Ensayo de adherencia de frecuencia para In Situ El análisis de la cinética de unión de la Cruz-Las interacciones moleculares en la interfaz célula-célula

El objetivo general del siguiente experimento consiste en medir la cinética de la interacción entre receptores y ligandos cuando ambas moléculas están ancladas en las superficies de las células que interactúan. Esto se logra primero funcionalizando los glóbulos rojos, que actúan como sensores de adhesión, con ligandos y preparando células portadoras de receptores. Como segundo paso, se ensambla la cámara de micropipeta y se realizan pruebas de adhesión para registrar los eventos de adhesión.

A continuación, se traza la curva de probabilidad de adhesión frente al tiempo de contacto celular y se ajusta con el modelo. Con el fin de estimar los parámetros cinéticos, se obtienen resultados que muestran la afinidad efectiva de unión en dos dimensiones y la velocidad de disociación estimadas a partir de los datos. Entonces, ¿de dónde obtenemos la idea de este ensayo?

Las personas estudian la interacción entre el receptor y la pata. Principalmente miden las fuerzas de ruptura y nosotros estamos haciendo lo mismo, pero un día pensamos: ¿podríamos simplemente medir el resultado binario, cero para ausencia de adhesión y uno para adhesión, y derivar a partir de estas mediciones binarias la cinética para mostrar el ensayo de frecuencia de microcanal? La Dra. Veronica Zana Zina, científica investigadora de mi laboratorio, les mostrará el experimento.

Los glóbulos rojos aislados de sangre total se biotinilan para el ensayo de frecuencia de adhesión. Para comenzar este procedimiento, centrifugue el tubo que contiene glóbulos rojos aislados, retire una alícuota de 10 microlitros del sedimento de glóbulos rojos en cada uno de varios viales y agregue la cantidad correspondiente de PBS a cada vial para preparar múltiples concentraciones de biotinilación de glóbulos rojos. A continuación, agregue 10 microlitros de tampón boro ocho 0,1 molar a cada vial.

Luego, agregue una cantidad calculada de solución de biotina a cada vial y mezcle inmediatamente mediante vortex. Coloque cada vial de glóbulos rojos dentro de un tubo cónico de 50 mililitros durante varios segundos e incube en un rotador durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, agregue tampón EAS 45 a cada vial y centrifugue durante dos minutos a 2000 rotaciones por minuto. Repita el lavado con tampón EAS 45 dos veces, para un total de tres lavados.

Finalmente, añada 100 microlitros de tampón EAS 45 a cada vial y almacénelo a cuatro grados Celsius para funcionalizar los ligandos en la superficie de los glóbulos rojos. Tras la etapa anterior, los glóbulos rojos se incuban con una concentración saturada de estreptavidina durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y se lavan tres veces con tampón EAS 45 durante dos minutos a 2000 rotaciones por minuto. Después de eso, incube directamente los glóbulos rojos con el ligando biotinilado o incube los glóbulos rojos con el correspondiente anticuerpo capturador biotinilado seguido de una incubación con los ligandos. El protocolo mostrado en este video utiliza el anticuerpo capturador biotinilado.

Los micropipetas se fabrican utilizando tubos capilares de vidrio de borosilicato con punto de fusión bajo. Primero, utilice un extractor de micropipetas para estirar los tubos capilares. A continuación, utilice un micromanipulador con un microhorno para cortar la punta de la micropipeta hasta obtener una abertura del tamaño deseado.

El diámetro requerido generalmente varía entre uno y cinco micrones, dependiendo del tamaño de las células que se utilizarán en el estudio. Para preparar la cámara de células, use dos piezas de cubreobjetos de microscopio cortadas al tamaño deseado, limpie el polvo de las laminillas con un soplador de aire, agregue el medio de la cámara de células y selle la cámara usando aceite mineral desde ambos lados para evitar la evaporación del medio. Eso cambiaría la osmolaridad durante el experimento.

El sistema de micropipeta utilizado en este ensayo consta de tres subsistemas: un subsistema de imagen para observar, grabar y analizar los movimientos de la célula aspirada por la micropipeta, un subsistema de micro-manipulación que permite la selección de células desde la cámara de células y un subsistema de presión para aspirar las células hacia el interior de las micropipetas. La pieza central del subsistema de imagen es un microscopio invertido con un objetivo de inmersión en aceite de 100 aumentos. Las imágenes del objetivo son detectadas por una cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD) y enviadas a un grabador de videocasete.

Un temporizador de video está acoplado al sistema para llevar un registro del tiempo. Después de llenar la micropipeta con agua desionizada, colóquela en su soporte sobre una unidad mecánica montada en el microscopio. La micropipeta puede posicionarse con precisión mediante un micromanipulador hidráulico de tres ejes.

Uno de los porta-pipetas microscópicos está montado en un traductor piezoeléctrico programado por computadora. Esto permite mover la pipeta con precisión y dentro de un ciclo de prueba de adhesión. El subsistema de regulación de presión se utiliza para controlar la succión.

Durante el experimento, una línea hidráulica conecta el porta-micropipetas con un depósito de fluido. Un posicionador mecánico fino permite manipular con precisión la altura del depósito. Después de armar la cámara, se colocan micropipetas, se inyectan las células en la cámara para iniciar el ensayo, se aspiran las células que interactúan mediante las pipetas respectivas y se utiliza el traductor eléctrico PSO para mover el glóbulo rojo entrando y saliendo del contacto con el neutrófilo, controlando el área y el tiempo de contacto.

