Name: VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprende a evaluar el sistema visual en larvas y adultos de pez cebra mediante el registro automatizado de movimientos oculares con VisioTracker. Este método permite identificar defectos visuales en mutantes y estudiar efectos farmacológicos.

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KPM fue apoyada por la UE del 7 º PM (RETICIRC).

1. La cría de peces Los embriones se mantienen y se crió en condiciones normales (Marca 2002) y por etapas de acuerdo al desarrollo de la fertilización días después (DPF). Adultos y larvas en 5 fdd fueron utilizados para las mediciones. 2. Procedimiento experimental <ol><li> Preparación de instrumentos </li></ol> Larvas: Las larvas fueron incorporados en el 3% de pre-calentado (28 ° C) metilcelulosa para evitar los movimientos del cuerpo. Los embriones fueron colocados lado dorsal en el VisioTracker, frente a la pantalla de proyección. Los peces adultos: Los peces fueron anestesiados brevemente en 300 mg / l MS-222, equipado en el dispositivo de inmovilización y se coloca en el VisioTracker. Antes de que se iniciaron las mediciones, se quedaron para recuperarse durante 1-2 min. <ol start="2"><li> Generación de patrones de estímulos </li></ol> Patrones de estímulos consiste en vertical, negro y blanco de onda senoidal rejillas girando alrededor de los peces fueron creados con el paquete de software propietario. Que puede ser modulada a través del paquete de software de acuerdo a la forma de onda, frecuencia de contraste, la intensidad, la velocidad angular y espacial. Los patrones fueron proyectadas sobre la pantalla con un proyector de luz digital contenida en el VisioTracker. La distancia aproximada entre el ojo del pez y la pantalla fue de 4,5 cm y tamaño de la proyección en pantalla era de 360 ​​grados en horizontal y 55 º verticalmente. Para larvas de peces, la dirección de la estimulación se alteró con una frecuencia de 0,33 Hz para reducir la frecuencia sacada. Los peces adultos fueron estimulados unidireccional y sólo el ojo estimulado en lo temporal a la dirección nasal se consideró, ya que nasal a temporal la velocidad del ojo en general es mucho menor y menos constante (se refieren a Mueller y Neuhauß, 2010). <ol start="3"><li> Grabación de los movimientos oculares </li></ol> Una imagen de campo claro de la cabeza del pez se alimenta a una cámara de video infrarroja. Iluminación de infrarrojos de los peces se llevó a cabo desde abajo. La cámara de imágenes grabadas a una velocidad de 5 fotogramas / segundo (larvas) o 12,5 cuadros / segundo (adultos), respectivamente. Las imágenes se procesan automáticamente, corregida y suavizada por la forma del ojo. La orientación del ojo en relación con el eje horizontal se determina automáticamente la velocidad del ojo y se calculó por el paquete de software propietario. Pequeños movimientos de los peces se han corregido de forma automática por el software. Todos los registros y análisis se logró en tiempo real. 3. Post-procesamiento de datos experimentales <ol><li> Mediciones brutas de las velocidades de los ojos fueron filtradas para sacadas con el fin de extraer lenta velocidad de fase. </li><li> Sacada con filtro de curvas de velocidad ojos se suavizaron por un promedio de ejecución con una ventana deslizante de 7 cuadros. </li><li> La velocidad promedio de atención fue sobre los marcos de las condiciones de estímulos idénticos. </li><li> Para larvas de peces, la velocidad del ojo fue un promedio de más de dos ojos. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Con el fin de evaluar las capacidades de la VisioTracker de peces en estado larvario y adulto, se realizaron experimentos con larvas de pez cebra a 5 dpf, y adultos de pez cebra. Para larvas de pez cebra, el mutante parachoques fue elegido. En este objetivo mutante, las células epiteliales hyperproliferate, lo que reduce el tamaño del objetivo y localización ectópica de la lente. Estas alteraciones morfológicas se reflejan en una reducción significativa de la sensibilidad al contraste y la agudeza visual (Schonthaler et al., 2010). La Figura 1 muestra la diferencia en la sensibilidad al contraste de los mutantes de parachoques frente a los hermanos de tipo salvaje. Mutantes parachoques cada vez menos para ajustar la velocidad del ojo a medida que disminuye el estímulo de contraste. Por analogía, cuando la frecuencia del estímulo espacial es mayor, es decir, el ancho de banda de estímulo se reduce, los mutantes parachoques también demuestran la agudeza visual reducida (Fig. 2) La dependencia de los adultos de pez cebra rendimiento visual de las condiciones ambientales fue investigado por someter a los peces a diferentes concentraciones de alcohol en el tanque de agua durante 30 minutos y, posteriormente, para medir la respuesta optocinético en condiciones diferentes estímulos. Adultos de pez cebra muestran una marcada reducción en la sensibilidad al contraste cuando se mantiene en la concentración de alcohol en aumento (Fig. 3). Un dependiente de la dosis similares de reducción de la velocidad total del ojo en un amplio rango de frecuencias espaciales se pudo observar que los peces fueron tratados con concentraciones de alcohol en aumento (Fig. 4). Tratamiento de alcohol, además, dependiendo de la dosis reduce el rendimiento oculomotor en tareas más exigentes como lo demuestra una velocidad mayor estímulo (Fig. 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig1.jpg" /> Figura 1. La velocidad de pez cebra ojo de larvas depende de la diferencia de estímulo. 10 mutantes parachoques y 10 hermanos de tipo salvaje se analizaron en 5 fdd en diversas stimulus condiciones banda de contraste. El gráfico muestra la velocidad media del ojo ± 1 SEM. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig2.jpg" /> Figura 2. La velocidad de pez cebra ojo de larvas depende de la frecuencia espacial. 10 mutantes parachoques y 10 hermanos de tipo salvaje fueron sometidos a diferentes anchos de banda de estímulo a las 5 fdd y analizados como se describe. El gráfico muestra la velocidad media del ojo ± 1 SEM. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig3.jpg" /> Figura 3. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración en la reducción de la sensibilidad al contraste. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y se analizaron en diferentes condiciones de contraste de estímulo de banda. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg" /> Figura 4. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración de reducción en el movimiento del ojo en general en un amplio rango de ancho de banda de estímulo. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y analizada bajo diferentes condiciones de ancho de banda de estímulo. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3556/3556fig5.jpg" /> Figura 5. Adultos alcohol muestran pez cebra dependiente de la concentración de reducción en el movimiento del ojo en general en un amplio rango de velocidades de estímulo. Adultos de pez cebra se han mantenido en diferentes concentraciones de alcohol como se indica durante 30 minutos y se analizaron en diferentes condiciones de estímulo de velocidad. El gráfico muestra el promedio temporal a nasal velocidad ojos ± 1 SEM de 9 de los peces por grupo (excepto el grupo de control: n = 11).

