Name: Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a cultivar neuronas simpáticas de ganglios cervicales superiores de ratas perinatales e inducir su crecimiento dendrítico mediante BMP-7 o Matrigel. Este protocolo permite manipular la morfología neuronal.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (subvenciones R21 NS45037 y ES014901 R01).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Las ventajas de este modelo incluyen: (a) los cultivos se compone de una población homogénea de las neuronas simpáticas desprovistos de otros tipos de células 17,23; (b) los requisitos del factor de crecimiento de las neuronas simpáticas son bien establecido, que permite el uso de un medio definido, y una variedad de medios definidos, y sustratos funcionan bien para el cultivo y el mantenimiento de las neuronas simpáticas 23, (c) las neuronas en estos cultivos responder de manera uniforme a la acti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 mm Cubreobjetos Ronda n º 1 de espesor, vidrio alemán </td></tr><tr><td> Bent punta de pipetas </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P0899-100MG </td><td> Solución madre de 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Agua destilada </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Bellas Dumont pinza no. 4 y 5 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 agujas de calibre </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz medio L-15 </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank (-Ca, Mg) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM baja la glucosa </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> La insulina / transferrina / selenio </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> De ácidos grasos libres de BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Harlan Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 nutriente medio (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Citosina arabinósido </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Evitar una repetición de ciclos hielo-deshielo </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc. </td><td> 345-BP-07H BMP7 </td><td> BMP 4, 5 y 6 funcionan igualmente bien como BMP-7 y son a veces más fácil de obtener comercialmente </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pescador </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-rata MAP2 anticuerpo </td><td> Sternberg Monoclonales Inc. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anti-ratón </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Medios de montaje </td><td> Prolongar sondas moleculares Antifade kit </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

La forma de la dendrítica cenador determina el total de entrada sináptica una neurona puede recibir 1-3, e influye en los tipos y la distribución de estas entradas 4-6. Alteración de los patrones de crecimiento dendrítico y la plasticidad se asocia con alteración de la función neuroconductual en modelos experimentales, 7, y se cree que contribuyen a los síntomas clínicos observados en los dos 8-10 trastornos del desarrollo neurológico y enfermedades neurodegenerativas 11-13. Estas observaciones ponen de relieve la importancia funcional de, precisamente, la regulación de la morfología dendrítica, y sugieren que la identificación de los mecanismos que controlan el crecimiento dendrítico no sólo avanzar en la comprensión de cómo la conectividad neuronal está regulada durante el desarrollo normal, pero también puede dar una idea de nuevas estrategias terapéuticas para diversas enfermedades neurológicas. Estudios sobre el mecanismo de crecimiento dendrítico se vería enormemente facilitada por la disponibilidad oFA modelo de sistema que permite que las neuronas de forma experimental pasó de un estado en el que no se extienden a las dendritas de aquel en el que la elaboración de un jardín dendríticas comparable a la de sus homólogos en vivo. Los cultivos primarios de neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de roedores perinatales proporcionar ese modelo. Cuando se cultiva en un medio definido en la ausencia de células gliales de suero y ganglionar, las neuronas simpáticas extender un único proceso que es axonal, y este estado unipolar persiste durante semanas o meses en cultivo 14,15. Sin embargo, la adición de proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o 16,17 Matrigel 18 al medio de cultivo desencadena estas neuronas para extender múltiples procesos que cumplen los criterios morfológicos y bioquímicos y funcionales para dendritas. Las neuronas simpáticas disociadas de la SCG de los roedores perinatales y cultivadas bajo condiciones definidas son una población homogénea de las neuronas 19que respondan de manera uniforme a la actividad de las dendritas se promociona de Matrigel, BMP-7 y otras BMPs de la decapentaplegic (DPP) y 60A subfamilias 17,18,20,21. Es importante destacar que Matrigel y BMP-inducida dendrita formación se produce en ausencia de cambios en la supervivencia de las células o el crecimiento axonal 17,18. Aquí se describe cómo configurar cultivos disociados de neuronas simpáticas derivadas de la SCG perinatales de las ratas para que sean sensibles a los selectivos de la dendrita de promoción de la actividad de Matrigel o BMP.

Se describe un protocolo para el uso de la proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o Matrigel para inducir de manera selectiva el crecimiento dendrítico en la enseñanza primaria neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de las ratas perinatales.

Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

La forma del árbol dendrítico determina la entrada sináptica total que una neurona puede recibir 1-3, e influye en los tipos y la distribución de dichas entradas...