Se observa un evento de adhesión cuando el glóbulo rojo se alarga tras la separación celular; un evento sin adhesión corresponde a la ausencia de alargamiento del glóbulo rojo. Registre los eventos de adhesión observados añadiendo un uno para adhesión o un cero para ausencia de adhesión en una columna de una hoja de cálculo de Excel.

Registre la curva de frecuencia de adhesión frente al tiempo de contacto utilizando al menos tres pares diferentes de células para cada tiempo de contacto. Para obtener una media y un EE como control, registre la curva de unión no específica utilizando glóbulos rojos recubiertos con ligandos relevantes y/o bloqueando los ligandos o receptores mediante su bloqueo funcional específico. Mediante anticuerpos monoclonales, la frecuencia específica de adhesión en cada punto de tiempo de contacto puede calcularse restando la frecuencia de adhesión no específica.

Los datos de frecuencia específica de adhesión frente al tiempo de contacto se ajustan mediante un modelo probabilístico que describe una interacción de un solo paso, de segundo orden en sentido directo y de primer orden en sentido inverso, entre una única especie de receptores y una única especie de ligandos. En esta ecuación, KA es la afinidad 2D. KA es la velocidad de disociación 2D.

MR y ML son las densidades del receptor y del ligando, respectivamente, y AC es el área de contacto. El ajuste de la curva tiene dos parámetros, ac, k, a y K off, ya que AC y KA se agrupan juntos y se denominan colectivamente afinidad efectiva 2D; su producto con la velocidad de disociación es la velocidad efectiva de asociación 2D: AC K on equivale a AC KA multiplicado por K off. Aquí se muestra un ejemplo de la determinación de la integrina alfa L beta dos.

Densidad de sitios en neutrófilos. Primero se incubaron los neutrófilos con un microgramo por mililitro de E-selectina Ig, seguido de concentraciones saturantes de anticuerpo monoclonal anti-CD11a conjugado con PE o de IgG de ratón relevante como control. Después de 30 minutos de incubación, las muestras se lavaron y se leyeron en un citómetro de flujo con cantidad estándar.

Perlas de calibración PE brillantes. El panel A muestra histogramas de fluorescencia de perlas de calibración junto con los de células tratadas o no tratadas con E-selectina IG. La tinción con anticuerpo monoclonal específico CD11A se muestra en curvas continuas y la tinción con anticuerpo de control de isotipo correspondiente se muestra en curvas punteadas.

El panel B muestra el proceso de cuantificación de densidad. Se calculó el log 10 de la intensidad fluorescente media de cada uno de los cuatro microesferas. Valor del pico de calibración del panel A y de las moléculas de PE por microesfera específicas del lote.

Se trazó una regresión lineal de log₁₀ moléculas de PE por microesfera frente a log₁₀ fluorescencia para reseleccionar las células intrusas. Log₁₀ fi es igual a 3,99, indicado con el círculo azul sólido, y 2,23, indicado con el círculo azul abierto, para el anticuerpo monoclonal específico y el anticuerpo de control, respectivamente. Cuando se resolvió la ecuación lineal para X, el número total de alfa L beta dos o neutrófilos se calculó como 9.587.

Se calculó que la densidad superficial era de 43 sitios por micrómetro cuadrado utilizando 8,4 micrómetros como diámetro del neutrófilo. El siguiente gráfico muestra la frecuencia acumulada de adhesión fi para unión específica a un segundo y a 10 segundos. Los tiempos de contacto se midieron a partir de ciclos repetidos de prueba de adhesión entre glóbulos rojos recubiertos con ICAM-1 y neutrófilos humanos que expresan el integrina alfa L beta 2.

En contraste, aquí se muestra la frecuencia de adhesión durante la marcha, fi, para la unión no específica en tiempos de contacto de un segundo y diez segundos, medidos a partir de ciclos repetidos de prueba de adhesión entre glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulina G humana y neutrófilos humanos que expresan el integrina alfa L beta dos. Este gráfico final ilustra la cinética de las probabilidades de unión de I A uno al integrina alfa L beta dos en neutrófilos; las medidas obtenidas para tres pares de células en cada tiempo de contacto se promediaron y representaron frente al tiempo de contacto para controlar la unión no específica. Se utilizaron dos condiciones diferentes.

Unos glóbulos rojos recubiertos con el anticuerpo de captura anti-TFC e incubados con IgG humana en lugar de ICAM-1, y dos neutrófilos que se unen a glóbulos rojos no recubiertos con el anticuerpo de captura. La unión no específica registrada como la curva de control de IgG humana se utilizó para obtener una curva específica de probabilidad de adhesión. Utilizando la ecuación previamente descrita para la corrección de la unión no específica.

La curva corregida de probabilidad de adhesión específica se ajustó con el ajuste del modelo. La curva de probabilidad de adhesión específica devolvió la afinidad efectiva de unión. Un CKA equivale a 1,4 veces 10 a la menos cuatro micrones a la cuarta potencia y koff equivale a 0,3 s⁻¹.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la cinética de la interacción receptor-ligando cuando ambas moléculas están ancladas en las superficies de las células de interacción I. Al intentar este procedimiento, es importante recordar las primeras pruebas, el rango de densidades en el lado del ligando para que la frecuencia de adhesión se encuentre en un valor medio, y tener presente que trabajar con sangre y algunos de los reactivos para tratamientos específicos, por ejemplo, sodio azida y DM, puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, se requieren precauciones como leer cuidadosamente las hojas de datos de seguridad de los reactivos (MSDS) y usar guantes durante la realización de este procedimiento.