Name: Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a realizar inmunotinción de fibras nerviosas sensoriales periféricas en tejidos de piel y hueso de ratón. Este método permite visualizar la expresión proteica mediante microscopía de inmunofluorescencia para estudiar mecanismos sensoriales.

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Agradecemos al Dr. Yuriy M. Usachev por su ayuda en la estandarización inicial de microscopía confocal de imágenes / del ratón plantar inmunotinción de biopsia, y la Dra. Donna L. Hammond, por su ayuda continua y la crítica constructiva en este trabajo. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NINDS / NIH (NS069898), y un desarrollo de la idea de concesión de subvenciones del Departamento de Defensa Programa de Investigación de Cáncer de Próstata (DoD-PCRP-101096) para DPM

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<li>Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+sprouting+and+changes+in+nociceptive+sensory+innervation+in+the+glabrous+skin+of+the+rat+hind+paw+following+partial+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury.</a> The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).</li>
<li>Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepidermal+nerve+fiber+loss+corresponds+to+the+development+of+Taxol-induced+hyperalgesia+and+can+be+prevented+by+treatment+with+minocycline%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline.</a> Pain. 152, 308-313 (2011).</li>
<li>Bloom, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer-Induced+Bone+Remodeling%2C+Skeletal+Pain%2C+and+Sprouting+of+Sensory+Nerve+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers.</a> The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).</li>
<li>Constantin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Tumor+Necrosis+Factor+%CE%B1+%28TNF%CE%B1%29+Requires+TNF+Receptor+Type+2+to+Generate+Heat+Hyperalgesia+in+a+Mouse+Cancer+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model.</a> J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).</li>
<li>Jankowski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+Cutaneous+Nociceptors+after+Nerve+Transection+and+Regeneration%3A+Possible+Role+of+Target-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).</li>
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<li>Persson, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium-calcium+exchanger+and+multiple+sodium+channel+isoforms+in+intra-epidermal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals.</a> Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).</li>
<li>Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+Enterotoxin+B+Causes+Proliferation+of+Sensory+C-Fibers+and+Subsequent+Enhancement+of+Neurogenic+Inflammation+in+Rat+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin.</a> Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).</li>
<li>Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+loss+of+peptidergic+intraepidermal+nerve+fibers+in+an+STZ-induced+mouse+model+of+insensate+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy.</a> Pain. 140, 35-47 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de intereses declarados.

