Ensayo Replegado intracelular
24 de enero de 2012
En este protocolo un método para medir el replegamiento de proteínas intracelulares tras el choque térmico se describe. Este método puede ser usado para estudiar foldases como chaperones moleculares y sus co-factores o componentes capaces de influir en su actividad. La actividad luciferasa de luciérnaga se utiliza como reportero para medir la actividad de las chaperonas replegado.
El objetivo general del siguiente experimento es medir la proteína intracelular dependiente de chaperona, que se repliega después del choque térmico. Usando un indicador de luciferasa, primero transfecte células con plásmidos que recubren el gen reportero de luciferasa y la chaperona de interés. A continuación, divida las células transfectadas para los puntos de tiempo de recuperación en el diseño experimental.
Al día siguiente, el calor realiza un choque en las células para inducir el despliegue de proteínas. Permitir la recuperación para recuperar el plegamiento de proteínas intracelulares y, a continuación, medir la actividad reportera de la luciferasa. Los resultados miden el repliegue de proteínas dependiente del tiempo y dependiente de chaperonas basado en el ensayo de luciferasa.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo de repliegue in vitro, es la posibilidad de tener una lectura fisiológica del efecto de los compuestos o proteínas en la actividad de las chaperonas. Las implicaciones de esta técnica se extienden a una terapia de una amplia gama de enfermedades como las enfermedades neurodegenerativas o el cáncer, ya que las chaperonas juegan un papel importante en el desarrollo de estas patologías. Primero, precaliente el medio de cultivo, PBS y tripsina a 37 grados Celsius en un baño de agua.
Lavar un cultivo confluente de células HEK 2 93 con cinco mililitros de PBS. A continuación, aplique un mililitro de tripsina que contenga 0,025% de EDTA, gire suavemente la placa para una distribución uniforme de la tripsina e incube a 37 grados centígrados. Agite periódicamente la placa para verificar el desprendimiento de la célula.
Ahora res suspender las celdas en 10 mililitros de medio DMEM completo y transferir a un tubo de halcón de 50 mililitros. A continuación, enumere las celdas con una placa de contador de Beckman. Las células, con aproximadamente un 60 a 70%, coinciden e incuban durante seis a ocho horas.
Equilibre el gen extremo, nueve reactivos a temperatura ambiente y la alícuota de medio libre de suero a 37 grados Celsius. Pipetear el medio libre de suero en dos tubos de einor. A continuación, añadir el reactivo extreme gene nine sin tocar la pared del tubo de einor incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Mientras tanto, prepare las mezclas de transfección 2D NA en el tubo uno, agregue una luciérnaga de vainilla y un control de vector vacío en el tubo dos. Agrega la luciérnaga de vainilla corrida y la chaperona molecular. Agregue el ADN al vórtice de mezcla de reactivos de transfección e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Continúe agregando esta mezcla a las celdas plateadas e incube durante 24 horas. Coseche las células transfectadas utilizando células de semilla de tripsina a un 60 a 70% de fluidez en seis placas de pocillos y déjelas en la incubadora durante la noche. Aspire el medio de las células transfectadas.
A continuación, añade un mililitro de tampón de choque térmico e incuba durante 30 minutos. Para detener la síntesis de proteínas Denovo, selle las tapas con tiras de paraforma e incube en un baño de agua a 45 grados centígrados durante 30 minutos. Ahora retire la paraforma y vuelva a colocar las células en la incubadora para su recuperación en los puntos de tiempo especificados.
Coseche las células y lávelas una vez en PBS Para obtener un ajuste de lisis celular eficiente, congele el pellet de la celda en nitrógeno líquido, agregue 200 microlitros de tampón de lisis pasiva diluido. Ahora alícuota por triplicado. 30 microlitros de lisado celular por pocillo de una placa de 96 pocillos.
Para evaluar la eficiencia de la transfección, comience con las muestras de referencia no electrocutadas. Para medir la actividad de la luciferasa corrida, prepare un tampón de reacción Lucifer de 0,2 milimolares en gly Gly que contiene un TP milimolar A y un tampón de reacción de ezina de 0,2 micromolares. Inserte la placa de 96 pocillos en el luminómetro e inicie el programa.
Estación de trabajo Wallach 1420. Introduzca la bomba en el tubo Falcon que contiene 0,2 micromolares de tampón de reacción ezine. Elija en el menú, la opción mantenimiento del dispensador y marque la bomba uno.
Seleccione la opción rellenar para editar el diseño de la placa. Elija la opción explorar el protocolo y los resultados en el menú. Seleccione el protocolo.
Ahora seleccione los pozos que se van a leer. Regrese al administrador de Wallach y haga clic en iniciar para medir las emisiones de muestra. A 482 nanómetros, proceda al mantenimiento del dispensador y seleccione vaciar y bombear uno para liberar toda la solución residual de vuelta al tubo.
Ahora mueva el tubo a un halcón que contiene agua y garrapata, enjuague. Continúe seleccionando vacío. A continuación, coloque el tubo de la bomba uno en el tampón de reacción y el tubo de la bomba dos en la solución LUCIFERINA.
