Name: La detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante Flujometría fotoacústica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprende a detectar células de melanoma circulantes mediante flujometría fotoacústica sin marcadores. Este método permite identificar células cancerosas antes de la formación de tumores secundarios en pacientes con melanoma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Queremos agradecer el apoyo del Departamento de Ingeniería Biológica y la Christopher S. Bond Vida del Centro de Ciencias de la Universidad de Missouri. Reconocemos el apoyo beca de Missouri Ciencias de la Vida de Investigación 09-1034 Junta y los NIH R21CA139186-0. También agradecemos a la Ciencias de la Vida cursos del Programa de Oportunidades de Investigación de la Universidad de Missouri, la Universidad de Missouri moleculares básicos de Citología, y la Universidad de Missouri Facultad de Ingeniería de apoyo financiero.

1. Preparación de muestras de sangre <ol><li> Dibuja aproximadamente 10 ml de sangre total de un paciente de cáncer en etapa IV en dos vacutainers 5 ml. </li><li> Centrifugar los tubos durante diez minutos a 3.000 revoluciones por minuto (rpm). </li><li> La muestra de sangre se separa en tres capas diferentes: la capa inferior comprende los eritrocitos, la capa intermedia, llamada también la capa leucocitaria, contiene leucocitos y las células del melanoma, y la capa superior contiene el plasma y las plaquetas. Eliminar el plasma tanto como sea posible sin afectar la capa leucocitaria. </li><li> Colocar 250 ml del Histopaque 1077 en dos tubos de 1 ml Wintrobe. </li><li> El uso de un 9 pipeta &quot;Pasteur, extraer el plasma restante, toda la capa leucocitaria, e incluso la capa superior de los eritrocitos, asegurándose de recoger &lt;500 mL. </li><li> Ponga la solución encima de la capa Histopaque y centrifugar los tubos Wintrobe en 15 ml tubos cónicos de 10 minutos a 3000 rpm. </li><li> La sangre de nuevoseparados, pero esta vez los eritrocitos serán separados por la Histopaque, lo que permite una fácil extracción de la capa leucocitaria. Use un 9 &quot;con una pipeta Pasteur para obtener toda la capa leucocitaria y colocarlo en un tubo de 2 ml eppendorf. </li><li> Suspensión de la capa leucocitaria en 1,5 ml de PBS con un 2% v / v de Tween 20. </li></ol> 2. Flujo de Cámara de Construcción <ol><li> Obtener un cilindro de acrílico, 20 mm de diámetro exterior, diámetro interior 17 mm y 8 mm de alto. Perforar tres agujeros de 5 mm de diámetro a través del lado del cilindro en ángulos de 90 grados uno del otro. Corte tres piezas de tubo de polímero (1,6 mm de diámetro interior, 5 mm de diámetro exterior), y colocarlos en los agujeros perforados. </li><li> Parafilm tramo en la parte inferior del anillo de acrílico para hacer un sello impermeable. La parafina forma un recipiente poco profundo con el anillo de acrílico y llevará a cabo la solución de acrilamida que se forma una cámara de flujo. </li><li> Suspender a un alambre de 1,6 mm de diámetro a través de las piezas de tubería que están al otro lado de laentre sí, asegurándose de que el cable solo es visible a través del centro del ring. Llene la tercera pieza de tubo con un alambre de 1,6 mm de diámetro y la posición del tubo de 1 mm de distancia del cable de suspensión. Estos cables impiden la acrilamida de entrar en el tubo. Después de que la acrilamida se solidifica, los cables se extrae, dejando un camino de flujo cilíndrica y un lugar para colocar una fibra óptica se centra en la trayectoria del flujo. </li><li> Añadir 5 ml de acrilamida preparados [20 g de acrilamida (Sigma Aldrich), 0,7 g de bisacrilamida (Sigma Aldrich), 100 ml de agua destilada] a un vaso pequeño. Medir 0,02 g de persulfato de amonio (Sigma) y agregarlo a la jarra. Mezcle con una barra de agitación durante 3 minutos. Añadir 20 l tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) en el vaso. Rápidamente vierta la mezcla en el anillo de acrílico, relleno de la parte superior. Después de unos segundos, la solución de gel, haciendo un molde de la cámara de flujo. Con cuidado, tire de los cables fuera, con cuidado de no perturbar el gel de acrilamida. El flujo de Chambre ya está listo para su uso. </li></ol> 3. Flujometría fotoacústica set-up <ol><li> Acústicamente un transductor de par fluoruro de polivinilo acústico piezoeléctrico (Panametrics) a una cámara de flujo, utilizando gel de ultrasonidos directamente sobre la trayectoria del flujo. </li><li> El uso de un Bayoneta, Neill-Concelman (BNC) de cable, conectar el transductor a la entrada de un receptor de banda ancha Ritec-640A (filtro de paso bajo: hacia fuera, filtro de paso alto: 1 MHz, llave de entrada Impedancia: 50 Ohms, la amplificación: 35 dB). Conecte la salida del filtro para el osciloscopio (Tektronix TDS 2024B). Para activar el osciloscopio, un fotodiodo (Thorlabs) se encuentra cerca del transductor y se