéndose finalmente resultados reproducibles y cuantitativos.Ese documento analiza la toxicidad de la poliglutamina en células de levadura mediante un examen cuidadoso de su crecimiento en placas y en cultivos líquidos. Este método puede responder preguntas clave sobre la base de los trastornos por mal plegamiento de proteínas, como descifrar los fundamentos genéticos y celulares de la toxicidad asociada a proteínas mal plegadas, incluidas las proteínas de poliglutamina. Un análisis sistemático ha establecido la secuencia exacta de aminoácidos de una proteína con expansión de poliQ necesaria para producir toxicidad en levaduras.Esta proteína tóxica con expansión poli Q contiene una etiqueta FLAG en el extremo amino seguida de 17 aminoácidos de la secuencia original de la proteína de Huntington, una región poli Q y una fusión en el extremo carboxilo a una proteína fluorescente. Las células de levadura que expresan estas proteínas de expansión poli Q, de otro modo tóxicas, podrían no mostrar ningún defecto de crecimiento debido a supresores espontáneos de la toxicidad poli Q, lo cual puede comprometer el resultado exitoso de cualquier experimento destinado a caracterizar la toxicidad poli Q o sus modificadores. Con el fin de evitar la aparición frecuente de estos supresores espontáneos, asegúrese de tomar medidas preventivas, incluyendo el uso de células de levadura frescas para los experimentos de toxicidad. Evite almacenar la levadura durante períodos prolongados y recupere frecuentemente colonias frescas de levadura a partir de stocks congelados.Monitoree regularmente la expresión y agregación de proteínas tóxicas con expansión de poli Q mediante microscopía fluorescente. Mantenga las células de levadura en un medio que reprima la expresión de las proteínas tóxicas en todo momento. Antes de comenzar cualquier medición de toxicidad.Como medida preventiva final, utilice múltiples transformantes independientes para cada experimento. Para comenzar, los ensayos de crecimiento demostrados en este protocolo obtienen células de levadura que codifican la expresión de las proteínas con expansión de poli Q utilizando tres mililitros de medio selectivo para levadura con glucosa. Como única fuente de carbono, inocule tres cultivos a partir de tres transformantes independientes e incube los cultivos durante la noche a 30 grados Celsius.Bajo estas condiciones, las células no expresan la proteína con expansión poli Q debido a la represión por glucosa. Evite que los cultivos nocturnos sobrepasen el crecimiento óptimo manteniendo la densidad óptica a 600 nanómetros por debajo de uno para monitorear defectos mediante el crecimiento en placas. Primero, realice una dilución de uno a 1000 de un cultivo nocturno de levadura con una DO 600 de 0,5 con medio selectivo que contenga glucosa; distribuya uniformemente 50 microlitros de cada cultivo diluido en una placa con medio selectivo que contenga glucosa como única fuente de carbono, obteniendo aproximadamente 700 colonias por placa para cada cultivo diluido.También siembre en medio selectivo que contenga galactosa como única fuente de carbono. Incube las placas durante tres a cuatro días a 30 grados Celsius tras la incubación. Tome fotografías de cada placa y cuente el número de colonias en las placas con glucosa y galactosa.Bajo condiciones ideales, no debería haber colonias o solo muy pocas colonias en la placa de galactosa al utilizar células de levadura que expresan una proteína altamente tóxica con expansión de poli Q. El ensayo de punteo es más cuantitativo que el ensayo de siembra en placa y, por lo tanto, puede revelar incluso diferencias sutiles en la toxicidad del poli Q. Dentro del mismo experimento y en la misma placa, para iniciar los ensayos de punteo en medio con glucosa, diluya los cultivos nocturnos crecidos hasta una DO 600 de 0,1; pipete 200 microlitros de cada cultivo diluido en placas estériles de 96 pocillos y prepare cinco diluciones seriadas cinco veces en agua estéril utilizando una pipeta multicanal y una transferencia con frogger.Las suspensiones celulares se siembran en placas que contienen medio selectivo con glucosa como única fuente de carbono. Además, se transfieren las células a placas que contienen medio selectivo con galactosa como única fuente de carbono, se dejan secar las placas y luego se incuban a 30 grados Celsius durante tres o cuatro días antes de tomar fotografías de cada placa. El ensayo de crecimiento en medio líquido es el más cuantitativo de los tres ensayos descritos aquí para monitorear la toxicidad de poli Q en levadura.El Bio Screen C es un instrumento que mide automáticamente la densidad óptica de cultivos de levaduras en placas de 100 pocillos mientras se incuban a temperaturas definidas con agitación controlada. Otros métodos para cultivar células de levadura y medir su densidad óptica también pueden utilizarse para iniciar el proceso de centrifugación de las células de levadura que se cultivaron durante la noche en medio mínimo que contiene glucosa como única fuente de carbono. Tras la centrifugación, lave las células con tres mililitros de agua estéril.Repita el lavado dos veces, centrifugando las células entre cada lavado utilizando medio con galactosa. Diluya las células lavadas hasta un OD 600 de 0.1. Luego, llene cada pocillo de la placa bio screen C de 100 pocillos con 300 microlitros de las culturas de levadura diluidas e inserte la placa en el instrumento.Abra el programa de experimento de la pantalla easy bio. Determine el número de muestras a monitorear. Establezca la temperatura a 30 grados Celsius.Establezca la duración de los experimentos en tres días y configure los intervalos de medición cada 15 minutos. Asimismo, fije el filtro en 600 nanómetros marrón y active el modo de agitación durante 15 segundos antes de cada medición, con intensidad media. Tras configurar los parámetros, inicie el experimento.La pantalla de bioensayo, el instrumento observado y el software adjunto generarán hojas de cálculo de Excel con cada punto de datos obtenido durante el experimento. Mediante Excel se pueden preparar curvas de crecimiento para cada muestra y comparar el crecimiento de diferentes muestras. Aquí se muestran los resultados del ensayo de siembra en placa.Se distribuyeron aproximadamente 700 células de levadura en placas y se incubaron durante tres días a 30 grados Celsius en placas que contenían medio con glucosa. La expresión de la proteína tóxica con expansión de poli Q no se induce. Por el contrario, cuando las células de levadura se sembraron en medio con galactosa, se induce la expresión de la proteína tóxica con expansión de poli Q.Téngase en cuenta que en el experimento mostrado aquí, no se produjo supresión espontánea. De manera similar, en el ensayo de colonias, la expresión de la proteína tóxica con expansión de poli Q se observa en galactosa y no en glucosa. Medio cinco, dilución seriada quíntuple de células de levadura que portan ya sea una proteína de poli Q no tóxica o una proteína de expansión de poli Q tóxica, sembradas en placas con glucosa que reprime la expresión de las proteínas o en placas con galactosa que induce su expresión en el experimento del cribado biológico C.El crecimiento de cultivos de células de levadura que expresan ya sea una proteína poly Q no tóxica o una proteína de expansión poly Q tóxica fue monitoreado mediante el instrumento Bio Screen C, tal como se describe en este video. Aquí se observa claramente el efecto de la expresión de la proteína de expansión poly Q tóxica sobre el crecimiento celular. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo monitorear la toxicidad de las proteínas de poliglutamina en levadura. El ensayo de crecimiento en medio líquido es el más cuantitativo de los tres ensayos, ya que puede incluso detectar diferencias sutiles en la toxicidad de la poliglutamina.Pero recuerde combinarlo con al menos uno de los dos ensayos de plaqueo para evitar problemas con supresores espontáneos de la toxicidad del poliglutamina.