Cambie el diseño de la placa. Seleccione el llenado para la bomba uno y la bomba dos. Desde el menú de mantenimiento del dispensador, seleccione el protocolo y comience a medir la longitud de onda de la reacción de luciferasa de luciferasa de luciérnaga de 560 nanómetros.
Al final de la repetición, repita el procedimiento, vacío, enjuague, vacío. Para la bomba uno y la bomba dos, vea los resultados en el Wallach 1420 Explorer. Cada experimento está asociado a un ensayo.
Número, nombre de usuario, fecha de inicio y finalización, exportar los resultados como un archivo de Excel. Para el análisis, el repliegue de proteínas está directamente relacionado con el tiempo de recuperación. En este experimento, las células se evalúan en diferentes puntos de tiempo después del choque térmico.
En ausencia y en presencia de chaperona molecular. Como era de esperar, el porcentaje de luciferasa replegada aumenta con el tiempo de recuperación prolongado tanto en los controles como en las células transfectadas con la chaperona molecular. Por el contrario, un conjunto de datos no válido muestra valores de R cuadrado deficientes para la correlación entre el tiempo y el repliegue.
Siguiendo esta técnica, se pueden realizar otros métodos, como el ensayo in vitro de TPAs, para responder a preguntas adicionales como la inhibición de la actividad enzimática del chaperona. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la proteína intracelular. Seguimos después del choque de enganche.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para medir el reensamblaje de proteínas intracelulares después de un choque térmico, centrándose en el papel de las chaperones moleculares. La actividad de la luciferasa de la luciérnaga sirve como reportero para evaluar la actividad de reensamblaje de las chaperones.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Plegamiento de proteínas
- Chaperones moleculares
Antecedentes
- Entender el reensamblaje de proteínas es crucial para la función celular.
- El choque térmico puede llevar al despliegue de proteínas, necesitando mecanismos de reensamblaje.
- Las chaperones moleculares ayudan en el proceso de reensamblaje.
- Los ensayos de luciferasa proporcionan una medida cuantitativa de la actividad de reensamblaje.
Propósito del estudio
- Medir el reensamblaje de proteínas intracelulares dependiente de chaperones.
- Investigar los efectos del choque térmico en la estructura de las proteínas.
- Utilizar la luciferasa como reportero para evaluar la actividad de las chaperones.
Métodos utilizados
- Transfección de células con plásmidos que contienen genes de luciferasa y chaperones.
- Puntos de tiempo de recuperación establecidos después de la transfección.
- Inducción de choque térmico para promover el despliegue de proteínas.
- Medición de la actividad de luciferasa para evaluar la eficiencia de reensamblaje.
Resultados principales
- Se observó un reensamblaje de proteínas dependiente del tiempo.
- La actividad de las chaperones fue confirmada a través de ensayos de luciferasa.
- Los resultados indicaron la efectividad de las chaperones en la recuperación de proteínas.
- Los datos apoyan el papel de las chaperones moleculares en las respuestas de estrés celular.
Conclusiones
- El método mide efectivamente el reensamblaje de proteínas después de un choque térmico.
- Los ensayos de luciferasa son una herramienta confiable para estudiar la actividad de las chaperones.
- Los hallazgos contribuyen a entender la homeostasis de proteínas en las células.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This intracellular refolding assay provides a cell-based readout for measuring molecular chaperone activity, enabling target validation in protein homeostasis pathways. By linking chaperone function to luciferase refolding, it supports mechanistic de-risking in oncology and neurodegeneration drug discovery. The assay facilitates compound screening for modulators of chaperone activity, informing lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chaperone-dependent protein refolding as a therapeutic hypothesis in stress response pathways.
- Operational Value: Provides a quantitative, luciferase-based readout for assessing chaperone function in live cells.
- Predictive Value: Supports target confidence by measuring compound effects on intracellular refolding activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds that inhibit or stimulate chaperone-mediated refolding.
- Operational Value: Uses a normalized dual-luciferase system (firefly/renilla) to control for transfection efficiency and variability.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chaperone involvement in cancer chemoresistance and neurodegeneration, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges target validation to functional assessment of chaperone activity in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on compound effects on proteostasis mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modulators of protein folding networks.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about chaperone function in intracellular refolding after heat shock-induced protein unfolding.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence readouts suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides time-dependent and chaperone-dependent refolding metrics for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical models where chaperones influence disease progression in cancer and neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing chaperone modulators across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures target engagement through functional refolding output, reducing mechanistic ambiguity in chaperone modulation.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using defined transfection and recovery protocols for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by identifying compounds with desired effects on proteostasis pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of chaperone-targeted candidates in oncology and CNS therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection and luciferase reporter assays.
- Dependent on luminometer compatibility for dual-wavelength luciferase detection.
- Necessitates standardized heat shock and recovery conditions across experimental batches.
- Adaptation to other chaperone-client pairs may require validation of refolding dependence.
- Limited to soluble, refoldable protein reporters like luciferase; not suitable for aggregation-prone clients without modification.