enchufa en el osciloscopio mediante un cable BNC. </li><li> Un conector en T (piezas pequeñas) se une a un brazo de la cámara de flujo. Dos bombas de jeringa (Braintree Científico) están conectados a las otras ramas del conector. Una jeringa contiene aire, mientras que el otro contendrá la suspensión celular preparada en la parte 1. Fijar las tasas de flujo para100 L / minuto. </li><li> Extraer el tubo pequeño de la cámara de flujo hasta una pequeña bolsa de aire de las formas, e insertar un 1 mm de diámetro núcleo de fibra óptica con una apertura numérica 0,37 en esa ranura. Llene la bolsa con agua para reducir las señales de interfaz y aumentar la cantidad de luz del láser aplicado a la trayectoria del flujo. Debido a la apertura numérica de la fibra óptica ya muy poca distancia de la trayectoria del flujo, el láser sólo irradian una babosa de la muestra en un momento dado, asegurando que la muestra directamente en frente del láser es la misma muestra la creación de señales fotoacústica. La energía del láser debe ser de aproximadamente 28 mJ / cm 2, con un tamaño de spot de 7 mm 2. </li><li> A su vez las dos bombas de jeringa. Cuando los dos fluidos inmiscibles llegar al cruce que se dividirá en las babosas homogénea y el flujo más allá del transductor. </li><li> Irradiar la muestra fluye con un nanosegundo láser pulsado para generar ondas de fotoacústica en las células del melanoma. Como la melanina es un broadby ópticos de absorción, cualquier longitud de onda de láser visible puede utilizarse. </li><li> Si aparece una señal en el osciloscopio cuando una bala está en la cima del transductor, la babosa contiene melanoma, y ​​deben ser seguidos a través del sistema hasta caer en un vial de recogida. </li></ol> 4. Inmunocitoquímica <ol><li> Tome las babosas capturadas en una centrífuga Cytospin 4 (Thermo Scientific) con el fin de fijar las diapositivas de cristal. Colocar los portaobjetos de vidrio en Cytofunnels (Shandon Cytofunnel EZ Individual con Tarjeta de Brown filtro Thermo Scientific) y cargar en la Cytospin 4 centrífuga. Ponga 100 L de bovino al 1% de albúmina sérica (Sigma) en PBS en cada embudo y centrifugar a 600 rpm durante 3 minutos para ayudar a las células capturadas se adhieren a las diapositivas de cristal. </li><li> Después de la centrifugación, añadir las muestras de células de la Cytofunnels y luego se centrifuga a 600 rpm durante 3 minutos. Luego rocíe las diapositivas con un fijador de etanol a base. </li><li> Se lavan los portas en PBS durante 10 minutos dos veces. </li><li&gt; para bloquear la unión inespecífica, se incuba cada diapositiva con una mezcla de 10 l de suero de cabra (Sigma) y 90 l de PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Después de la incubación, se decanta de las diapositivas y se incuban con la solución de anticuerpo primario durante 1 hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Cada diapositiva debe contener 1% MART-1 anticuerpo producido en conejo, el 1% de CD-45 anticuerpo en ratones, el 10% de suero de cabra, y el 89% PBS. </li><li> Después de la incubación, lavar los portaobjetos en PBS durante 10 minutos tres veces. </li><li> Las diapositivas se incuban en una solución de anticuerpo secundario, que ha fluoróforo unido a los anticuerpos. La mezcla contiene 0,05% de cabra anti-conejo de anticuerpos, 0,05% de anticuerpo de cabra anti-ratón, el 0,1% de suero de cabra, y el 99% PBS. Los portas se incuban en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Después de la incubación, se decanta de las diapositivas de lavado en PBS durante 5 minutos, tres veces. </li><li> Para la tinción de un núcleo, incubar las células con 0,1 mg / ml de DAPI (Invitrogen) para1 minuto. Entonces decantar las diapositivas y de lavado en PBS. </li><li> Montar un cubreobjetos sobre la muestra de células con 20 L de un medio a base de resina de montaje en cada diapositiva. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente para preservar la diapositiva. Ahora las diapositivas están listos para ser fotografiado con un microscopio de fluorescencia. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Las formas de onda fotoacústica de las células blancas de la sangre y las células del melanoma se muestran aquí. Los glóbulos blancos, que no tienen pigmentación inherente, no producen ondas de fotoacústica y se manifiestan como una línea plana de ruido electrónico (izquierda). Las células de melanoma pigmentado produce una onda fuerte fotoacústica (derecha). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Después de la tinción inmunohistoquímica, las células cultivadas de melanoma muestran señales de DAPI en blue mientras MART1 se resalta en verde. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Superposición de imágenes para DAPI y MART1, como en la figura 2, con CD45 como un indicador de leucocitos, esta figura muestra las células de melanoma entre varios glóbulos blancos.