El objetivo de este procedimiento es cultivar neuronas simpáticas para poder manipular su crecimiento dendrítico. Esto se logra primero aislado los ganglios cervicales superiores de crías de roedores perinatales bajo condiciones estériles. El segundo paso consiste en disociar los ganglios para formar una suspensión de células individuales que se siembran sobre los sustratos preparados.Medio definido Inde. Luego, después de tratar los cultivos con antimitótico para eliminar las células no neuronales, tratar los cultivos con BMP o matrigel para inducir el crecimiento dendrítico. Finalmente, se utiliza inmunorreactividad doble para mostrar las dendritas extendidas de las neuronas simpáticas en cultivo.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el cultivo primario de neuronas hipocampales es que es posible manipular el estado morfológico de las neuronas DYS de tal manera que menos del 5 % de las neuronas en cultivo tienen dendritas, o más del 95 % de las neuronas en cultivo exhiben un crecimiento neurítico robusto. Para preparar los cultivos asociados del ganglio cervical superior a partir de crías de rata prenatales entre los días 19 y 21 embrionarios, primero afeite el abdomen de una rata preñada sacrificada, limpie la piel con etanol al 70 % y luego retire los cuernos uterinos en condiciones estériles, evitando dañar los intestinos u otros órganos internos. Coloque los cuernos uterinos en una placa de Petri estéril de 150 milímetros. A continuación, transfiera la placa de Petri a un recipiente con hielo.Para anestesiar a las crías embrionarias y aplicar la eutanasia, corte la médula espinal a lo largo de la línea media por debajo de sus hombros. Esto también seccionará la vena cava, lo que reducirá el sangrado de la arteria carótida. Durante la disección del ganglio cervical superior, coloque los embriones en medio Leibovitz L-15 estéril suplementado con penicilina y estreptomicina. Luego transfiera los embriones a una placa de Petri de 150 milímetros, medio llena con Silgard, y colóquelos sobre sus espaldas.Utilice las agujas estériles de calibre 20 para fijar el tórax y la cabeza, hiperextendiendo suavemente el cuello para facilitar la disección del ganglio cervical superior bajo el microscopio. Realice una incisión media a lo largo del cuello al nivel de las clavículas para revelar las glándulas submandibulares. Retire las glándulas utilizando pinzas finas con el fin de exponer la capa muscular.Luego corte el músculo esternocleidomastoideo cerca de la clavícula, levantando suavemente el músculo omohioideo adyacente a la tráquea. Este músculo es muy delgado, por lo que evite cortar demasiado profundo, ya que podría romper la arteria carótida y el GCS subyacentes. Una vez eliminadas estas capas musculares, la arteria carótida y el nervio vago deben ser claramente visibles.El ganglio cervical superior se encuentra justo por debajo de la bifurcación de la arteria carótida. Diseque el tejido de ambos lados de la arteria carótida con pinzas finas para exponer el ganglio. Luego use dos pinzas finas para sujetar la arteria carótida justo por encima y por debajo de las lentes rostral y cordal del ganglio cervical superior, respectivamente.Para eliminar la sección de la arteria carótida que se encuentra por encima del GCS, así como el GCS mismo, es probable que también se elimine en este paso el ganglio de la lazada, que se encuentra junto al GCS en esta etapa del desarrollo. Coloque el tejido disecado en una placa de cultivo estéril de 35 milímetros que contenga medio L-15 y antibióticos. Después de eso, elimine el GCS de todas las crías antes de pasar a los siguientes pasos.A continuación, separe suavemente el ganglio cervical superior de la arteria carótida y de cualquier otro tejido. Retírelo durante la disección. Elimine la cápsula de los ganglios.Luego transfiera los ganglios a otro plato estéril de 35 milímetros que contenga medio L-15. Para disociar el GCS, retire el medio L-15. Reemplácelo con solución balanceada de Hank sin calcio ni magnesio y con colagenasa.Luego, incubar a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Después, transferir el SCG a un tubo cónico estéril de centrífuga de 15 mililitros. Aforar hasta un volumen de 10 mililitros con L-15 suplementado con BSA hasta una concentración final de uno a dos miligramos por mililitro.Centrifugar a 200 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos, deseche el sobrenadante y lávelo una vez más con L 15 suplementado con BSA tras el segundo lavado. Retire el medio L 15 y reponga los ganglios en dos mililitros de cultivo.Agite suavemente las células aproximadamente de tres a cuatro veces usando una pipeta con punta doblada y pulida con llama. Asegúrese de que la pipeta esté recubierta con BSAL 15 antes de la TRI para minimizar la adherencia de las células al vidrio. Deje reposar los grandes agregados durante aproximadamente un minuto, luego transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.Agregue posteriormente más medio de cultivo al SCG restante y al tri. Después de que los agregados se hayan sedimentado, transfiera la suspensión celular del segundo tri a la recolectada tras el primer tri. Repita este proceso varias veces hasta que los ganglios estén mayormente disociados.Descarte cualquier grumo restante después de la cuarta tri para las células disociadas de un litro de crías de rata; el volumen total del medio en la suspensión celular debe ajustarse a entre ocho y 10 mililitros. Añadiendo medio de cultivo adicional, resuspenda suavemente las células utilizando una pipeta. Luego, recoja una pequeña alícuota para la determinación de la densidad celular.Ajuste el volumen de la suspensión celular para alcanzar una densidad celular dos veces mayor a la deseada en el cultivo. A continuación, alícuota 250 microlitros de suspensión celular por pocillo. Para los estudios morfométricos del crecimiento dendrítico, por lo general sembramos las células en placas de 24 pocillos a baja densidad, aproximadamente cinco veces 10 a la cuatro células por pocillo.Luego, coloque los cultivos de SCG sobre la placa de porcelana para desecador dentro del desecador de vidrio que contiene agua estéril. Inyecte aproximadamente 120 mililitros de dióxido de carbono en el desecador antes de sellarlo herméticamente. A continuación, coloque todo el desecador en una incubadora y ajuste la temperatura a 35,5 grados Celsius.En este procedimiento, alimente la cultura intercambiando la mitad del medio 24 horas después de sembrarla y repita tres veces por semana para eliminar las células no neuronales de la cultura. El agente antimetótico, RRC, a una concentración de uno a dos micromoles, se agrega típicamente al medio de cultivo en este momento.Luego, agregue el medio de cultivo fresco con RSC a cada pocillo y cultive durante 48 horas para inducir el crecimiento dendrítico después de que se hayan eliminado las células no neuronales y el nivel de RSC se haya reducido significativamente. Agregue matrigel o BMP siete al medio de cultivo el día cinco. In vitro, alimente luego el cultivo como se describió previamente, mostrado aquí como una neurona cultivada bajo condiciones de control, con ausencia de dendritas evidenciada por la falta de procesos inmuno positivos para MAP dos.En contraste, esta neurona, que ha sido expuesta al BMP7, presenta varias dendritas inmunopositivas para MAP2 que se afilan, mostradas aquí. Las neuronas simpáticas cultivadas tienen entre cinco y siete días en cultivo antes del tratamiento con BMP7 y posterior tratamiento con BMP7 a 30-50 nanogramos por mililitro durante dos días. Observe el inicio del crecimiento dendrítico.Los cultivos crecidos durante siete a 14 días en ausencia de bmp.Seven continúan exhibiendo únicamente crecimiento axonal, mientras que los cultivos tratados con BMP.Seven a 30 a 50 nanogramos por mililitro durante siete a 14 días.Exhiben un crecimiento dendrítico robusto. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar el GCS. Preparar un cultivo disociado de neuronas simpáticas para los estudios de morfogénesis neuronal y manipular experimentalmente el crecimiento dendrítico.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este es un protocolo que describe cómo aislar y cultivar primaria neuronas simpáticas de los ganglios cervical superior (SCG) de las crías recién nacido.

