Ensayo Replegado intracelular
24 de enero de 2012
En este protocolo un método para medir el replegamiento de proteínas intracelulares tras el choque térmico se describe. Este método puede ser usado para estudiar foldases como chaperones moleculares y sus co-factores o componentes capaces de influir en su actividad. La actividad luciferasa de luciérnaga se utiliza como reportero para medir la actividad de las chaperonas replegado.
El objetivo general del siguiente experimento es medir la proteína intracelular dependiente de chaperonas que se repliega tras un choque térmico. Utilizando un reportero de luciferasa, primero transfecte las células con plásmidos que contengan el gen del reportero de luciferasa y la chaperona de interés. Luego, divida las células transfectadas según los puntos de tiempo de recuperación en el diseño experimental.
Al día siguiente, someta las células a un choque térmico para inducir el desdoblamiento proteico. Permita la recuperación para restablecer el plegamiento proteico intracelular y luego mida la actividad del reportero luciferasa. Los resultados miden el replegamiento proteico dependiente del tiempo y de las chaperonas, basado en el ensayo de luciferasa.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el ensayo de plegamiento in vitro, es la posibilidad de obtener una lectura fisiológica del efecto de compuestos o proteínas sobre la actividad de chaperonas. Las implicaciones de esta técnica se extienden a terapias para una amplia gama de enfermedades, como enfermedades neurodegenerativas o cáncer, porque las chaperonas desempeñan un papel importante en el desarrollo de estas patologías. Primero, precaliente el medio de cultivo, el PBS y la tripsina a 37 grados Celsius en un baño de agua.
Lave una cultura confluyente de células HEK 293 con cinco mililitros de PBS. A continuación, agregue un mililitro de tripsina que contenga 0,025 % de EDTA, gire suavemente la placa para lograr una distribución uniforme de la tripsina e incube a 37 grados Celsius. Agite periódicamente la placa para verificar la disociación celular.
Ahora, suspenda las células en 10 mililitros de medio DMEM completo y transfiera a un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, cuente las células utilizando una placa contador Beckman. Incube las células a una confluencia aproximada del 60 al 70% durante seis a ocho horas.
Equilibre el reactivo Extreme Gene 9 a temperatura ambiente y el alícuota de medio libre de suero a 37 grados Celsius. Pipetee el medio libre de suero en dos tubos Eppendorf. A continuación, agregue el reactivo Extreme Gene 9 sin tocar la pared del tubo Eppendorf e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Mientras tanto, prepare las mezclas de transfección 2D NA en el tubo uno, añada ran vanilla luciérnaga y un control de vector vacío en el tubo dos. Añada ran vanilla luciérnaga y la chaperona molecular. Añada el ADN a la mezcla del reactivo de transfección, vortexee e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Continúe añadiendo esta mezcla a las células en placas e incube durante 24 horas. Recoga las células transfectadas utilizando tripsina, siembre las células con una confluencia del 60 al 70 % en placas de seis pocillos y déjelas en el incubador durante la noche. Aspire el medio de las células transfectadas.
Luego, agregue un mililitro de tampón de choque térmico e incube durante 30 minutos. Para detener la síntesis de proteínas de novo, selle las tapas con tiras de paraforma e incube en un baño de agua a 45 grados Celsius durante 30 minutos. Ahora retire la paraforma y coloque las células nuevamente en el incubador para su recuperación en los puntos de tiempo especificados.
Recoger las células y lavar una vez con PBS. Para una lisis celular eficiente, congelar rápidamente el pellet celular en nitrógeno líquido, agregar 200 microlitros de tampón de lisis pasiva diluido. A continuación, distribuir en tres réplicas. 30 microlitros del lisado celular por pocillo de una placa de 96 pocillos.
Para evaluar la eficiencia de transfección, comience con las muestras de referencia no sometidas a choque. Para medir la actividad de luciferasa ran, prepare un tampón de reacción fresco de Lucifer 0,2 milimolar en tampón gly-gly que contenga 1 milimolar de ATP y 0,2 micromolar de tampón de reacción ezine. Inserte la placa de 96 pocillos en el luminómetro e inicie el programa.
Estación de trabajo Wallach 1420. Introduzca la bomba uno en el tubo Falcon que contiene tampón de reacción de ezina 0,2 micromolar. Seleccione del menú la opción mantenimiento del dispensador y marque la bomba uno.
Seleccione la opción de rellenar para editar el diseño de la placa. Elija la opción, explore el protocolo y los resultados en el menú. Seleccione el protocolo.
Ahora seleccione los pocillos que se van a leer. Vuelva al administrador de Wallach y haga clic en iniciar para medir las emisiones de las muestras. A 482 nanómetros, proceda al mantenimiento del dispensador y seleccione vaciar y bombear uno para devolver toda la solución residual al tubo.
Ahora mueva el tubo a un falcon que contiene agua y marque, enjuague. Continúe seleccionando vacío. Luego coloque el tubo de la bomba uno en el tampón de reacción y el tubo de la bomba dos en la solución de LUCIFERINA.
Cambie el diseño de la placa. Seleccione llenado para la bomba uno y la bomba dos. En el menú de mantenimiento del dispensador, seleccione el protocolo e inicie la medición de la longitud de onda de la reacción de luciferasa de luciérnaga de 560 nanómetros.
Al final de la repetición, repita el procedimiento: vacíe, enjuague, vacíe. Para la bomba uno y la bomba dos, visualice los resultados en el Wallach 1420 Explorer. Cada experimento está asociado a un ensayo.
