Propagación y detección de un clon infeccioso molecular de Maedi-Visna virus que expresa la proteína fluorescente verde

El objetivo general de este procedimiento es propagar y detectar un clon infeccioso de Mildy frente a sin virus que expresa la proteína verde fluorescente. Esta proteína verde fluorescente ha sido clonada en el gen de la cápside para la D utp Ace en el genoma del virus Myy Ner.

El clon infeccioso está contenido en dos plásmidos. Primero, los dos plásmidos que portan las secuencias myy Ner se cortan con la enzima de restricción xpa uno y se ligaron. Segundo, las células del plexo coroides de oveja se transfectan con el constructo.

Finalmente, las células infectadas con el virus myy vino se detectan mediante microscopía fluorescente y citometría de flujo. Hola, soy Stefano Neron del Instituto TER de Patología Experimental de la Universidad de Islandia. Hoy les mostraremos un procedimiento para propagar y detectar un clon molecular infeccioso del virus mi vascular que expresa la proteína verde fluorescente.

El clon molecular está contenido en los plásmidos P ocho XSP cinco EGFP y P sesenta y siete o de 12 kilobases y 4,5 kilobases, respectivamente. Corte cantidades equimolares de los dos plásmidos, específicamente 4,4 microgramos de P ocho XSP cinco EGFP y 1,6 microgramos de P sesenta y siete o con XPA uno y ligue antes de la transfección. Cuando la ligación haya finalizado, incube la mezcla de ligación a 65 grados Celsius durante 15 minutos. Dos días antes de la transfección, siembre 10 a la seis células SCP en un frasco de cultivo tisular T 25 y cultive las células durante dos días en cinco mililitros de DMEM más 10% de suero de cordero y dos milimolar de glutamina, sin antibióticos, hasta alcanzar una confluencia del 90% en monocapa.

Si las células no han alcanzado el 90 %CO después de dos días, deje que las células crezcan un día adicional. El suero de cordero puede sustituirse por suero bovino fetal FBS. Utilizamos habitualmente suero de cordero porque algunos cepas de MVV son inhibidas por el FBS.

Esta cepa de MVV, sin embargo, no es inhibida por el suero bovino fetal (FBS). Cuando las células estén listas para la transfección, cambie el medio a DMEM con 1% de suero de cordero o suero bovino fetal sin antibióticos. Utilizamos Lipofectamina 2000 para la transfección; diluya el ADN en 500 microlitros de medio ópti-MEM, diluya 20 microlitros de lipofectamina 2000 en 500 microlitros de medio ópti-MEM y deje reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Después de la incubación de cinco minutos, combine el ADN diluido con lipofectamina 2000 hasta un volumen total de 1000 microlitros. Mezcle suavemente e incube durante 2230 minutos. A temperatura ambiente, agregue la mezcla de transfección al frasco T 25 que contiene las células SCP y el medio, mezclando moviendo suavemente de un lado a otro.

Incubar durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, cambiar el medio a DMEM con 1 % de suero, dos milimolar de glutamina, 100 UI por mililitro de penicilina y 100 UI por mililitro de estreptomicina. Monitorear la producción de GFP y las células SCP mediante microscopía fluorescente invertida.

Se puede esperar una baja eficiencia de transfección con estas células primarias, generalmente entre el cinco y el 15%. Incubar adicionalmente a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante varios días para permitir la diseminación del virus en el frasco. Por lo general, se necesitan entre siete y 14 días para lograr la infección completa. Recoger el virus mediante Ali, transfiriendo el sobrenadante a tubos einor.

Centrifugar en un microcentrífugo a 3000 × g durante cinco minutos para eliminar los restos celulares. Transferir el sobrenadante que contiene el virus a nuevos tubos.

Almacene a menos 80 grados Celsius semilla tres veces 10 a la cuatro células SCP. En 100 microlitros de medio DMEM suplementado con 10% de suero, glutamina dos milimolar, 100 UI por mililitro de penicilina y 100 UI por mililitro de estreptomicina por pocillo.

En una placa de 96 pocillos, incubar a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono. Si las células están confluentes al día siguiente, cambiar el medio a DMEM con 1% de suero. Teniendo 100 microlitros en cada pocillo, diluir el virus de la siguiente manera.

Añada 180 microlitros de DMEM con 1 % de suero por pocillo a cuatro veces 10 pocillos en una placa de 96 pocillos de fondo redondo o fondo en V para realizar una dilución seriada diez veces en cuádruple duplicado. Añada 20 microlitros de virus a cada uno de los cuatro pocillos de la primera columna de la placa. Y utilizando una pipeta de cuatro canales, aspire y expulse arriba y abajo para asegurar que las muestras se mezclen completamente.

Cambie los puntas de pipeta y transfiera 20 microlitros a los siguientes cuatro pozos, y así sucesivamente. Deje los últimos pozos sin virus como control negativo. Añada 100 microlitros de la dilución del virus a las células SEP y al incubador con medio.

37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Observe la fluorescencia GFP y los efectos citopáticos durante dos semanas. Los efectos citopáticos consisten en que las células se vuelven redondeadas y menos transparentes que las células normales, con prolongaciones que se extienden, terminando con la aparición de células multinucleadas y la muerte celular.

Calcule la titulación del virus utilizando el método de Reed-Muench para el monitoreo rápido de la replicación del virus. Las células infectadas pueden examinarse mediante citometría de flujo con tripsina. Ojos alrededor de 10 a las cinco células infectadas.

Lave una vez con PBS y RESSUSPENDA en 500 microlitros. PBS agregue 500 microlitros de solución de paraformaldehído al 4%, obteniendo una concentración final del 2%, e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Pelice las células a 3000 ×g o PMM durante cinco minutos.

Lave con PBS dos veces durante cinco minutos y analice en un analizador de citometría. Cuente 10.000 eventos. El clon molecular que expresa GFP de mi virus presentado aquí puede ser útil para analizar las interacciones entre el virus y el huésped, así como la patogenicidad de mi neurovirus, tanto in vivo como in vitro.

Aunque no se ha demostrado que mi neurovirus pueda afectar células humanas, es importante observar todas las precauciones de nivel de bioseguridad; tanto las células como el plásmido pueden obtenerse de nuestro laboratorio. Buena suerte con sus experimentos.