Protocolo para las neuronas simpáticas de rata cultivo Ganglios cervical superior (SCG)

Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

Este video muestra un método in vitro para generar neuronas simpáticas postganglionares a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Las hPSCs se diferencian en células de cresta neural (NCCs) en un soporte de matriz de membrana basal utilizando un medio de diferenciación. A continuación, las NCC se disocian y se forman en esferoides utilizando otro medio de diferenciación. Finalmente, los esferoides se transforman en neuronas simpáticas postganglionares utilizando un medio de...

Generación de neuronas simpáticas postganglionares a partir de células madre pluripotentes humanas

El video demuestra el co-cultivo de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) con células de Schwann. Las neuronas DRG crecen primero en una membrana preestirada para el crecimiento de axones alineados. A continuación, se introducen las células de Schwann, que se adhieren a los axones, aislándolos y promoviendo la supervivencia y la función de las células neuronales.

Cocultivo de células de Schwann con neuronas DRG en una membrana preestirada

Este video demuestra el uso de células ganglionares de la raíz dorsal transfectadas para estudiar la liberación de neurotransmisores estimulándolos con un agonista del receptor de neuropéptidos.

Estimulación de las neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal mediante un agonista del receptor de neuropéptidos

El protocolo actual presenta procedimientos experimentales para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidad para liberar factores moleculares que promueven la consecuencia del neurite. Tratamiento de entrenamiento de los co-cultivos de neurona-macrófago induce a los macrófagos para producir medio condicionado que posee fuerte neurite consecuencia actividad.

Co-cultivos de neurona y macrófagos para activar macrófagos secretando factores moleculares con actividad Neurite consecuencia

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de las neuronas simpatizantes de ratas embrionarias de los ganglios cervicales superiores. También proporciona protocolos detallados para la tinción inmunocitoquímica y para la preparación de extractos neuronales para el análisis espectrométrico de masas.

Cultivar neuronas simpáticas de ratas de Ganglia cervical superior embrionario para análisis morfológico y proteómico

Aprenda a cultivar neuronas simpáticas de ganglios cervicales superiores de ratas perinatales e inducir su crecimiento dendrítico mediante BMP-7 o Matrigel. Este protocolo permite manipular la morfología neuronal.

Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

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