<ol><li>Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fade+out+mutant+is+a+novel+genetic+model+for+Hermansky-Pudlak+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Optical+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome.</a> Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrumentation+for+measuring+oculomotor+performance+and+plasticity+in+larval+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms.</a> Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).</li>
<li>Brand, M. G. M., Nüsslein-Vollhard, C. Keeping and raising Zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+MGM+%22Zebrafish%2C+Practical+Approach+Series%22">Zebrafish, Practical Approach Series</a>. Nüsslein-Vollhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+vision+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of vision in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+eye+movements+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio).</a> Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).</li>
<li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+in+zebrafish%3A+behavior+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Zoology%22%5BJournal%5D)">Visual acuity in zebrafish: behavior and histology.</a> Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optokinetic+response+in+zebrafish+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The optokinetic response in zebrafish and its applications.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).</li>
<li>Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+tuning+by+visual+feedback+of+the+stability+of+a+neural+integrator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).</li>
<li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurements+of+the+optokinetic+response+in+adult+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish.</a> J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).</li>
<li>Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+vision+revealed+by+a+behavioral+screen+of+400+essential+loci+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish.</a> J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).</li>
<li>Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+asymmetries+in+the+optokinetic+response+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish.</a> Zebrafish. 2, 189-196 (2005).</li>
<li>Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+arrestin+confers+cone+vision+of+high+temporal+resolution+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).</li>
<li>Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optokinetic+behavior+is+reversed+in+achiasmatic+mutant+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae.</a> Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).</li>
<li>Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+sensitivity%2C+spatial+and+temporal+tuning+of+the+larval+zebrafish+optokinetic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 Forthcoming.</li>
<li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cone+specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone-response+recovery+and+delayed+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li>
<li>Roeser, T., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visuomotor+behaviors+in+larval+zebrafish+after+GFP-guided+laser+ablation+of+the+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum.</a> J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).</li>
<li>Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+mutant+leberkn+del%2Fvam6+resembles+human+multi-systemic+disorders+caused+by+aberrant+trafficking+of+endosomal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles.</a> Development. 135, 387-399 (2008).</li>
<li>Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+mutant+bumper+shows+a+hyperproliferation+of+lens+epithelial+cells+and+fibre+cell+degeneration+leading+to+functional+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness.</a> Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).</li>
<li>Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. von, Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+pmel17+gene+leads+to+defects+in+melanosome+biogenesis+and+alterations+the+visual+system+in+the+zebrafish+mutant+fading+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision.</a> Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).</li>
</ol>