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li>
<li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li>
<li>Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry. Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. Annual International Conference of the IEEE, 2009, , IEEE. 106-109 (1985).</li>
<li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li>
<li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li>
<li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li>
<li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li>
<li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li>
<li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li>
</ol>

John A. Viator es fundador y presidente de Viator Technologies Inc, una compañía formada para comercializar tecnologías fotoacústica para la mejora de la salud humana.

La detección de CTCs es todavía un campo de investigación intensiva con aplicaciones clínicas muy pocos debido al difícil problema de aislar las células del tumor raro. Muchas otras técnicas están siendo evaluados para la detección de CTC, como RT-PCR, la captura de células de microfluidos, la captura inmunomagnética, y otros métodos de 8-12. Sin embargo, la detección fotoacústica de CMC muestra promesa, ya que es la etiqueta libre y proporciona un medio rápido y preciso para capturar las partículas pequeñas, que absorbe la luz. El protocolo descrito para aislar las células blancas de la sangre es muy eficiente, sin embargo, un número bajo de glóbulos rojos existen en la muestra. Estas células rouge contaminantes que absorben la luz láser, pero a un nivel mucho menor. Para asegurarse de que los glóbulos rojos no interfieren con nuestro sistema de detección de melanoma, cinco muestras de pacientes sanos fueron introducidos a través del sistema y no dio una señal, lo que indica que los glóbulos rojos están presentes en bajas concentraciones suficientes paratenerse en cuenta. Una serie de estudios sobre la concentración han llevado a cabo utilizando cultivos de células de melanoma y el sistema de flujo fotoacústica ha demostrado ser sensible a 1 células / l (datos no publicados). Estos estudios están en marcha y pronto incluirá los ensayos con muestras de pacientes con cáncer. Esta técnica fotoacústica está siendo evaluado para su uso en no pigmentados CTC, como el de mama y cáncer de próstata adjuntando cromóforos exógenos. Hemos realizado el trabajo preliminar con nanopartículas de oro sobre el cáncer de cells13. Estas pruebas han demostrado que las nanopartículas pueden proporcionar la absorción óptica necesaria para generar ondas de fotoacústica. El desafío técnico que todavía es unir estas partículas a las células cancerosas de manera selectiva.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

la detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante flujometría fotoacústica

