Name: Propagación y detección de un clon infeccioso molecular de Maedi-Visna virus que expresa la proteína fluorescente verde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprende a propagar y detectar un clon infeccioso del virus Maedi-Visna que expresa GFP en células de plexo coroideo de oveja. Este método permite monitorear la replicación viral mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo para estudios de virología.

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Este trabajo fue financiado por el Fondo de Investigación de Islandia y la Universidad de Islandia Fondo de Investigación.

1. Transfección El clon molecular está contenida en dos plásmidos, p8XSp5-EGFP y p67r, de 12 kb y 4,5 kb, respectivamente, 9,10. <ol><li> Corte cantidades equimolares de los dos plásmidos, es decir, 4,4 g de p8XSp5-EGFP y 1,6 g de p67r con XbaI y ligar antes de la transfección. </li><li> Para la ligadura, utilice una unidad de Weiss de la ligasa en una reacción de 50 l, y se incuba a 16 ° C durante la noche. </li><li> Cuando la ligadura se haya completado, se incuba la mezcla de ligación a 65 ° C durante 15 minutos para la inactivación de la ligasa. Este paso puede ser omitido. </li><li> Dos días antes de la transfección, las semillas de 10 6 células SCP en un frasco de tejido T25 cultura, y hacer crecer las células durante dos días en 5 ml de DMEM + 10% de suero de cordero y glutamina 2 mM, sin antibióticos para una monocapa de 90% de confluencia. Si las células no han alcanzado el 90% de confluencia de dos días, dejar que las células crezcan un día más. </li></ol> Nota: El suero de cordero puede ser sustituido por suero fetal bovino (FBS). Nosotros usamos cordero suero, ya que algunas cepas de MVV son inhibidas por el FBS; esta cepa MVV no es inhibida por el FBS, sin embargo. <ol start="5"><li> Cuando las células están listas para la transfección, el cambio medio DMEM con 1% de suero (suero o cordero FBS) sin antibióticos. Usamos Lipofectamin 2000 (Invitrogen) para la transfección. </li><li> Diluir el ADN de 500μl Opti-MEM medio. </li><li> Diluir 20μl Lipofectamin 2000 en 500μl Opti-MEM medio y dejar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. </li><li> Después de la incubación de 5 minutos, mezcle el ADN diluido con Lipofectamine diluida 2000 (volumen total = 1000 l). Mezclar suavemente e incubar durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir la mezcla de transfección (1 ml) al matraz que contiene las células T25 SCP y medio (5 ml). Mezclar por meciéndose suavemente. </li><li> Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la noche (18 a 24 h). </li><li> Cambio medio del día siguiente a DMEM con suero al 1%, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina 100IU 100IU. </li><li> Controlar la producción de GFP en las células SCP por microscopía de fluorescencia invertido. Baja eficiencia de transfección se puede esperar que con estas pilas, por lo general 5 a 15%. </li><li> Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante varios días para permitir la propagación del virus en el frasco. Por lo general, toma 7-14 días para la infección por completo. </li><li> Recoger el virus de alícuotas del sobrenadante en tubos Eppendorf. Girar en una microcentrífuga a 3000 rpm durante 5 min para eliminar restos celulares. Transferir el sobrenadante que contiene el virus de nuevos tubos. Almacenar a -80 ° C. </li></ol> 2. La titulación del virus <ol><li> Semillas de 3x10 4 células SCP en 100 l medio DMEM suplementado con suero al 10%, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml, por tanto en una placa de 96 pocillos. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Si las células son confluentes al día siguiente, el cambio medio DMEM con suero al 1%, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml, 100 l en cada pocillo. </li><li> Diluir el virus de la siguiente manera: <ol><li> Añadir 180 l DMEM con suero al 1%, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina 100IU/ml 100IU/ml por pozo de 4 x 10 pozos en un fondo de 96 ronda o la placa de fondo en V. </li><li> Para diluciones seriadas diez veces en cuatro ejemplares, se añaden 20 l de virus a cada uno de 4wells en la primera columna de la placa, y con una pipeta de cuatro canales, pipeta hacia arriba y abajo para asegurarse de que las muestras estén bien mezcladas. Cambie la punta de la pipeta y la transferencia de 20 l para los próximos cuatro pozos y así sucesivamente. Dejar los pozos pasado sin virus durante un control negativo. </li></ol></li><li> Añadir 100 ml de las diluciones del virus a las células SCP y medianas empresas. </li><li> Se incuba a 37 ° C y 5% CO 2. Observar para la fluorescencia de GFP y efectos citopáticos por dos semanas. Efectos citopáticos están formadas por células redondeadas y cada vez menos transparentes que las células normales con los procesos de estirar, para terminar con células multinucleadas que aparecen y la muerte celular. </li><li> Calcular el virus de título (TCID50) utilizando el método de Reed Muench 11. </li></ol> 3. FACS análisis de las células infectadas Nota: Para el control rápido de la replicación del virus, las células infectadas pueden ser examinados por citometría de flujo. <ol><li> Trypsinize las células infectadas (aproximadamente 10 5), lavar con PBS 1x y se resuspenden en 500μl PBS. </li><li> Añadir 500 l solución de paraformaldehído al 4% (2% de concentración final), se incuban a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Pellet células en una microcentrífuga a 3000 rpm durante 5 min. </li><li> Lavar con PBS 2x5 min y analizar en un analizador FACScan. Contar con 10.000 eventos. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Este virus debe ser plenamente infecciosas y replicar a un título de 06 10 hasta 7 10 DICT 50 / ml. Las células infectadas son fluorescentes y se puede deteja por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Por lo general, las buenas prácticas agrarias pueden ser detectados en más del 60% de las células en los cultivos de células infectadas mediante citometría de flujo (Fig. 1). Del mismo modo, cuando se visualizan por microscopía de fluorescencia, la mayoría de las células son fluorescentes (Fig. 2A y B). <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. FACScan análisis de las células infectadas con el KV1772 SCP-EGFP virus después de 7 días de la infección. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fase de microscopía de contraste de las células infectadas con el KV1772 SCP-EGFP después de 7 días de incubación (A). Las mismas células visualizado por microscopía de fluorescencia (B).