Oliver DR Schnaedelbach y Holger D. Russig son empleados del TSE Systems GmbH que produce el sistema de seguimiento del rendimiento visual utilizados en este artículo. La producción de este artículo fue patrocinado por TSE Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass es un empleado de la Universidad de Zurich, que recibe una remuneración por los sistemas de TSE para cada sistema vendido.

La importancia de la okr para el estudio de la función visual ha sido reconocido en la comunidad científica desde hace mucho tiempo (Semana Santa y Nicola 1996, 1997), y los intentos de cuantificar realmente el paradigma de haber comenzado más de una década atrás. Semana Santa y Nicola (1996) desarrolló un sistema motorizado con tambores rotativos de rayas, donde se analizó la grabación de vídeo de movimiento de los ojos de forma manual. Este sistema sufrió de la falta de inmovilización de los embriones de pez, que requiere reposición manual frecuente, y puede detectar los movimientos de seguimiento de los ojos sólo con gran dificultad. Un paso adelante fue el uso de un tambor rayado video-proyectado para permitir una mayor presentación de estímulos variables generadas por ordenador (Roeser y Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a). La mayor parte manual, cuadro a cuadro el análisis de grabaciones en vídeo ha demostrado ser extremadamente difícil, y hasta cierto punto, obstaculizado por el sesgo del observador (Beck et al., 2004). El análisis automatizado en tiempo real, se sugirió que se permita el uso de mecanismos de retroalimentación del comportamiento de aprendizaje (al Mayor et al., 2004). El uso de la iluminación infrarroja y la frecuencia de los estímulos controlados de rotación ha sido promovida por Beck et al. (2004). Sin embargo, el sistema descrito no sólo se ha utilizado para las larvas, y el análisis se llevó a cabo fuera de línea. Además, el VisioTracker permite un control completo sobre los estímulos, incluyendo el cambio de los estímulos durante el experimento, lo que permite una mayor flexibilidad y la influencia espontánea en el transcurso del experimento. Además, la creación de estímulo digital utilizado por el VisioTracker superó los problemas mencionados anteriormente con la aceleración de la masa inerte de un tambor de estímulo a rayas (Beck et al., 2004). Restricción de las larvas de metilcelulosa no interfiere significativamente con el movimiento del ojo y no tiene ningún efecto a largo plazo sobre el bienestar del pez cebra. Las larvas de peces se han mantenido con éxito incrustado en metilcelulosa durante varios días, hasta el suministro de oxígeno a través de la piel se vuelve insuficiente para la demanda que aumenta la edad (Qian et al., 2005). El método de restricción de peces adultos es igual de fácil en el animal. La corta duración del experimento, junto con la opción de intercambiar rápidamente el animal de experimentación para uno diferente, se suma a los aspectos de bienestar de los animales positivos del sistema. Desde las branquias están continuamente bañadas por el agua, es conveniente pico el agua con cualquier producto químico de elección para estudiar su efecto sobre los movimientos de los ojos y el rendimiento visual. Del mismo modo un experimento de lavado se puede añadir sin la necesidad de manejar el animal entre los experimentos. Ruido de los píxeles de la imagen de vídeo se ha minimizado por los algoritmos de suavizado del software VisioTracker de propiedad, lo que permite mediciones de alta precisión de la posición del ojo y la velocidad angular. Además, para facilitar el análisis estadístico, el software filtra los movimientos sacádicos que se producen a una velocidad fija y que no contribuyen a la declaración experimental. El promedio de curvas de velocidad de más de 7 fotogramas de vídeo facilitado su posterior análisis. El VisioTracker abre una nueva dimensión para muchos campos de investigación variados. El sistema y sus predecesores ya han sido utilizados con éxito para cuantificar el rendimiento visual en larvas de pez cebra, utilizando parámetros como la agudeza visual, sensibilidad al contraste y la adaptación a la luz (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), para el análisis funcional de conos siguientes manipulación de los miembros de la cascada de transducción visual (por ejemplo, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), o el análisis de los defectos visuales en las larvas de pez cebra mutante (por ejemplo, Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). La interdependencia de la maduración morfológica y funcional del sistema visual ha sido estudiado por las mediciones okr para mostrar que la agudeza visual es todo, pero no completamente limitado por espacio de fotorreceptores en la etapa larval (Haug et al., 2010). El VisioTracker es adecuado para analizar la función visual en adultos de pez cebra y otras especies de peces de tamaño parecido (Mueller y Neuhauß (2010), este informe). También es concebible utilizar el sistema en áreas de investigación tales como la toxicología o farmacología que las sustancias a investigar podrían añadirse al flujo de agua alrededor de las branquias de peces adultos. Además, la versatilidad de VisioTracker permite realizar análisis más a fondo, por ejemplo, de ontogenetics de la función visual, la función de circuitos neuronales y el desarrollo, o sensitivomotora de control (véase la revisión de Huang y Neuhauß, 2008).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Metilcelulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> El 3-aminobenzoato metanosulfonato (MS-222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> 35 mm placa de cultivo celular </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Suero de la pipeta </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 612 361 </td></tr><tr><td> VisioTracker </td><td> TSE Sistemas </td><td> 302060 </td></tr></tbody></table>

visiotracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Las investigaciones sobre el desarrollo del sistema visual y la función necesario cuantificar los modelos de comportamiento de los resultados visuales que son fáciles de obtener, robusto y fácil de manipular. Un modelo adecuado se ha encontrado en la respuesta optocinético (okr), un comportamiento reflexivo presente en todos los vertebrados, debido a su valor de alta selección. El okr implica lento siguientes estímulos movimientos de ojos rápidos alternados con movimientos sacádicos reposición. La medición de este comportamiento es fácil de llevar a cabo en las larvas de pez cebra, debido a su aparición temprana y estable (completamente desarrollado después de 96 horas después de la fecundación (HPF)), y se benefician de los conocimientos a fondo sobre el pez cebra genética, desde hace décadas uno de los modelos favorecidos organismos en este campo. Mientras tanto, el análisis de mecanismos similares en peces adultos ha adquirido mayor importancia, particularmente para aplicaciones farmacológicas y toxicológicas. A continuación se describe VisioTracker, un sistema totalmente automatizado, de alto rendimiento del sistema de análisis cuantitativos de rendimiento visual. El sistema se basa en investigaciones llevadas a cabo en el grupo del Prof. Stephan Neuhauß y fue re-diseñado por Sistemas de EET. Se trata de un dispositivo de inmovilización para los peces pequeños controlados por una cámara de vídeo de alta calidad, equipado con una lente de zoom de alta resolución. El contenedor de pescado está rodeado por una pantalla de tambor, en el que los patrones generados por computadora estímulo puede ser proyectada. Los movimientos del ojo se registran y analizan de forma automática por el paquete de software VisioTracker en tiempo real. El análisis de datos permite el reconocimiento inmediato de parámetros tales como la duración de la fase lenta y rápida, la frecuencia del ciclo de movimiento, el aumento lento de la fase, la agudeza visual y la sensibilidad al contraste. Los resultados típicos permiten, por ejemplo, la rápida identificación de los mutantes del sistema visual que no muestran ninguna alteración evidente en la morfología de tipo salvaje, o la determinación de los efectos cuantitativos de agentes farmacológicos o tóxicos y mutagénicos en el rendimiento del sistema visual.

El VisioTracker es un sistema automatizado para el análisis cuantitativo de los resultados visuales de peces adultos de larvas y pequeños basados ​​en el registro de los movimientos oculares. Cuenta con un control total sobre propiedades de los estímulos visuales y análisis en tiempo real, permitiendo la investigación de alto rendimiento en áreas como el desarrollo del sistema visual y la función, la farmacología, los estudios neuronales del circuito y la integración sensoriomotora.