Aquí hemos detallado los métodos para la preparación de la piel del ratón y las secciones de tejido óseo para la inmunotinción y detección de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Las secciones producido a partir de biopsias por punción plantar contienen la piel lampiña y peludo, lo que significa que el protocolo puede ser utilizado en cualquier tipo de piel. Estas técnicas también pueden utilizarse para teñir otros tipos de células en estos tejidos (leucocitos, el endotelio vascular, músculo liso, entre otros)....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo N º </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> 3mm Harris Micro-Punch </td><td> Material </td><td> Ted Pella </td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td> Perfusión de la bomba </td><td> Material </td><td> VWR International </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido pícrico </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> Octubre compuesto incrustación </td><td> Reactivo </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cito-congelación criogénica en aerosol </td><td>Material </td><td> Control de la Compañía </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> De suero de cabra </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Incubación de la bandeja y la tapa de inmunotinción (Grande) </td><td> Material </td><td> RPI Corp. </td><td> 248270 (bandeja) 248270-A (la tapa) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge pluma barrera hidrofóbica </td><td> Material </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Pinceles de pelo de camello (# 1 espesor) </td><td> Material </td><td> Ted Pella </td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Long Oro Medio de montaje </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detección y procesamiento primario de los físicos, químicos y térmicos estímulos sensoriales de las fibras nerviosas sensoriales periféricas es la clave para la percepción sensorial en animales y humanos. Estas fibras nerviosas sensoriales periféricas expresan una gran cantidad de receptores y las proteínas de los canales iónicos que detectan e iniciar los estímulos sensoriales específicos. Se dispone de métodos para caracterizar las propiedades eléctricas de las fibras nerviosas sensoriales periféricas que inervan la piel, que también puede ser utilizado para identificar la expresión funcional de proteínas específicas de canales de iones en estas fibras. Sin embargo, los métodos electrofisiológicos similares no están disponibles (y también son difíciles de desarrollar) para la detección de la expresión funcional de los receptores y las proteínas de los canales iónicos en las fibras nerviosas sensoriales periféricas que inervan otras vísceras, incluidos los tejidos más difíciles, como los huesos. Por otra parte, estos métodos electrofisiológicos no puede ser utilizado para determinar la expresión de la proteína no excitabless en las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Por lo tanto, la inmunotinción de muestras de tejidos periféricos / visceral de horario de oficina nervio sensorial ofrece la mejor manera posible para determinar la expresión de proteínas específicas de interés en estas fibras nerviosas. Hasta ahora, la mayoría de los estudios de expresión de proteínas en las neuronas sensoriales han utilizado los procedimientos de tinción en los ganglios sensoriales, donde se limita la información a la expresión de proteínas específicas en el cuerpo celular de tipos específicos o subconjuntos de neuronas sensoriales. Aquí mostramos los métodos detallados / protocolos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral de la inmunotinción de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. En especial, detalle los métodos para la preparación de la piel o el plantar biopsia en sacabocados y hueso (fémur) secciones de los ratones de la inmunotinción de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Estos métodos no sólo son clave para la determinación cualitativa de la expresión de proteínas en las neuronas sensoriales periféricas, sino que también proporcionan un método de análisis cuantitativo paradeterminar los cambios en los niveles de expresión de proteínas en los tipos o subconjuntos específicos de las fibras sensoriales, así como para determinar los cambios morfológicos y / o anatómicas en el número y la densidad de las fibras sensoriales en varios estados patológicos. Además, estos métodos no se limitan a la coloración de las fibras nerviosas sensoriales sólo, pero también puede ser utilizado para la tinción de los tipos de fibras nerviosas de la piel, los huesos y el tejido visceral otros.

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

La detección y el procesamiento primario de los estímulos sensoriales físicos, químicos y térmicos por parte de las fibras nerviosas sensoriales periféricas son fundamentales para la percepción sensorial en...

