La detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante Flujometría fotoacústica

El objetivo del siguiente experimento es detectar la presencia de cáncer antes de la formación de tumores secundarios. Esto se logra primero obteniendo y separando muestras de sangre de pacientes con melanoma en estadio cuatro. Como segundo paso, se introduce la sangre en una cámara de flujo fotoacústica, lo que permite la detección y aislamiento de células de melanoma.

A continuación, se obtienen imágenes de las células capturadas para confirmar la presencia de melanoma detectado. Los resultados muestran la capacidad del sistema para detectar y aislar con precisión y rapidez células de melanoma basándose en formas de onda fotoacústicas y técnicas de imagen celular. La principal ventaja de nuestra técnica frente a los métodos existentes que detectan células de melanoma circulantes, como la R-T-P-C-R, la clasificación magnética de células y otros métodos, es que nuestro método es libre de marcadores y permite la captura de células de melanoma circulantes sin alterar su superficie ni fijarlas a un sustrato.

Para preparar una muestra para la detección de cáncer metastásico, comience por extraer aproximadamente 10 mililitros de sangre completa de un paciente con cáncer en estadio cuatro. En dos tubos vacutainer de cinco mililitros, centrifugue las muestras durante 10 minutos a 3000 RPM. La muestra de sangre se separará en tres capas diferentes. La capa inferior está compuesta por los eritrocitos.

La capa media, también llamada capa de coágulo, contiene leucocitos y células de melanoma, y la capa superior contiene plasma y plaquetas. Retire la mayor cantidad posible de plasma sin perturbar la capa de coágulo. Añada 250 microlitros de su solución opaca 10 77 a tubos cónicos de dos mililitros.

Utilizando una pipeta de pastel de nueve pulgadas, extraiga el plasma restante, toda la capa de células blancas (Buffy coat) y la capa superior de eritrocitos, asegurándose de recolectar menos de 500 microlitros. Transfiera la solución a los tubos de ensayo previamente preparados.

La sangre volverá a separarse, pero esta vez los eritrocitos quedarán separados por el hispa, lo que permitirá la extracción fácil de la capa leucocitaria. Utilice una pipeta Pesa de nueve pulgadas para aislar toda la capa leucocitaria y colóquela en un tubo eppendorf de dos mililitros. Luego, suspenda en 1,5 mililitros de PBS con 2% volumen por volumen entre 20.

Para construir una cámara de flujo, comience con un cilindro de acrílico de ocho milímetros de largo, con un diámetro exterior de 20 milímetros y un diámetro interno de 17 milímetros. A continuación, taladre tres orificios de cinco milímetros de diámetro a través del lateral del cilindro, dispuestos a 90 grados de separación entre sí. Luego, corte tres trozos de tubo polimérico e insértelos en los orificios perforados.

Estirar la película de parafina a través de la parte inferior del anillo de acrílico para crear un sello hermético. La película de parafina formará un recipiente poco profundo junto con el anillo de acrílico y contendrá la solución de acrilamida que formará la cámara de flujo. Suspender un alambre de 1.6 milímetros de diámetro a través de los trozos de tubo directamente opuestos entre sí, asegurándose de que solo el alambre sea visible a través del centro del anillo hacia el tercer trozo de tubo.

Inserte un alambre de 1.6 milímetros de diámetro y coloque el tubo a un milímetro de distancia del alambre suspendido. Estos alambres evitan que la acrilamida entre en el tubo. Prepare cinco mililitros de acrilamida.

Luego, vierta rápidamente la mezcla en el anillo de acrílico, llenándolo hasta arriba. Después de unos segundos, la solución formará un gel. Para fabricar un molde de cámara de flujo, retire cuidadosamente los alambres asegurándose de no perturbar el gel de acrilamida, dejando un camino de flujo cilíndrico y un lugar para colocar una fibra óptica enfocada hacia el camino de flujo.

La cámara de flujo ya está lista para usarse con gel acústico de ultrasonido. Acople un transductor acústico piezoeléctrico de fluoruro de polivinilideno directamente encima del recorrido del flujo en la cámara de flujo. Utilizando un cable bayoneta neumático o BNC, conecte el transductor a la entrada de un receptor de banda ancha.

