Monitoreo adsorción de proteínas de estado sólido Nanoporos

El objetivo general de este procedimiento es crear nanoporos en membranas artificiales para su uso en estudios de absorción de proteínas. Esto se logra perforando nanoporos en una membrana de nitruro usando un tallo. Luego, el nanoporo se carga en una cámara y se humedece con una solución iónica.

De modo que ese fluido forma un puente de un lado del nanoporo al otro para que el nanoporo esté listo para los experimentos. Se aplica un voltaje a través de él y se puede observar que una corriente de iones pasa a través de él. El paso final es añadir proteínas a la cámara de Nanopore.

En última instancia, la observación de bloqueos de larga duración en la corriente iónica a través del nanoporo revela la absorción de proteínas a los lados del nanoporo. Hola, soy Dave Wicki. Soy estudiante de posgrado en el Departamento de Física de la Universidad de Syracuse.

Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la absorción de proteínas en superficies inorgánicas. También se puede aplicar a otros sistemas como proteínas, interacciones de ácidos nucleicos, molécula única para espectroscopia y el estudio de moléculas en espacios confinados. Comience elevando el vástago a un voltaje de aceleración.

A continuación, una rejilla de ventana de nitruro de silicio SPI en el portamuestras TEM. Limpie la rejilla con plasma de oxígeno durante 30 segundos para eliminar los residuos. Antes de cargar la muestra, cargue el portamuestras en el TEM y deje que el vacío bombee hacia abajo.

Usando el modo TEM de campo claro, encuentre la ventana de nitruro, un cuadrado brillante en el rograma sin procesar. Asegúrate de que el TEM esté alineado correctamente. A continuación, alinee y enfoque la muestra.

Ahora ponga el sistema en modo STEM y use un detector de apagado caliente para obtener imágenes de la muestra y verificar su alineación. Ajuste el monocromador, si está presente, a un valor bajo, lo que permite una mayor corriente de electrones disponibles para la perforación. Seleccione el tamaño de punto apropiado para perforar el Nanopore en función del diámetro de la sonda de electrones.

Con el tallo alineado. Utilice el BROGRAM para enfocar perfectamente la membrana de nitruro con el aumento requerido. Si hay algún movimiento de la muestra, en blanco, el haz de electrones y espere a que la muestra se estabilice.

Esto puede tardar hasta una hora. Una vez estabilizado, coloque la sonda de electrones en la muestra y comience a perforar el nanoporo. Perforar un nanoporo con una TM requiere la infidelidad del paciente.

Es un proceso en el que el nitruro se disipa gradualmente bajo una sonda de haz de electrones. Es importante mantener la sonda de electrones directamente sobre el sitio de perforación y confirmar que el nanoporo está completamente perforado. Antes de retirar la muestra del TEM, compruebe periódicamente la muestra escaneándola con el detector de apagado caliente.

Si la muestra se desplaza ligeramente, ajuste la posición de la sonda electrónica para que esté sobre el nanoporo. Con el gramo de ROI enfocado, la película de nitruro brillante desaparecerá. Cuando el nanoporo se forma con el gramo roky fuera de foco, el flequillo de la uña deshilachado es visible.

Visualice el nanoporo con el apagado caliente y haga un perfil de intensidad de la imagen. El diámetro del nanoporo se puede estimar por la región más oscura del perfil. La sonda de electrones se puede utilizar para agrandar el nanoporo si es necesario.

Cuando tenga el diámetro requerido. Cambie al modo TEM con el monocromador en la configuración estándar. Utilice TEM de campo claro para confirmar el tamaño de los poros.

Comience preparando degas di saline. Ponga la solución al vacío y en un baño sonicato durante 20 minutos Con delicadeza, coloque el frágil Nanopore que contiene nitruro de silicio Chip en un pico Pyrex de 10 mililitros. Luego, en una campana extractora, coloque el vaso de precipitados en una placa caliente.