El objetivo general de este procedimiento es obtener información sobre la organización anatómica, así como sobre los perfiles de expresión y localización de proteínas específicas en fibras nerviosas periféricas que inervan tejidos como la piel y el hueso. Esto se logra primero mediante la perfusión completa del animal con fijador, seguida de la disección o extracción del tejido de interés. A continuación, los tejidos aislados se someten a una postfijación y los huesos se descalcifican; usando un criostato, se generan secciones finas de tejido óseo y cutáneo que se montan sobre portaobjetos.El paso final del procedimiento consiste en realizar una tinción inmunohistoquímica sencilla o múltiple de estas secciones de tejido con anticuerpos contra proteínas que se expresan y localizan específicamente en las fibras nerviosas periféricas. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el patrón de distribución de tipos específicos de fibras nerviosas periféricas, así como el patrón de expresión y/o localización de proteínas específicas en las fibras nerviosas periféricas mediante microscopía de inmunofluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia epiluminiscente o confocal. Este enfoque puede utilizarse para responder preguntas clave sobre el sistema nervioso periférico, como por ejemplo, ¿cuáles son los patrones de inervación en tejidos como la piel y el hueso?Y este enfoque puede extenderse a órganos viscerales y otros tejidos. También puede informarnos sobre los cambios en la expresión de proteínas dentro de estos subconjuntos de fibras nerviosas sensoriales y las alteraciones que pueden ocurrir en la expresión de estas proteínas durante procesos patológicos o del desarrollo. Coloque un animal que haya sido perfundido con PFA al 4 % sobre una superficie de corte u otra superficie resistente para obtener muestras de tejido del pie trasero.Sujete el pie con la superficie plantar hacia arriba y presione firmemente con una herramienta de biopsia de tres milímetros posicionada en el centro del pie. Gire la herramienta de biopsia hacia adelante y hacia atrás 180 grados para asegurarse de que haya cortado completamente a través de toda la estructura del pie. Retire suavemente la herramienta de biopsia del pie y expulse el tejido en un tubo estéril de dos mililitros que contenga un mililitro de solución de PFA al 4% o de solución de PA al 5%, o en este caso, para recolectar muestras de hueso de la extremidad, del fémur.Realice una incisión lateral a lo largo de la espalda del animal a la altura de la pelvis que continúe hacia abajo por ambas extremidades posteriores. Corte la pelvis y los músculos circundantes para separar el fémur de la pelvis, dejando intacta la cabeza proximal del fémur. A continuación, corte la tibia o la fibula para dejar intacta la cabeza distal y elimine los músculos circundantes y el periostio del eje óseo.Coloque el fémur en un tubo de dos mililitros que contenga un mililitro de solución de PFA al 4% o de PA al 5%, y luego permita que ambas muestras se postfijen con mezcla suave en un agitador durante 16 a 18 horas a cuatro grados Celsius. Después de la postfijación, descalcifique ambas muestras transfiriéndolas a tubos estériles de dos mililitros que contengan 1,5 mililitros de solución descalcificante. Permita que el punch plantar agite suavemente durante 16 a 18 horas a cuatro grados Celsius y el fémur durante seis a siete días.Cambie la solución cada 24 horas y supervise el tejido óseo en busca de pérdida de rigidez con un par de pinzas tras la descalcificación. Transfiera las muestras de tejido a un tubo estéril de dos mililitros con 1,5 mililitros de solución crioprotectora y coloque el tubo nuevamente sobre el agitador durante 16 a 18 horas de mezcla suave a cuatro grados Celsius. Para preparar el tejido para el corte, coloque un volumen de lecho del compuesto de temperatura óptima para corte sobre un bloque de montaje de tejido para criostato y permita que se congele en la cámara del criostato a menos 20 grados Celsius.Rocíe el OCT con un aerosol criogénico para acelerar el proceso de congelación, si se desea. Coloque la muestra de tejido sobre la base de OCT para el tejido de biopsia plantar. Coloque las muestras de manera que se puedan obtener secciones transversales uniformes para el tejido óseo.Coloque el espécimen para obtener secciones longitudinales respecto a la longitud del hueso. Cubra ambos espécimenes con una capa adicional delgada de OCT. Luego, rocíe suavemente con aerosol criogénico hasta que el tejido se congele.Coloque la muestra sobre el cabezal de corte en la cámara del criostato y permita que el bloque de tejido se equilibre a la temperatura de corte durante al menos una hora para evitar cortes quebradizos. Una vez que el tejido haya alcanzado la temperatura óptima, comience a cortar la muestra para obtener secciones de 40 micrones del tejido de biopsia plantar. Recolecte las secciones criostáticas en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos que contengan PB 0,1 molar con azida sódica 10 milimolar.Asegúrese de que los cortes permanezcan sumergidos y almacénelos a cuatro grados Celsius hasta que estén listos para la inmunotinción de tejido óseo. Recopile los cortes criostáticos directamente sobre portaobjetos pre-codificados con gelatina y luego déjelos secar al aire durante una hora antes de almacenarlos a menos veinte grados Celsius. Los cortes óseos sobre portaobjetos almacenados de esta manera pueden utilizarse para inmunotinción dentro de dos a tres meses.Con una hoja de afeitar, corte