Name: Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a cuantificar cambios en receptores nicotínicos fluorescentes en cerebro de ratón con nicotina crónica mediante microscopía confocal espectral y desmezcla lineal. Este método permite analizar la upregulación de subunidades alfa cuatro YFP.

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Anthony Renda fue apoyada por la Universidad de Victoria Beca de Postgrado. Esta investigación fue apoyada por una de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá Descubrimiento Grant, un premio NARSAD joven investigador (a RN), la Fundación Victoria - Myre y Winifred Sim Fondo, una Fundación Canadiense para la Innovación de subvención, un conocimiento de Columbia Británica Fondo de Desarrollo y Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá Herramientas para la Investigación y de la subvención de instrumentación. Damos las gracias a Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Suarez, Jennifer MacDonald y Daniel Morgado para la cría de ratón excelente.

<ol><li>Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+nicotinic+receptors+in+brains+from+smokers%3A+membrane+binding+and+autoradiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).</li>
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<li>Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+GluR1+in+the+midbrain%3A+a+trigger+for+sensitization+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse.</a> Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).</li>
<li>Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+of+abuse+and+stress+increase+the+expression+of+GluR1+and+NMDAR1+glutamate+receptor+subunits+in+the+rat+ventral+tegmental+area%3A+common+adaptations+among+cross-sensitizing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents.</a> J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).</li>
<li>Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+of+abuse+and+stress+trigger+a+common+synaptic+adaptation+in+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons.</a> Neuron. 37, 577-5782 (2003).</li>
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<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+%CE%B14%CE%B22+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).</li>
<li>Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%C3%8E%C2%B14%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional Î±4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-spectral+imaging+and+linear+unmixing+add+a+whole+new+dimension+to+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy.</a> BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).</li>
<li>Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNashmi%2C+R+%22Molecular+imaging%3A+fret+microscopy+and+spectroscopy%22">Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy</a>. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Larson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nikon+C1si+combines+high+spectral+resolution%2C+high+sensitivity%2C+and+high+acquisition+speed%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed.</a> Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).</li>
<li>Melvin, N. R., Sutherland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+caveats+of+standard+immunohistochemical+procedures%3A+implications+for+optical+disector-based+designs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).</li>
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<li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li>
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<li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+containing+the+%C3%8E%C2%B22+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li>
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<li>Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+nicotine+dose+selection+for+in+vivo+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research.</a> Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).</li>
<li>Lang, T., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+clusters+at+nanoscale+resolution%3A+more+than+pretty+pictures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures.</a> Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

<p class="jove_content"&gt; El uso de un receptor fluorescente en un modelo de ratón knock-in para determinar la cantidad y localización de un canal iónico específico proporciona una serie de ventajas. En contraste a las proteínas como la actina, que se expresa de forma ubicua en todas las células, los canales iónicos están presentes en un número mucho menor y su expresión varía entre los subtipos neuronales que hacen un análisis preciso a través de tradicionales técnicas de inmunohistoquímica difíciles. El producto del gen α4YFP se expresa en ...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> bombas mini-osmóticas </td><td> Alzet </td><td> modelo 2002 </td><td></td></tr><tr><td> salina </td><td> Teknova </td><td> S5819 </td><td></td></tr><tr><td> (-)-Nicotina hidrógeno sal tartrato </td><td> Sigma </td><td> N5260 </td><td></td></tr><tr><td> gotas para los ojos </td><td> Novartis </td><td> Tear-Gel </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond pegamento </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> sal de sodio de heparina </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 70011 </td><td></td></tr><tr><td> la ketamina </td><td> Wyeth de Sanidad Animal </td><td> 0856-4403-01 </td><td></td></tr><tr><td> medatomidine clorhidrato de </td><td> Pfizer </td><td> 1950673 </td><td></td></tr><tr><td> 23G aguja de mariposa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367253 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehído </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> molde de plástico de empotrar </td><td> VWR </td><td> 18986-1 </td><td></td></tr><tr><td> Octubre de montaje compuesto </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> EMD-Calbiochem </td><td> 475904 </td><td> pH 8,5 </td></tr></table>

imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en knock-en ratones con administración crónica de nicotina