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Las células tumorales circulantes (CTC) son las células que se han separado de un tumor macroscópico y la difusión a través de los sistemas sanguíneo y linfático a los tumores de semilla secundaria 1,2,3. CTCs son indicadores de la enfermedad metastásica y su detección en muestras de sangre se pueden utilizar para diagnosticar el cáncer y controlar la respuesta del paciente a la terapia. Desde los CTC son raros, que comprende alrededor de una célula tumoral entre los miles de millones de células sanguíneas normales en pacientes con cáncer avanzado, su detección y la enumeración es una tarea difícil. Aprovechamos la presencia del pigmento en la mayoría de las células de melanoma para generar fotoacústica, o inducida por láser las ondas ultrasónicas en un citómetro de flujo a medida para la detección de células de melanoma circulantes (CMC) 4,5. Este proceso implica la separación de una muestra de sangre mediante centrifugación y la obtención de la capa de glóbulos blancos. Si está presente en la sangre, los CMC se separarán con las células blancas de la sangre debido a la densidad similar. Estas células se resuspenden entampón fosfato salino (PBS) y se introduce en el medidor de flujo. En lugar de un flujo continuo de la suspensión de células sanguíneas, que induce el flujo de dos fases con el fin de capturar estas células para estudios posteriores. En el flujo de dos fases, dos líquidos inmiscibles en un sistema de microfluidos se encuentran en un cruce y la forma alterna las babosas de líquido 6,7. PBS suspendidos los glóbulos blancos y las babosas de aire que se forma microlitro de forma secuencial se irradia con luz láser. La adición de un surfactante para la fase líquida permite la formación de bala uniforme y el usuario puede crear diferentes babosas de tamaño mediante la alteración de los caudales de las dos fases. Las babosas de aire y las babosas de PBS con las células blancas de la sangre no contienen absorbentes de luz y por lo tanto, no producen ondas fotoacústica. Sin embargo, los lingotes de glóbulos blancos que contienen incluso CMC solo absorben la luz láser y producir ondas acústicas de alta frecuencia. Estas babosas que generan flujos fotoacústica son secuestradas y se recoge para la tinción citoquímica para verificción de los CMC.

Hemos desarrollado un citómetro de flujo con ultrasonido inducida por láser para detectar las células del melanoma circulando como un indicador temprano de la enfermedad metastásica.

La detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante Flujometría fotoacústica

Las células tumorales circulantes (CTC) son aquellas células que se han desprendido de un tumor macroscópico y se han propagado a través de los sistemas sanguíneo y linfático para sembrar...