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En este video, describimos un método para evaluar el efecto neuroprotector de un compuesto de prueba, el astragalán, sobre la supervivencia neuronal en Caenorhabditis elegans de la neurotoxicidad mediada por poliQ. El ensayo utiliza Caenorhabditis elegans que expresan las repeticiones de polyQ anormalmente expandidas fusionadas con GFP en sus neuronas ASH para medir la supervivencia neuronal después del tratamiento con compuestos de prueba.

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Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo describe una metodología de alto rendimiento para funcionalmente basados en proteína herencia en S. cerevisiae.

Proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en S. cerevisiae

Este artículo presenta un método basado en el acoplamiento para facilitar la detección de sobreexpresión en levadura de florecimiento utilizando una biblioteca de plásmidos vestida.

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Este artículo describe los protocolos para evaluar el efecto de proteínas fluorescentes en la agregación y toxicidad del polyglutamine mal plegadas ampliación para la evaluación rápida de una proteína fluorescente recién desacostumbrada en el contexto de reporteros fluorescentes.

Efecto de proteínas fluorescentes de fusión socios en ensayos de toxicidad de poliglutaminas de levadura

Aquí se presentan cuatro protocolos para construir y explotar cepas de reporteros de Saccharomyces cerevisiae para estudiar el potencial de transactivación P53 humano, los impactos de sus diversas mutaciones asociadas al cáncer, las proteínas interexpresas que interactúan y las proteínas interexpresas que interactúan, y los efectos de moléculas pequeñas específicas.

Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos

Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.

Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar las actividades neuroprotectoras de los compuestos de prueba en Caenorhabditis elegans, incluida la agregación de poliglutamina, la muerte neuronal y el comportamiento de quimioavoidencia, así como una integración ejemplar de múltiples fenotipos.

Caenorhabditis elegans como sistema modelo para descubrir compuestos bioactivos contra la neurotoxicidad mediada por poliglutamina

Se requiere un modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína para estudiar y comprender la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Describimos un método para monitorear la citotoxicidad y la formación agregada de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizada.

Un método para estudiar la toxicidad y agregación de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizado

Aprenda a evaluar la toxicidad de proteínas con expansión de poliglutamina en Saccharomyces cerevisiae mediante ensayos de crecimiento en placa, spotting y cultivo líquido. Estos métodos cuantitativos permiten estudiar mecanismos de toxicidad proteica.

Los ensayos de crecimiento para evaluar la toxicidad de poliglutaminas en la levadura

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