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Las investigaciones sobre el desarrollo y la función del sistema visual requieren modelos conductuales cuantificables del rendimiento visual que sean fáciles de provocar, ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar conductualmente la función del sistema visual en larvas y peces cebra adultos con el fin de identificar rápidamente larvas mutantes con defectos en el sistema visual o para comparar las propiedades del sistema visual entre animales de tipo silvestre y mutantes, o tratados con morfolinos. Esto se logra primero restringiendo los movimientos corporales del animal experimental. Las larvas se incrustan en metilcelulosa y los peces adultos son anestesiados y colocados en un dispositivo de inmovilización.A continuación, coloque al animal inmovilizado en el Vizio Tracker en el centro de una pantalla con forma de tambor. Rayas verticales blancas y negras se proyectan sobre el interior de esta pantalla mediante un proyector digital de luz. Las posiciones oculares se registran y analizan automáticamente mediante el paquete de software Vizio Tracker, que también calcula las velocidades oculares en tiempo real.El paso final consiste en procesar los datos obtenidos, relacionar las velocidades oculares con las propiedades del estímulo visual y calcular la velocidad ocular promedio y el error estándar para cada condición experimental. Aunque este método puede proporcionar información sobre las propiedades del sistema visual de peces cebra larvales y adultos, también puede aplicarse a otros organismos modelo como medica, kpi y prácticamente cualquier otra especie pequeña de T. Tuve por primera vez la idea de este método cuando utilizamos la respuesta óptica cinética para seleccionar larvas de plantas y rápidamente nos interesamos por los datos de las larvas, que no eran completamente ciegas, sino más bien con discapacidad visual.Estas larvas de pez potencialmente afectan aspectos del procesamiento visual. El sistema incluye un dispositivo de inmovilización para peces pequeños colocado bajo una cámara de video de alta calidad, equipada con un objetivo de zoom. El recipiente del pez está rodeado por una pantalla cilíndrica sobre la cual se proyectan patrones de estímulo generados por computadora.Los movimientos oculares se registran mediante la cámara y se analizan automáticamente en tiempo real por el paquete de software Vizio Tracker. Para prevenir el movimiento corporal durante la grabación, embeba larvas de pez a los cinco días post-fecundación en Metilcelulosa al 3 % que haya sido calentada a 28 grados Celsius. Vierta la metilcelulosa caliente en una placa de cultivo celular de 35 milímetros y luego transfiera las larvas utilizando una pipeta de suero con un gancho grande.Mezcle las larvas en la metilcelulosa, luego use una aguja pequeña para eliminar las burbujas de aire y para posicionar la larva; se pueden preparar hasta ocho larvas simultáneamente para los experimentos. Una vez que las larvas estén inmovilizadas, coloque el recipiente de cultivo celular en un soporte para ocho recipientes. A continuación, comience a proyectar las franjas de estímulo sobre el tambor circundante para inmovilizar los peces adultos.Primero, anestesie brevemente los peces con 300 miligramos por litro de MS 222 en un tanque aparte. Una vez anestesiados, coloque el pez en el dispositivo de inmovilización sujetando suavemente el cuerpo del pez entre dos trozos de esponja adecuadamente. Restringir los movimientos corporales de los peces adultos es el paso más difícil de este procedimiento.Para facilitar la inserción en el dispositivo de inmovilización, estabilice la esponja mediante dos tubos plásticos cilíndricos. Una vez inmovilizado el pez, coloque el dispositivo en el rastreador Vizio y permita que el pez se recupere durante uno o dos minutos antes de comenzar la grabación. Para proporcionar un estímulo para el movimiento ocular, proyecte un patrón de estímulo generado por software que consiste en franjas sinusoidales verticales en blanco y negro sobre la pantalla cilíndrica.Utilizando el proyector de luz digital contenido dentro del rastreador Vizio, ilumine el pez desde abajo con luz infrarroja y luego use el paquete de software para registrar los movimientos oculares en respuesta al patrón de estímulo. Los mutantes larvales bumper presentan un tamaño reducido del cristalino y una ubicación ectópica del mismo, y estas alteraciones morfológicas se reflejan en una reducción significativa de la sensibilidad al contraste en comparación con el tipo silvestre. Como se muestra aquí, los mutantes bumper fallan cada vez más en ajustar la velocidad ocular a medida que disminuye el contraste del estímulo.Además, cuando la frecuencia espacial del estímulo aumenta al disminuir el ancho del estímulo, los mutantes stripe bumper también muestran una agudeza visual reducida en comparación con sus hermanos de tipo silvestre. Los peces cebra adultos de tipo silvestre muestran una reducción notable en la sensibilidad al contraste cuando se mantienen en concentraciones crecientes de alcohol durante 30 minutos antes de la grabación. Se observa una reducción similar, dependiente de la dosis, en la velocidad ocular general en un amplio rango de frecuencias espaciales cuando los peces son tratados con concentraciones crecientes de alcohol.El tratamiento con alcohol también reduce independientemente el rendimiento oculomotor en tareas más exigentes, como se muestra aquí en respuesta al aumento de la velocidad del estímulo tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación de la visión exploraran el desarrollo y la función del sistema visual en el pez cebra, el pez dorado médico y otros organismos modelo, utilizando modelos tanto genéticos como farmacológicos.

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