El objetivo del siguiente experimento consiste en detectar la presencia de cáncer antes de la formación de tumores secundarios. Esto se logra primero obteniendo y separando muestras de sangre de pacientes con melanoma en estadio cuatro. Como segundo paso, se introduce la sangre en una cámara de flujo fotoacústica, que permite la detección y aislamiento de células de melanoma.A continuación, se obtienen imágenes de las células capturadas para confirmar la presencia de melanoma detectado. Los resultados muestran la capacidad del sistema para detectar y aislar con precisión y rapidez células de melanoma basándose en formas de onda fotoacústicas y técnicas de imagen celular. La principal ventaja de nuestra técnica frente a los métodos existentes que detectan células de melanoma circulantes, como la R-T-P-C-R, la clasificación magnética de células y otros métodos, es que nuestro método es libre de marcadores y permite la captura de células de melanoma circulantes sin alterar su superficie ni fijarlas a un sustrato.Para preparar una muestra para la detección de cáncer metastásico, comience por extraer aproximadamente 10 mililitros de sangre completa de un paciente con cáncer en estadio cuatro. En dos tubos vacutainer de cinco mililitros, centrifugue las muestras durante 10 minutos a 3000 RPM. La muestra de sangre se separará en tres capas distintas. La capa inferior está compuesta por los eritrocitos.La capa media, también llamada capa de coágulo, contiene leucocitos y células de melanoma, y la capa superior contiene plasma y plaquetas. Retire todo el plasma posible sin perturbar la capa de coágulo. Añada 250 microlitros de su opaco 10 77 a tubos de ensayo de dos mililitros.Utilizando una pipeta de pastel de nueve pulgadas, extraiga el plasma restante, toda la capa de glóbulos blancos (Buffy coat) y la capa superior de eritrocitos, asegurándose de recolectar menos de 500 microlitros. Transfiera la solución a los tubos de centrífuga previamente preparados.La sangre volverá a separarse, pero esta vez los eritrocitos quedarán separados por el hispa, lo que permitirá una fácil extracción de la capa de Buffy. Utilice una pipeta Pesa de nueve pulgadas para aislar toda la capa de Buffy y colóquela en un tubo eppendorf de dos mililitros. Luego, suspenda en 1,5 mililitros de PBS con un 2% en volumen por volumen entre 20.Para construir una cámara de flujo, comience con un cilindro de acrílico de ocho milímetros de largo, con un diámetro exterior de 20 milímetros y un diámetro interior de 17 milímetros. A continuación, taladre tres orificios de cinco milímetros de diámetro a través del lateral del cilindro, dispuestos a 90 grados de separación entre sí. Luego, corte tres trozos de tubo polimérico e insértelos en los orificios perforados.Estirar la película de parafina sobre la parte inferior del anillo de acrílico para crear un sello hermético. La película de parafina formará un recipiente poco profundo junto con el anillo de acrílico y contendrá la solución de acrilamida que formará la cámara de flujo. Suspender un alambre de 1,6 milímetros de diámetro a través de los trozos de tubo directamente uno frente al otro, asegurándose de que solo el alambre sea visible en el centro del anillo y hacia el tercer trozo de tubo.Inserte un alambre de 1,6 milímetros de diámetro y coloque el tubo a un milímetro de distancia del alambre suspendido. Estos alambres evitan que el acrilamida entre en el tubo. Prepare cinco mililitros de acrilamida.Luego, vierta rápidamente la mezcla en el anillo de acrílico, llenándolo hasta arriba. Después de unos segundos, la solución formará un gel. Para fabricar un molde de cámara de flujo, retire cuidadosamente los alambres asegurándose de no perturbar el gel de acrilamida, dejando un camino de flujo cilíndrico y un lugar para colocar una fibra óptica enfocada hacia el camino de flujo.La cámara de flujo ya está lista para usar con gel acústico. Acoplar un transductor acústico piezoeléctrico de fluoruro de vinilideno de polivinilo a la cámara de flujo directamente encima del recorrido del flujo. Mediante un cable bayoneta neo cons o BNC, conectar el transductor a la entrada de un receptor de banda ancha.Conecte la salida del filtro al osciloscopio para activar el osciloscopio. Coloque un fotodiodo cerca del transductor y utilice un cable B NNC para conectarlo al osciloscopio. Extraiga ligeramente el tubo pequeño de la cámara de flujo hasta que se forme un pequeño bolsillo de aire y acóplelo al transductor.Luego inserte la fibra óptica y llene el bolsillo con agua para reducir las señales de interfaz y aumentar la cantidad de luz láser aplicada al recorrido del flujo. Debido a la apertura numérica de la fibra óptica y la corta distancia hasta el recorrido del flujo, el láser solo irradiará un tapón de muestra a la vez, asegurando que la muestra directamente frente al láser sea la misma que genera las señales fotoacústicas.A continuación, conecte un conector en T a uno de los brazos de la cámara de flujo y dos bombas de jeringa a las otras ramas del conector. Una jeringa contiene aire, mientras que la otra contendrá la suspensión celular previamente preparada. Luego, encienda ambas bombas de jeringa.Cuando los dos fluidos admisibles alcancen la unión en T, se dividirán en glóbulos homogéneos y fluirán más allá del transductor. Irradiar la muestra en flujo con un láser de pulsos nanosegundo para generar ondas fotoacústicas en las células de melanoma. Dado que la melanina es un absorbente óptico de banda ancha, se puede utilizar cualquier longitud de onda láser visible.Una señal que aparece en el osciloscopio cuando un fragmento está sobre el transductor indica que el fragmento contiene melanoma. Sígalo a través del sistema antes de depositarlo en un tubo de recogida. Para preparar muestras de inmuno citología, coloque portaobjetos de vidrio en embudos citológicos y colóquelos en el citocentrífugo para centrifugar, lo que ayudará a que las células retenidas se adhieran a los portaobjetos.Coloque 100 microlitros de BSA al 1 % en PBS en cada embudo. Luego, centrifugue a 600 RPM durante tres minutos. Después de la centrifugación, agregue las muestras celulares a los embudos para CyTOF y luego centrifugue a 600 RPM durante tres minutos.Rocíe las laminillas con un fijador a base de etanol. Luego lave las laminillas en PBS durante 10 minutos, dos veces, para bloquear la unión no específica. Incube cada laminilla con una mezcla de 10 microlitros de suero de cabra y 90 microlitros de PBS durante una hora a temperatura ambiente.Después de la incubación, vierta cuidadosamente las laminillas y agregue la solución de anticuerpo primario. Cada laminilla debe contener 1% de suero de conejo, 1% de anticuerpo anti-CD45 de ratón y 10% de suero de cabra en PBS, e incubar durante una hora en una cámara humedecida a temperatura ambiente. A continuación, lave las laminillas con PBS durante 10 minutos, tres veces.Luego, incubar las laminillas con los anticuerpos secundarios fluorescentes apropiados en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente y verter el exceso de anticuerpo. A continuación, lavar las laminillas en PBS durante cinco minutos, tres veces, para teñir los núcleos; incubar las células con 0,1 microgramos por mililitro de DPI durante un minuto. Luego, verter las laminillas y lavar con PBS.Finalmente, utilizando un medio de montaje a base de resina, monte una lámina de cubierta sobre la muestra celular, selle la lámina con esmalte transparente y observe con un microscopio fluorescente. Las formas de onda fotoacústicas procedentes de los glóbulos blancos y de las células de melanoma se muestran aquí a la izquierda. Los glóbulos blancos, que no poseen pigmentación inherente, no producen ondas fotoacústicas y aparecen como una línea plana de ruido electrónico a la derecha.Sin embargo, las células de melanoma pigmentadas producen una onda fotoacústica intensa. Tras la inmuno citocoloración, las células de melanoma cultivadas teñidas químicamente muestran señales puntiformes en azul, y una célula marcada se resalta en verde al superponer las imágenes de DPI y mart-1 con CD45 como indicador de leucocitos. Esta figura muestra células de melanoma entre varias células blancas de la sangre tras su desarrollo.Nuestra técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la detección del cáncer exploren el fenómeno de la metástasis, con el fin de mejorar la detección del cáncer y, en última instancia, curar su propagación fatal.