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La GFP expresar clon molecular de MVV que aquí se presenta debe ser útil para el análisis de las interacciones de la célula huésped y la patogenicidad de MVV tanto in vitro como in vivo. El virus obtenido después de 7-14 días de la replicación, sin duda, ha adquirido algunas mutaciones debido a la inexactitud de la transcriptasa inversa. Sin embargo, hay limitaciones en el uso de este clon como un vector de ciclo único. Una de ellas es que el uso de la clonación se limita a las células de ovejas y cabras de origen. La e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

propagación y detección de un clon infeccioso molecular de maedi-visna virus que expresa la proteína fluorescente verde

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna virus (MVV) es un lentivirus de ovejas, causando neumonía intersticial lentamente progresiva y encefalitis 1. Las células diana principal de MVV in vivo son considerados como una de las 2 linaje monocitos. Ciertas cepas de MVV puede replicar en otros tipos celulares, sin embargo, 3,4. La proteína verde fluorescente es un indicador comúnmente utilizado para el estudio de los lentivirus en las células vivas. Hemos insertado el gen EGFP en el gen de la dUTPase de MVV. El gen dUTPase está bien conservada en la mayoría de las cepas de lentivirus de ovejas y cabras y se ha demostrado que es importante en la replicación de CAEV 5. Sin embargo, dUTPase ha demostrado ser prescindible para la replicación del clon molecular de MVV utilizado en este estudio, tanto in vitro como in vivo 6. Replicación de MVV se limita estrictamente a las células de oveja o de cabra de origen. Nosotros usamos una línea celular primaria del plexo coroideo de oveja (células SCP) para la transfección y la propagación del virus de la 7. La MVV fluorescente es totalmente infecciosa y la expresión EGFP es estable durante al menos seis pasajes 8. Existe una buena correlación entre las mediciones de DICT 50 y EGFP. Este virus por lo tanto, debe ser útil para la detección rápida de las células infectadas en los estudios de patogenicidad y tropismo celular in vitro e in vivo 8.

Se describe un clon molecular del virus Maedi-visna que expresa GFP y es totalmente contagioso. La replicación de este virus puede ser detectado mediante el uso de microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.

Propagación y detección de un clon infeccioso molecular de Maedi-Visna virus que expresa la proteína fluorescente verde

El virus Maedi-visna (MVV) es un lentivirus de las ovejas que provoca una neumonía intersticial y una encefalitis de progresión lenta1. Las células diana principales del MVV en...

