Visualización de Ca Vascular ^{2 +} Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la señalización vascular del calcio desencadenada por especies reactivas de oxígeno derivadas del pericrino o r os. Esto se logra visualizando primero R os utilizando tintes sensibles a la oxidación en macrófagos activos. Las ROS también se pueden visualizar en células endoteliales utilizando sensores fluorescentes basados en plásmidos.

A continuación, proceda a visualizar simultáneamente macrófagos activados marcados en rojo y gripe de cuatro células endoteliales marcadas en un modelo de cocultivo. Por último, medir la señalización de calcio en las células endoteliales desencadenada por los R os derivados de macrófagos. Mediante el uso de un sistema de imagen confocal.

Estos resultados pueden demostrar los niveles de R os de forma independiente, así como evaluar simultáneamente la movilización de calcio intracelular desencadenada por las ROS derivadas de Peregrine. Este método permite la evaluación simultánea de dos moléculas de señalización diferentes que provocan íntimamente una señalización vascular y un entorno fisiopatológico simulador. Dos postdoctorados en mi laboratorio, Karthik y Raj, demostrarán el procedimiento sobre las mediciones de calcio crudo y las interacciones de las células endoteliales de macrófagos.

Cultivo de macrófagos derivados de monocitos de ratón en placas de 35 milímetros con fondo de vidrio. A continuación, desafíe a las células con agonistas de receptores tipo Toll e incube durante seis horas a 37 grados centígrados. Para la visualización del citosólico.

Las ROS añaden un tinte sensible a la oxidación e incuban las células durante 20 minutos. Ahora visualice las células en una etapa de temperatura controlada de un sistema de imágenes confocal. Alternativamente, para visualizar las ROS mitocondriales en células activadas por TLR, agregue el indicador de superóxido mitocondrial e incube las células durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

Para un control negativo, trate las células con PBS o DMSO para un control positivo. Tratar las células con dos milimolares de antimicina. Un procedimiento para visualizar todas las celdas en la etapa de temperatura controlada de un sistema de imágenes confocal.

Con el software image J, analice todos los datos de la imagen. El sensor fluorescente detecta hiperespecíficamente las concentraciones submicromolares de peróxido y, en función de la expresión de los mamíferos, el diseño del vector puede dirigirse al citoplasma o a las mitocondrias. Mediante electroporación, cree líneas estables de células endoteliales microvasculares pulmonares de ratón que portan un plásmido de hiperexpresión inapropiado.

Para facilitar el crecimiento de las células en placa de la colonia a baja densidad en TMEM completo e incubar durante 48 horas, reemplace el medio con un medio de cultivo completo suplementado con un antibiótico de selección. Criba los clones para obtener el mayor porcentaje de células hiperpositivas y amplifica el cultivo para crear líneas hiperpositivas estables en experimentos individuales. Células de semilla en cubreobjetos recubiertos de gelatina al 0,2% y cultivo durante la noche hasta el 80% de confluencia.

Ahora active las células con ligandos TLR e incube durante seis horas a 37 grados centígrados. Para la detección de ROS citoplasmáticas, monte los cubreobjetos de las células en una cámara de células adelo. Agregue un mililitro de tanques precalentados, equilibre la solución salina y coloque la cámara en una etapa de temperatura controlada del sistema de imágenes confocal.

Registre los cambios de fluorescencia en las células para la detección de mitocondriales. ROS. Incluir un control positivo de dos antimicina A micromolares. A continuación, preparar los cubreobjetos de las células tratadas para la microscopía confocal. Realice análisis de imágenes con el software image J.

Comience con células endoteliales cultivadas hasta un 80% de confluencia en cubreobjetos de vidrio recubiertos de gelatina para la visualización y medición de los cambios de calcio intracelular. Incubar las células en el tinte fluorescente a las 4:00 a.m. a temperatura ambiente durante 30 minutos para minimizar la pérdida de colorante, lavar las células con una solución de imagen experimental que contenga suen pyro zone. Ahora, la cubierta de montaje se desliza en una cámara de celdas adelo a 800 microlitros de solución de imagen experimental precalentada y coloca las células en una etapa de temperatura controlada del sistema de imágenes confocal en un tubo separado.

Utilice 500 nanogramos por mililitro de rastreador de células rojo C-M-T-P-X durante 15 minutos para etiquetar la población de macrófagos bajo investigación, lavar las células y resuspender los gránulos en 200 microlitros de solución de imagen experimental. Ahora agregue los macrófagos etiquetados a la gripe a las 4:00 a.m. cargada. Las células endoteliales en el ensamblaje de la cámara confocal registran la fluorescencia verde y roja cada tres segundos durante 10 minutos.

En este experimento, las células J 7 74 0.1 fueron desafiadas con ligandos TLR dos, tres y cuatro durante seis horas. Las imágenes confocales representativas muestran un aumento de R o citosólico medido por DCF. Curiosamente, la fluorescencia roja de las mitosis indica un aumento similar en las ROS mitocondriales.

Estos cambios de fluorescencia son cuantitativos. Por lo tanto, los resultados deben normalizarse y expresarse como cambio relativo de pliegue por tratamiento, la señal de antimicina a valida un control positivo para la producción de ROS mitocondrial. Esta figura muestra imágenes de los niveles de peróxido endotelial, citosólico y mitocondrial en la expresión estable de hipercitocitos o hiper D mito.

MP ECS estimulado con agonistas TLR. La cuantificación del cambio de fluorescencia media demuestra un aumento de la hiperfluorescencia citocitométrica e hiper D mito después de seis horas de estimulación en un sistema de cocultivo. Para evaluar la señalización de ROS peregrinos, los macrófagos mirin recién aislados de ratones nulos de tipo salvaje y GP 91 Fox se activaron con un microgramo por mililitro de LPS durante seis horas.

Los macrófagos se marcaron en rojo con C-M-T-P-X y se añadieron a la gripe verde cuatro. Cargado. MPM ecs. Curiosamente, los macrófagos activados por LPS aislados de ratones de tipo salvaje desencadenaron una movilización de calcio grande y rápida en MPM ECS en comparación con los macrófagos de ratones GP 91 Fox null.

Si bien los LI intentan realizar este procedimiento, es importante recordar que la descarga prolongada o la exposición al láser conducen a la autooxidación del DCF. Es crucial evitar el fotoblanqueo de la hipercitocitola y la hiper D mitral. Una vez dominado, la medición de la AR en macrófagos, así como en células endoteliales, se puede realizar en siete horas si se realiza correctamente.