de seis a siete milímetros desde el extremo de una punta de micropipeta de un mililitro. Precodiciónela el interior de la punta aspirando varias veces 1% de suero bovino fetal en tampón fosfato 0,1 molar para evitar que los cortes de tejido se adhieran a las paredes de la punta. Transfiera de ocho a diez secciones de biopsia plantar a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Luego, lávelas tres veces con 500 microlitros de tampón fosfato 0,1 molar por pocillo durante cinco minutos con mezcla vigorosa en un agitador orbital a temperatura ambiente.A continuación, incubar los cortes en solución bloqueante con mezcla suave durante una hora a cuatro grados Celsius y luego continuar con las incubaciones con anticuerpos primarios y secundarios. Después de un lavado final en pb, utilizar una pipeta micrométrica recortada tratada con FBS fresco para transferir los cortes a portaobjetos. Organizar los cortes con un pincel y absorber cualquier humedad excesiva evitando la exposición a la luz.Incube las laminillas a temperatura ambiente para secar los cortes sobre la superficie durante cinco a 30 minutos. Una vez secos, aplique varias gotas de medio de montaje lentamente. Coloque una cubreobjetos de vidrio sobre los cortes.Deje que las láminas reposen en la oscuridad durante cinco minutos y luego selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Antes de la obtención de imágenes, después de descongelar las láminas a temperatura ambiente, utilice un bolígrafo con barrera hidrofóbica para delimitar la región de la lámina que contiene las secciones óseas y luego deje secar al aire durante 10 a 15 minutos. Mediante un pipeta, aplique 250 microlitros de PB 0,1 M dentro de la región y lave las secciones óseas durante cinco minutos.Evacúe el PB inclinando el portaobjetos y repita el procedimiento otras dos veces. A continuación, agregue 250 microlitros de la solución bloqueadora e incube las secciones durante una hora a cuatro grados Celsius. Después del bloqueo, continúe con las incubaciones con los anticuerpos primario y secundario, asegurándose de mantener los portaobjetos en una cámara humedecida durante las incubaciones nocturnas.Finalmente, lave con 500 microlitros de PB 0,05 M durante 15 minutos. A temperatura ambiente, sumerja brevemente en agua destilada desionizada para enjuagar las laminillas y luego deje secar al aire las secciones óseas a temperatura ambiente durante cinco a 30 minutos, evitando la exposición prolongada a la luz. Aplique medio de montaje y coloque una cubreobjetos de vidrio sobre las secciones después de dejar las laminillas en la oscuridad durante cinco minutos.Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas utilizando microscopía epifluorescente. Aquí se observan numerosas fibras positivas para CGRP y NF 200 como áreas rojas distribuidas a lo largo de las membranas basales en la unión dérmica epidérmica en la región plantar, que han sido teñidas con anticuerpo anti colágeno cuatro en verde; tanto las fibras positivas para CGRP como para NF 200 en la región plantar también son visibles mediante microscopía confocal, mostradas nuevamente en rojo, tal como indican las cabezas de flecha. Mientras tanto, el marcador panneuronal beta tres tubulina se expresa ampliamente en la región plantar.La tinción de TRPV1 se limita principalmente a fibras de pequeño diámetro que también son positivas para CGRP; tanto las fibras positivas para CGRP como para NF200 pueden detectarse en el tejido óseo de las extremidades, como se muestra aquí distribuidas a través de la matriz ósea en la región esponjosa de la cabeza del fémur de ratón en rojo, utilizando microscopía epifluorescente y confocal. TRPV1 también está presente en el tejido óseo de las extremidades, mostrado aquí en rojo mediante microscopía confocal, y co-localiza con anti-CGRP en verde.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener información sobre las características anatómicas de la inervación sensorial periférica en tejidos como la piel y el hueso, así como sobre la expresión y localización de diversas proteínas dentro de estas fibras nerviosas sensoriales. Todo el proceso, desde la disección hasta el análisis microscópico, debería tomar aproximadamente cuatro días para el tejido cutáneo y 11 días para el tejido óseo.

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Investigación

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Neurociencia

Este video demuestra la tinción inmunohistoquímica de fibras colinérgicas en el núcleo basal de la región de Meynert de secciones de cerebro de ratón. Las secciones se bloquean y se tratan con anticuerpos primarios contra la colina acetiltransferasa, seguidos de anticuerpos secundarios biotinilados. Se añaden complejos avidina-biotina-peroxidasa, que se unen a los anticuerpos secundarios, seguidos del sustrato cromogénico. A continuación, las secciones se deshidratan y se montan antes de...

Tinción inmunohistoquímica de fibras nerviosas en el núcleo basal de Meyner del cerebro de ratón

Fuente: Boyer, N. P. et. al., Imagen y análisis del transporte de neurofilamentos en el nervio tibial de ratón extirpado. J. Vis. Exp. (2020) Este video muestra el método de fotoactivación de fluorescencia para analizar Transporte de neurofilamentos en axones mielinizados de nervios periféricos. Mediante el seguimiento de neurofilamentos marcados con fluoróforos verdes fotoactivados, la técnica proporciona información sobre el transporte axonal en enfermedades neurodegenerativas.

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