Número de usuario, fechas de inicio y finalización, exportar resultados como un archivo de Excel. Para el análisis, el plegamiento de proteínas está directamente relacionado con el tiempo de recuperación. En este experimento, las células se evalúan en diferentes puntos de tiempo tras el choque térmico.
En ausencia y en presencia del chaperón molecular. Como era de esperar, el porcentaje de luciferasa replegada aumenta con el tiempo prolongado de recuperación tanto en los controles como en las células transfectadas con el chaperón molecular. En contraste, un conjunto de datos inválido muestra bajos valores de R cuadrado para la correlación entre el tiempo y el replegamiento.
Tras seguir esta técnica, se pueden realizar otros métodos como el ensayo de TPAs in vitro para responder preguntas adicionales, como la inhibición de la actividad enzimática de la chaperona. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la proteína intracelular. Seguimos después del choque térmico.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para medir el plegamiento intracelular de proteínas tras un choque térmico, centrándose en el papel de las chaperonas moleculares. La actividad de la luciferasa de luciérnaga sirve como indicador para evaluar la actividad de plegamiento de las chaperonas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Formación de Estructura Secundaria de Proteínas
- Chaperonas Moleculares
Antecedentes
- Comprender el plegamiento de proteínas es fundamental para la función celular.
- El choque térmico puede provocar el desplegamiento de proteínas, lo que requiere mecanismos de replegamiento.
- Las chaperonas moleculares ayudan en el proceso de replegamiento.
- Los ensayos de luciferasa proporcionan una medida cuantitativa de la actividad de replegamiento.
Objetivo del estudio
- Medir el plegamiento intracelular de proteínas dependiente de chaperonas.
- Investigar los efectos del choque térmico sobre la estructura de las proteínas.
- Utilizar la luciferasa como reportero para evaluar la actividad de las chaperonas.
Métodos Utilizados
- Transfección de células con plásmidos que contienen los genes de luciferasa y de chaperonas.
- Establecimiento de puntos temporales de recuperación tras la transfección.
- Inducción de choque térmico para promover el desnaturalizado de proteínas.
- Medición de la actividad de luciferasa para evaluar la eficiencia de plegamiento.
Resultados principales
- Se observó el plegamiento de proteínas dependiente del tiempo.
- Se confirmó la actividad de chaperonas mediante ensayos de luciferasa.
- Los resultados indicaron la eficacia de las chaperonas en la recuperación de proteínas.
- Los datos respaldan el papel de las chaperonas moleculares en las respuestas celulares al estrés.
Conclusiones
- El método mide eficazmente el plegamiento de proteínas tras un choque térmico.
- Los ensayos de luciferasa son una herramienta confiable para estudiar la actividad de las chaperonas.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la homeostasis proteica en las células.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo de plegamiento intracelular proporciona una lectura basada en células para medir la actividad de las chaperonas moleculares, permitiendo la validación de objetivos en las vías de homeostasis proteica. Al vincular la función de las chaperonas con el plegamiento de luciferasa, apoya la reducción mecanicista de riesgos en el descubrimiento de fármacos para oncología y neurodegeneración. El ensayo facilita la selección de compuestos moduladores de la actividad de chaperonas, contribuyendo a la identificación de candidatos prometedores y a una mayor confianza predictiva en modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la replegamiento de proteínas dependiente de chaperonas como hipótesis terapéutica en las vías de respuesta al estrés.
- Valor operativo: Proporciona una lectura cuantitativa basada en luciferasa para evaluar la función de chaperonas en células vivas.
- Valor predictivo: Apoya la confianza en el blanco al medir los efectos del compuesto sobre la actividad intracelular de replegamiento.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera datos de respuesta a la dosis para compuestos que inhiben o estimulan el plegamiento mediado por chaperonas.
- Valor operativo: Utiliza un sistema dual normalizado de luciferasa (luciérnaga/renilla) para controlar la eficiencia de transfección y la variabilidad.
- Escalabilidad: Compatible con formatos de placas de 96 pocillos para campañas de cribado de mediano rendimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela la participación de las chaperonas en la quimiorresistencia del cáncer y en la neurodegeneración, lo que apoya la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Continuidad preclínica: Conecta la validación del blanco con la evaluación funcional de la actividad de las chaperonas en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en los efectos del compuesto sobre los mecanismos de proteostasis.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, particularmente para moduladores de las redes de plegamiento de proteínas.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis sobre la función de las chaperonas en el plegamiento intracelular tras la desnaturalización proteica inducida por choque térmico.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de luminiscencia adecuadas para la selección de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Ofrece métricas de plegamiento dependientes del tiempo y de las chaperonas para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con modelos preclínicos en los que las chaperonas influyen en la progresión de enfermedades en cáncer y neurodegeneración.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar moduladores de chaperonas en múltiples clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mide la interacción con el objetivo mediante la salida funcional de plegamiento, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la modulación de chaperonas.
- Valor operativo: Estandariza las condiciones del ensayo utilizando protocolos definidos de transfección y recuperación para lograr reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora la priorización de carteras al identificar compuestos con efectos deseados sobre las vías de proteostasis.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo de candidatos dirigidos a chaperonas en áreas terapéuticas de oncología y del sistema nervioso central.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la transfección de células de mamífero y ensayos de luciferasa repórter.
- Depende de la compatibilidad del luminómetro para la detección de luciferasa de doble longitud de onda.
- Necesita condiciones estandarizadas de choque térmico y recuperación en todos los lotes experimentales.
- La adaptación a otros pares chaperona-sustrato puede requerir la validación de la dependencia en el plegamiento.
- Se limita a repórteres proteicos solubles y replegables, como la luciferasa; no es adecuado para sustratos propensos a la agregación sin modificaciones.