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video describe la técnica de aislar células madre de melanoma CD133 negativas y positivas de una línea celular de melanoma primario utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente. Las CSC de melanoma CD133 positivas se estudian más a fondo para comprender los mecanismos de la tumorigénesis del melanoma.

Aislamiento de células madre de melanoma: un método para obtener células de melanoma positivas y negativas CD133 mediante la clasificación de células activadas magnéticamente

En este video, presentamos una detección citométrica de flujo fotoacústico de células de cáncer de ovario con nanopartículas en una cámara de flujo in vitro circulante. Esta técnica no invasiva identifica con éxito las células tumorales circulantes en un sistema de flujo utilizando un agente de contraste.

Citometría de flujo fotoacústica in vitro: una técnica fotoacústica de flujo no invasiva para detectar células de cáncer de ovario circulantes portadoras de nanopartículas

Fuente: Kalva, S. K., et al., Tomografía fotoacústica de escritorio basada en diodos láser pulsados para monitorear el lavado y lavado del tinte en la vasculatura cortical de ratas. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para usar imágenes fotoacústicas para observar cambios en los vasos corticales de una rata anestesiada. El proceso incluye imágenes de referencia, inyección de tinte y análisis de la absorción y eliminación del tinte durante el lavado y el lavado.

Monitorización fotoacústica del movimiento del colorante en los vasos sanguíneos corticales

En este artículo se describe la preparación de tejido de melanoma recién obtenido en cultivos de células primarias, y cómo eliminar contaminaciones de los eritrocitos y los fibroblastos de las células tumorales. Por último, se describe cómo...

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

Describimos dos métodos complementarios que utilizan el indicador de ciclo celular de ubiquitinación por fluorescencia (FUCCI) y el análisis de imágenes o citometría de flujo para identificar y aislar células en las regiones internas G1 detenidas y proliferantes externas de los esferoides 3D.

Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Aquí se presenta un protocolo para estimar materiales y propiedades ópticas que utilizan el efecto combinado fotoacústica con la reflexión interna total de la superficie. Esta técnica basada en photoacoustics campo evanescente se pueden utilizar para crear un sistema de metrología fotoacústica para estimar los índices espesores, a granel y refracción de materiales de película delgada ', y explorar sus propiedades ópticas.

Evanescente de campo Photoacoustics Basado óptico Evaluation: Propiedad en superficies

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Se presenta un protocolo para detectar células tumorales ováricas circulantes utilizando un sistema de flujo fotoacústico hecho a medida y nanopartículas de sulfuro de cobre con ácido fólico dirigido.

Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

Este protocolo proporciona una guía paso a paso para diseñar un panel de anticuerpos de inmunofluorescencia multiplex para la obtención de imágenes basadas en códigos de barras de ADN de tejidos murinos de melanoma FFPE. También describimos una línea de análisis de imágenes que utiliza herramientas de código abierto para generar información proteómica espacial sobre el microambiente inmunológico del tumor de melanoma murino.

Imágenes de inmunofluorescencia múltiple basadas en códigos de barras de ADN para analizar muestras de FFPE de melanoma murino reprogramado genéticamente

Aprende a detectar células de melanoma circulantes mediante flujometría fotoacústica sin marcadores. Este método permite identificar células cancerosas antes de la formación de tumores secundarios en pacientes con melanoma.

La detección y aislamiento de las células de melanoma circulantes mediante Flujometría fotoacústica

Explorar más videos