Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios en los receptores nicotínicos fluorescentes en el cerebro de ratón con aplicación crónica de nicotina. Esto se logra implantando primero ratones knockin alfa cuatro YFP con mini bombas osmóticas llenas de solución salina o nicotina. Después del tratamiento, se fija la Misa intra Cardi y se crioseccionan los cerebros.

A continuación, se obtienen imágenes de los cerebros deslizados mediante microscopía espectral y focal. El paso final del procedimiento es el espectral lineal en la mezcla y el análisis de los niveles de expresión de alfa cuatro YFP. En última instancia, los resultados muestran la capacidad de la microscopía confocal espectral y lineal en la mezcla para cuantificar con precisión la regulación positiva de las subunidades del receptor nicotínico de colina alfa cuatro YFP a una resolución submicrónica en neuronas cerebrales de ratón expuestas a la nicotina crónica.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como el de anticuerpos o el de radioligandos, es que el Y FPS codificado genéticamente para unirse al receptor, permitiendo así una imagen directa y más precisa del receptor tag. Esto facilita la obtención de imágenes subcelulares de alta resolución de la localización del receptor en las neuronas del SNC y lo obvia. Cualquier problema potencial de especificidad de la sonda, tinción desigual o acceso de la sonda a antígenos en capas profundas del tejido.

demostrar el procedimiento estará Anthony rda, un estudiante graduado en mi laboratorio Después de extirpar el cerebro que ha sido fijado por perfusión intracal, corte el cerebelo con una cuchilla de afeitar. Coloque una pequeña gota de compuesto de montaje en el fondo del molde debajo del cerebro y coloque el cerebro en un molde de inclusión de plástico con el lado rostral hacia arriba. Luego coloque el molde en el hielo seco.

Una vez que el cerebro esté congelado en la orientación adecuada, llene el resto del molde con compuesto de montaje. A continuación, utilice un criostato para recoger secciones de cerebro de 30 micras de grosor. Transfiera las secciones a portaobjetos recubiertos con dos pinceles finos.

Recuerde proteger las secciones del cerebro de la luz cubriéndolas siempre con una tapa de bandeja deslizante. Guarde las secciones de cerebro en cajas de portaobjetos que contengan una piedra de sulfato de calcio anhidro. La caja deslizante debe estar en una bolsa sellada con cierre hermético para evitar la humedad y las quemaduras posteriores por congelación cuando se almacena a menos 20 grados centígrados.

Asegúrese de que las diapositivas tengan una exposición mínima a cualquier fuente de luz para minimizar el blanqueo fotográfico antes de la obtención de imágenes. Al mantenerlos cubiertos con la tapa de la bandeja deslizante, la punta de la pipeta se puede cortar para ayudar a disminuir la formación de burbujas cuando la cubierta se desliza. Utilice un medio de montaje que no inhiba la fluorescencia de proteínas fluorescentes, como MO Wild 4 88.

Asegúrese de que el mo se equilibre a temperatura ambiente antes de que la cubierta se deslice. Para evitar el deslizamiento de la cubierta de las burbujas de aire, la sección del cerebro se desliza una a la vez. No use esmalte de uñas cuando la cubierta se deslice, ya que se apagará.

Fluorescencia YFP. Recopile imágenes de regiones cerebrales utilizando un sistema de microscopio confocal espectral, que permite una cuantificación muy precisa de la fluorescencia de YFP incluso en tejido con niveles significativos de autofluorescencia. Para realizar la desmezcla espectral lineal en una imagen de muestra tomada con un microscopio confocal espectral, primero se deben adquirir espectros de referencia tanto para YFP como para la autofluorescencia tisular.

En primer lugar, obtenga un espectro de referencia de fluorescencia de señal a ruido alto mediante la obtención de imágenes de una línea celular transfectada de YFP soluble utilizando la línea láser de 4 88 nanómetros. A continuación, utilizando la misma línea láser, obtenga un espectro de referencia de autofluorescencia en la región cerebral deseada de una sección de cerebro de ratón de tipo salvaje. Después de obtener una imagen confocal espectral de una región del cerebro del ratón YFP alfa cuatro, involute la imagen en sus señales YFP y de autofluorescencia mediante la aplicación de un algoritmo de desmezcla espectral lineal que utiliza los espectros de referencia de YFP y la autofluorescencia del ratón de tipo salvaje de la misma región del cerebro.

Abra la imagen YFP alfa cuatro sin mezclar en un software de análisis de imágenes como Image J y, a continuación, calcule la intensidad media de píxeles para la región de interés. Repita el mismo espectral lineal y la mezcla y el análisis en una imagen espectral y focal de la misma región del cerebro en una sección de cerebro de ratón de tipo salvaje para obtener un valor residual de fondo. Ahora, la intensidad corregida de alfa cuatro YFP se puede obtener restando el valor residual de fondo medio promediado en tres a cinco ratones de tipo salvaje del valor de YFP alfa cuatro no corregido, que se muestra aquí hay una proyección en color real de una pila Lambda de imágenes de la media ular de un ratón alfa cuatro YFP tomadas con un microscopio confocal espectral Nikon C one si, a continuación se muestran gráficos de espectros de una región de interés, que incluye alfa cuatro YFP que contienen neuronas en verde con un pico de YFP distinto a 5 27 nanómetros, y una región de interés fuera del ULA medial en rojo, sin el pico YFP La separación de las señales YFP y de autofluorescencia es posible a través de la desmezcla espectral lineal utilizando los espectros de referencia de autofluorescencia cerebral YFP y Wildtype que producen una imagen sin mezclar de alfa cuatro YFP y una imagen sin mezclar autofluorescente que se muestran a continuación se muestran los significativamente superpuestos Los espectros de referencia de YFP y autofluorescencia utilizados para la desmezcla en verde y amarillo, respectivamente, utilizando microscopía confocal espectral, la regulación positiva de los receptores nicotínicos de acetilcolina alfa cuatro en el hipocampo de ratones knockin alfa cuatro YFP expuestos a nicotina crónica se pueden ver aquí en un montaje en mosaico de la fluorescencia de alfa cuatro YFP desde el hipocampo.

Las dos áreas de selección son las ubicaciones aproximadas en la extremidad inferior de la ruta de Perent donde se realizaron los análisis para cada ratón. La fluorescencia de alfa cuatro YFP fue significativamente mayor en la trayectoria pertinente de los ratones expuestos a la nicotina crónica en lugar de a la solución salina crónica. Después de ver este video, debe tener una comprensión clara de cómo obtener imágenes de los cambios en los receptores nicotínicos alfa cuatro YFP en cerebros de ratones knock con administración crónica de nicotina al saber cómo una sección fija y criogénica, el cerebro del ratón y dos imágenes utilizando microscopía confocal espectral e imágenes espectrales lineales y mixtas de la sección cerebral.

Estos conceptos básicos también pueden aplicarse y extenderse al estudio de la expresión de otros canales iónicos y receptores.