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligando los canales iónicos en el sistema nervioso central (SNC) están implicados en numerosas enfermedades con graves consecuencias médicas y sociales. Por ejemplo, la adicción a la nicotina a través de consumo de tabaco es la principal causa de muerte prematura en todo el mundo (Organización Mundial de la Salud) y es probablemente causado por una alteración de la distribución de canales de iones en el cerebro 1. La exposición crónica de nicotina en roedores y en los resultados de los seres humanos en un mayor número de receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) en el tejido cerebral 1-3. Del mismo modo, las alteraciones en los glutamatérgicos GluN1 o GluA1 canales han sido implicados en el desencadenamiento de la sensibilización a otras drogas adictivas como la cocaína, las anfetaminas y los opiáceos 4-6. En consecuencia, la capacidad de asignar y cuantificar los patrones de distribución y expresión de canales iónicos específicos es de vital importancia para la comprensión de los mecanismos de la adicción. El estudio de la región del cerebro específica de EFpermiten descomponer los medicamentos individuales fue promovido por el advenimiento de técnicas tales como ligandos radiactivos. Sin embargo, la baja resolución espacial de la unión del ligando radiactivo impide la capacidad de cuantificar ligando los canales iónicos en los subtipos específicos de neuronas. Codificados genéticamente reporteros fluorescentes, como la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes de color muchas, han revolucionado el campo de la biología 7. Mediante el etiquetado de un reportero genéticamente fluorescente a una proteína endógena se puede visualizar las proteínas in vivo 10.7. Una de las ventajas de las proteínas de marcado con fluorescencia con una sonda es la eliminación del uso de anticuerpos, que tienen problemas de falta de especificidad y la accesibilidad a la proteína diana. Hemos utilizado esta estrategia para nAChRs etiqueta fluorescente, lo que permitió el estudio de conjunto de los receptores con transferencia de energía Förster resonancia (FRET) transfectadas en células cultivadas 11. Más recientemente, se ha utilizado el Knock-en el enfoque de los ratones de ingeniería con proteína amarilla fluorescente etiquetado a4 subunidades de nAChR (α4YFP), lo que permite la cuantificación precisa de la ex vivo del receptor a una resolución de submicrométrico en las neuronas del SNC a través de la microscopía confocal espectral 12. El selectivo fluorescente en cadena en la mutación se incorpora en el locus endógeno y bajo el control de su promotor nativo, produciendo niveles normales de expresión y regulación del receptor cuando se compara a los receptores no marcados en ratones normales. Este enfoque knock-in puede ser extendido para marcar con fluorescencia de otros canales de iones y ofrece un enfoque de gran alcance de la visualización y cuantificación de los receptores en el SNC. En este trabajo se describe una metodología para cuantificar los cambios en la expresión de nAChR en las neuronas del SNC específicos después de la exposición crónica a la nicotina. Nuestros métodos incluyen mini-osmótica implantación de la bomba, la fijación de perfusión intracardíaca, las imágenes y el análisis de fluorescencia rec etiquetado nicotínicosubunidades eptor de α4YFP en cadena en ratones (fig. 1). Hemos optimizado la técnica de fijación para minimizar autofluorescencia de tissue.We cerebro fijo describir en detalle nuestra metodología de imágenes utilizando un microscopio confocal espectral en conjunción con un algoritmo de desmezcla espectral lineal para restar la señal autofluoresent con el fin de obtener con precisión la señal de fluorescencia α4YFP. Finalmente, se muestran los resultados de la crónica inducida por la nicotina regulación al alza de los receptores de α4YFP en la vía perforante medial del hipocampo.

Hemos desarrollado una nueva técnica para cuantificar los cambios de los receptores nicotínicos de acetilcolina en las regiones subcelulares de los subtipos específicos de neuronas del sistema nervioso central para comprender mejor los mecanismos de la adicción a la nicotina mediante el uso de una combinación de enfoques que incluyen el etiquetado proteína fluorescente del receptor con el golpe-en el enfoque y espectral imagen confocal.

Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

Los canales iónicos activados por ligandos en el sistema nervioso central (SNC) están implicados en numerosas afecciones con graves consecuencias médicas y sociales. Para...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios en los receptores nicotínicos marcados con fluorescencia en el cerebro de ratón tras la administración crónica de nicotina. Esto se logra primero implantando bombas osmót游戏副本A continuación, se obtienen imágenes de los cerebros con cubreobjetos mediante microscopía espectral y focal. El paso final del procedimiento es el análisis lineal espectral por mezclado y los niveles de expresión de alfa cuatro YFP. En última instancia, los resultados muestran la capacidad de la microscopía confocal espectral y el análisis lineal por mezclado para cuantificar con precisión la sobreexpresión de las subunidades alfa cuatro YFP del receptor nicotínico de acetilcolina con resolución submicrométrica en neuronas cerebrales de ratón expuestas a nicotina crónica.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la marcación con anticuerpos o radioligandos, es que la Y FPS está genéticamente codificada para unirse al receptor, lo que permite una visualización directa y más precisa del receptor marcado. Esto facilita la obtención de imágenes subcelulares de alta resolución de la localización del receptor en neu

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video demuestra cómo la activación mediada por nicotina de los receptores nicotínicos de acetilcolina en el hipocampo ventral del ratón da como resultado una señalización sostenida de calcio a lo largo de los axones.

Imágenes de la señalización de calcio inducida por nicotina a lo largo de los axones del hipocampo ventral en cocultivos sinápticos

En este artículo, se describe un método útil para estudiar ligandos función del canal iónico en las neuronas de rodajas de cerebro agudamente aisladas. Este método implica el uso de una micropipeta de relleno de fármaco para aplicación local de medicamentos a las neuronas registradas utilizando técnicas estándar de patch clamp.

La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

Desarrollamos una preparación génica-quimérica del circuito ventral hipocampo-accumbens in vitro que permite obtener imágenes directas en vivo para analizar los mecanismos presinápticos de la transmisión sináptica mediada por los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparación también proporciona un enfoque informativo para estudiar los mecanismos pre y postsinápticos de la plasticidad sináptica.

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Este artículo presenta un método para el estudio de los receptores acetilcolina nicotínicos (nAChRs) en rebanadas de cerebro de ratón por uncaging de nicotina. Cuando se combina con revisión simultánea abrazadera grabación y láser de 2 fotones microscopía, nicotina uncaging conecta función del receptor nicotínico con morfología celular, proporcionando una comprensión más profunda de la neurobiología colinérgico.

Sondeo de la función de Receptor nicotínico de la acetilcolina en rebanadas de cerebro de ratón mediante fotólisis de destello láser de la nicotina Photoactivatable

Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

Este protocolo describe la expresión y cuantificación de las subunidades neuronales de los receptores nicotínicos de acetilcolina utilizando la línea celular Neuro-2a de mamíferos. Las etiquetas fluorescentes sensibles al pH y la microscopía confocal permiten una evaluación precisa de la localización de receptores en la membrana plasmática frente a las expresadas en compartimentos intracelulares neutros en pH, facilitando el estudio del tráfico y la modulación farmacológica de nAChR.

Localización de la membrana plasmática y receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal mediante imagen cuantitativa en células de mamíferos

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes...

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Aquí se describe una adaptación de los protocolos utilizados para inducir la plasticidad homeostática en las neuronas para el estudio de la plasticidad de los receptores acoplados a proteínas G astrocíticos. Recientemente se utiliza para examinar los cambios en el grupo I mGluRs astrocítica en ratones jóvenes, el método se puede aplicar para medir la escala de varios GPCRs astrocitos, en el tejido de los ratones adultos in situ e in vivo, y para obtener una mejor apreciación de la sensibilidad...

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Durante el desarrollo del cerebelo postnatal, las células granulosas inmaduras que se originan en la zona germinal exhiben distintas modalidades de migración para llegar a su destino final y establecer redes neuronales. Este protocolo describe la preparación de cortes cerebelosos y el enfoque macroscópico confocal utilizado para investigar los factores que regulan la migración neuronal.

Ex Vivo Imaging de Postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal Macroscopía

El método de inmunogold postincrustado es una de las formas más efectivas de proporcionar análisis de alta resolución de la localización subcelular de moléculas específicas. En este trabajo describimos un protocolo para analizar cuantitativamente los receptores de glutamato en las sinapsis de la cinta retiniana.

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Aprende a cuantificar cambios en receptores nicotínicos fluorescentes en cerebro de ratón con nicotina crónica mediante microscopía confocal espectral y desmezcla lineal. Este método permite analizar la upregulación de subunidades alfa cuatro YFP.

Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina (Video) | JoVE Journal

Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

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