Limpie con mucho cuidado el chip Nanopore con solución de piraña. Primero, agregue tres mililitros de ácido sulfúrico al recipiente con una pipeta de vidrio. En segundo lugar, agregue con cuidado un mililitro de peróxido de hidrógeno alto al ácido sulfúrico.

Por favor, tome todas las precauciones. Deje que el chip de nanoporos se remoje durante 10 minutos. Luego, con una pipeta de vidrio, retire la solución de piraña del vaso de precipitados y deséchela correctamente.

A continuación, llene el vaso de precipitados con agua desionizada Degas. Con una pipeta de vidrio limpia, vacíe el vaso de precipitados con agua y repita el lavado al menos cinco veces. Con unas pinzas limpias, retire el chip de nanoporos y séquelo con una ligera succión.

Una vez seco, selle inmediatamente el chip de nanoporos en la cámara. El chip puede fijarse en la cámara mediante juntas tóricas o sellador de silicona. Llene la cámara con una solución de cloruro de potasio.

Conecte los electrodos de plata, cloruro de plata a la cámara. Los electrodos se pueden hacer remojando alambre de plata en lejía durante la noche. Aplique un potencial transmembrana a través de los electrodos y controle la respuesta de corriente utilizando un amplificador de pinza de parche.

En el modo de pinza de voltaje, construya una curva de voltaje actual a partir de las mediciones. La curva debe ser muy lineal. Cuando se utiliza un molar de cloruro de potasio, la conductancia del nanoporo debe corresponder a su diámetro.

Si el nanoporo no muestra una curva IV lineal, la conductancia es demasiado baja o la corriente abierta del nanoporo no es estable. Esto indica que el nanoporo no está bien casado y se debe repetir el lavado de piha. Es esencial asegurarse de que el líquido esté dentro del nanoporo.

Si este paso no se realiza correctamente, la corriente iónica a través del nanoporo exhibirá un ruido muy grande y la partición de las proteínas en el nanoporo se reducirá drásticamente. Comience agregando una muestra purificada de la proteína de interés en el baño conectado a tierra de la cámara. Espere a que la muestra se difunda completamente.

Aplique un sesgo de voltaje de potencial transmembrana con polaridad opuesta a la de la carga total de la proteína que se está estudiando. Un potencial aplicado de 200 milivoltios debe ser lo suficientemente grande como para observarlo. La mayoría de los eventos de analitos proteicos aparecerán como desviaciones transitorias de la corriente desde la línea de base.

Si no se observa ninguna señal, aumente la concentración de la proteína en la cámara. Los voltajes más altos mejoran la relación señal/ruido y nitruro. Los nanoporos pueden soportar varios voltios.

Las absorciones de proteínas aparecerán como cambios de larga duración en la corriente de referencia del Nanopore. Los resultados típicos para los nanoporos de estado sólido serán los siguientes. La corriente de poro abierto debe ser muy estable.

Las características IV del nanoporo deben ser altamente lineales. En un molar de cloruro de potasio, fosfato de potasio 10 molar pH 7.4, la pendiente de un ajuste lineal a la curva IV proporcionará la conductancia unitaria del nanoporo. La conductancia tiene una relación directa con el diámetro del nanoporo y debe coincidir con la ecuación.

Este valor debe coincidir con un margen de error del 30%Si el valor es demasiado pequeño, es probable que el poro no esté unido con la adición de proteína. Los eventos rápidos deben producirse, la absorción de proteínas es una caída de corriente de larga duración. Algunas proteínas son altamente lábiles y sufren una transformación estructural dentro del interior de los poros.

En este caso, la caída de voltaje de larga duración irá acompañada de fluctuaciones rápidas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar nanoporos de estado sólido usando un microscopio electrónico de transmisión de barrido y usando esa absorción de proteínas SA equilibrada. No olvide que trabajar con solución de piraña puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una campana extractora con guantes, una bata de laboratorio y un delantal químico al realizar este procedimiento.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.