El objetivo general de este procedimiento es propagar y detectar un clon infeccioso de Mildy frente a sin virus que expresa la proteína verde fluorescente. Esta proteína verde fluorescente ha sido clonada en el gen de la cápside para la D utp Ace en el genoma del virus Myy Ner.El clon infeccioso está contenido en dos plásmidos. Primero, los dos plásmidos que portan las secuencias myy Ner se cortan con la enzima de restricción xpa uno y se ligaron. Segundo, las células del plexo coroides de oveja se transfectan con el constructo.Finalmente, las células infectadas con el virus myy vino se detectan mediante microscopía fluorescente y citometría de flujo. Hola, soy Stefano Neron del Instituto TER de Patología Experimental de la Universidad de Islandia. Hoy les mostraremos un procedimiento para propagar y detectar un clon molecular infeccioso del virus mi vascular que expresa la proteína verde fluorescente.El clon molecular está contenido en los plásmidos P ocho XSP cinco EGFP y P sesenta y siete o de 12 kilobases y 4,5 kilobases, respectivamente. Corte cantidades equimolares de los dos plásmidos, específicamente 4,4 microgramos de P ocho XSP cinco EGFP y 1,6 microgramos de P sesenta y siete o con XPA uno y ligue antes de la transfección. Cuando la ligación haya finalizado, incube la mezcla de ligación a 65 grados Celsius durante 15 minutos. Dos días antes de la transfección, siembre 10 a la seis células SCP en un frasco de cultivo tisular T 25 y cultive las células durante dos días en cinco mililitros de DMEM más 10% de suero de cordero y dos milimolar de glutamina, sin antibióticos, hasta alcanzar una confluencia del 90% en monocapa.Si las células no han alcanzado el 90 %CO después de dos días, deje que las células crezcan un día adicional. El suero de cordero puede sustituirse por suero bovino fetal FBS. Utilizamos habitualmente suero de cordero porque algunos cepas de MVV son inhibidas por el FBS.Esta cepa de MVV, sin embargo, no es inhibida por el suero bovino fetal (FBS). Cuando las células estén listas para la transfección, cambie el medio a DMEM con 1% de suero de cordero o suero bovino fetal sin antibióticos. Utilizamos Lipofectamina 2000 para la transfección; diluya el ADN en 500 microlitros de medio ópti-MEM, diluya 20 microlitros de lipofectamina 2000 en 500 microlitros de medio ópti-MEM y deje reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Después de la incubación de cinco minutos, combine el ADN diluido con lipofectamina 2000 hasta un volumen total de 1000 microlitros. Mezcle suavemente e incube durante 2230 minutos. A temperatura ambiente, agregue la mezcla de transfección al frasco T 25 que contiene las células SCP y el medio, mezclando moviendo suavemente de un lado a otro.Incubar durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, cambiar el medio a DMEM con 1 % de suero, dos milimolar de glutamina, 100 UI por mililitro de penicilina y 100 UI por mililitro de estreptomicina. Monitorear la producción de GFP y las células SCP mediante microscopía fluorescente invertida.Se puede esperar una baja eficiencia de transfección con estas células primarias, generalmente entre el cinco y el 15%. Incubar adicionalmente a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante varios días para permitir la diseminación del virus en el frasco. Por lo general, se necesitan entre siete y 14 días para lograr la infección completa. Recoger el virus mediante Ali, transfiriendo el sobrenadante a tubos einor.Centrifugar en un microcentrífugo a 3000 × g durante cinco minutos para eliminar los restos celulares. Transferir el sobrenadante que contiene el virus a nuevos tubos.Almacene a menos 80 grados Celsius semilla tres veces 10 a la cuatro células SCP. En 100 microlitros de medio DMEM suplementado con 10% de suero, glutamina dos milimolar, 100 UI por mililitro de penicilina y 100 UI por mililitro de estreptomicina por pocillo.En una placa de 96 pocillos, incubar a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono. Si las células están confluentes al día siguiente, cambiar el medio a DMEM con 1% de suero. Teniendo 100 microlitros en cada pocillo, diluir el virus de la siguiente manera.Añada 180 microlitros de DMEM con 1 % de suero por pocillo a cuatro veces 10 pocillos en una placa de 96 pocillos de fondo redondo o fondo en V para realizar una dilución seriada diez veces en cuádruple duplicado. Añada 20 microlitros de virus a cada uno de los cuatro pocillos de la primera columna de la placa. Y utilizando una pipeta de cuatro canales, aspire y expulse arriba y abajo para asegurar que las muestras se mezclen completamente.Cambie los puntas de pipeta y transfiera 20 microlitros a los siguientes cuatro pozos, y así sucesivamente. Deje los últimos pozos sin virus como control negativo. Añada 100 microlitros de la dilución del virus a las células SEP y al incubador con medio.37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Observe la fluorescencia GFP y los efectos citopáticos durante dos semanas. Los efectos citopáticos consisten en que las células se vuelven redondeadas y menos transparentes que las células normales, con prolongaciones que se extienden, terminando con la aparición de células multinucleadas y la muerte celular.Calcule la titulación del virus utilizando el método de Reed-Muench para el monitoreo rápido de la replicación del virus. Las células infectadas pueden examinarse mediante citometría de flujo con tripsina. Ojos alrededor de 10 a las cinco células infectadas.Lave una vez con PBS y RESSUSPENDA en 500 microlitros. PBS agregue 500 microlitros de solución de paraformaldehído al 4%, obteniendo una concentración final del 2%, e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Pelice las células a 3000 ×g o PMM durante cinco minutos.Lave con PBS dos veces durante cinco minutos y analice en un analizador de citometría. Cuente 10.000 eventos. El clon molecular que expresa GFP de mi virus presentado aquí puede ser útil para analizar las interacciones entre el virus y el huésped, así como la patogenicidad de mi neurovirus, tanto in vivo como in vitro.Aunque no se ha demostrado que mi neurovirus pueda afectar células humanas, es importante observar todas las precauciones de nivel de bioseguridad; tanto las células como el plásmido pueden obtenerse de nuestro laboratorio. Buena suerte con sus experimentos.

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