Conecte la salida del filtro al osciloscopio para activar el disparo del osciloscopio. Coloque un fotodiodo cerca del transductor y utilice un cable BNC para conectarlo al osciloscopio. Extraiga el tubo pequeño de la cámara de flujo hasta que se forme un pequeño bolsillo de aire y acóplelo al transductor.

Luego inserte la fibra óptica y llene el bolsillo con agua para reducir las señales de interfaz y aumentar la cantidad de luz láser aplicada al camino de flujo. Debido a la apertura numérica de la fibra óptica y la corta distancia hasta el camino de flujo, el láser solo irradiará un tapón de muestra a la vez, asegurando que la muestra directamente frente al láser sea la misma que genera las señales fotoacústicas.

A continuación, conecte un conector en T a uno de los brazos de la cámara de flujo y dos bombas de jeringa a las otras ramas del conector. Una jeringa contiene aire, mientras que la otra contendrá la suspensión celular previamente preparada. Luego, inicie ambas bombas de jeringa.

Cuando los dos fluidos admisibles alcancen la unión en T, se dividirán en glóbulos homogéneos y fluirán más allá del transductor. Irradie la muestra en flujo con un láser de pulsos nanosegundo para generar ondas fotoacústicas en las células de melanoma. Dado que la melanina es un absorbente óptico de banda ancha, se puede utilizar cualquier longitud de onda láser visible.

Una señal que aparece en el osciloscopio cuando un fragmento está sobre el transductor indica que el fragmento contiene melanoma. Sígalo a través del sistema antes de depositarlo en un vial de recolección. Para preparar muestras para inmuno citología, coloque portaobjetos de vidrio en embudos citológicos y colóquelos en el citocentrífugo para centrifugar y ayudar a que las células retenidas se adhieran a los portaobjetos.

Ponga 100 microlitros de BSA al 1 % en PBS en cada embudo. Luego, centrifugue a 600 RPM durante tres minutos. Después de la centrifugación, agregue las muestras celulares a los embudos para CyTOF y luego centrifugue a 600 RPM durante tres minutos.

Rocíe las laminillas con un fijador a base de etanol. Luego lave las laminillas en PBS durante 10 minutos, dos veces, para bloquear la unión no específica. Incube cada laminilla con una mezcla de 10 microlitros de suero de cabra y 90 microlitros de PBS durante una hora a temperatura ambiente.

Después de la incubación, vierta cuidadosamente las laminillas y agregue la solución de anticuerpo primario. Cada laminilla debe contener 1% de suero de conejo, 1% de anticuerpo anti-CD45 de ratón y 10% de suero de cabra en PBS, e incubar durante una hora en una cámara humedecida a temperatura ambiente. A continuación, lave las laminillas con PBS durante 10 minutos, tres veces.

Luego, incubar las laminillas con los anticuerpos secundarios fluorescentes apropiados en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente y verter el contenido de las laminillas. A continuación, lavarlas en PBS durante cinco minutos, tres veces, para teñir los núcleos; incubar las células con 0,1 microgramos por mililitro de DPI durante un minuto. Luego, verter las laminillas y lavar con PBS.

Finalmente, utilice un medio de montaje a base de resina para montar una laminilla sobre la muestra celular, selle la laminilla con esmalte transparente e image con un microscopio fluorescente. Las formas de onda fotoacústicas provenientes de los glóbulos blancos y las células de melanoma se muestran aquí a la izquierda. Los glóbulos blancos, que no poseen pigmentación inherente, no producen ondas fotoacústicas y se manifiestan como una línea plana de ruido electrónico a la derecha.

Sin embargo, las células de melanoma pigmentadas producen una onda fotoacústica intensa. Después de la inmuno citocitoquímica, las células de melanoma cultivadas teñidas químicamente muestran señales puntiformes en azul, una de ellas marcada se resalta en verde superpuesta a las imágenes de DPI y mart-1 con CD45 como indicador de leucocitos. Esta figura muestra células de melanoma entre varios glóbulos blancos tras su desarrollo.

Nuestra técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la detección del cáncer exploren el fenómeno de la metástasis, con el fin de mejorar la detección del cáncer y, en última instancia, curar su propagación fatal.