Name: Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a analizar el metabolismo bacteriano mediante el etiquetado con carbono-13 y cromatografía de gases-espectrometría de masas. Este método permite trazar vías metabólicas funcionales en microorganismos fotosintéticos como cianobacterias.

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Este estudio fue apoyado por una carrera NSF Grant (MCB0954016) y una Beca de Investigación de Bioenergía del DOE (DEFG0208ER64694).

1. De cultivo de células (Figura 1) <ol><li> Se cultivan las células en medio mínimo con los elementos traza, sales, vitaminas, y específicamente etiquetados sustratos de carbono que son los mejores para la investigación de la vía. Utilizar cualquiera de frascos de agitación o bioreactores para el cultivo celular. Los nutrientes orgánicos, tales como extracto de levadura, puede interferir con la medición de etiquetado de aminoácidos y por lo tanto no pueden estar presentes en el medio de cultivo. </li><li> Controlar el crecimiento celular por la densidad óptica de la cultura en una longitud de onda óptima (por ejemplo, OD 730 para Cyanothece 51.142) con un espectrofotómetro UV / Vis. </li><li> Las primeras células pueden ser cultivadas en un medio no-etiquetado. El crecimiento de las células en fase de registro medio se prefiere que se utiliza para la inoculación (3% (v / v) por la relación de volumen de inoculación) del medio de la etiqueta. La cultura de la etiqueta deben ser sub-cultivados (3% v / v relación de inoculación) en el mismo medio la etiqueta para evitar la introducción de la etiqueta de carbono del inóculo inicial. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Extracción de aminoácidos <ol><li> Cosecha sub-cultivos de células (10 ml) en la fase de crecimiento media sesión por centrifugación (10 min, 8000 × g). </li><li> Resuspender el precipitado en 1,5 ml de HCl 6M y transferirlo a un vidrio transparente, con tapa de rosca vial GC. Cap de los viales y colóquelos en un horno de 100 ° C durante 24 horas para hidrolizar las proteínas de la biomasa en los aminoácidos. La hidrólisis de pellets de biomasa puede producir 16 de los 20 aminoácidos comunes (Figura 2) 5. Cisteína y triptófano se degrada, y la glutamina y asparagina se convierten en el glutamato y el aspartato, respectivamente. </li><li> Centrifugar la solución de aminoácidos a 20000 × g durante 5 minutos con 2 ml tubos Eppendorf, y la transferencia de los sobrenadantes a los nuevos viales de GC. Este paso elimina las partículas sólidas en la solución de hidrólisis. </li><li> Quitar las tapas vial GC y secar las muestras completamente bajo una corriente de aire con un Thermo Scientific Reacti-Vap evaporador (nota: un secador de congelación también se puede utilizar to seca las muestras). Este paso se puede hacer durante la noche. </li></ol> 3. Derivatización de aminoácidos y las condiciones de GC-MS Análisis de aminoácidos o carga / alta de metabolitos polares a través de GC requiere que estos metabolitos se derivatizado, a fin de que los aminoácidos son volátiles y se pueden separar por cromatografía de gases 2. <ol><li> Disuelva las muestras secas con 150 l de tetrahidrofurano (THF) y 150 l de N-(terc-butildimetilsilil)-N-methyltrifluoroacetamide reactivo de derivatización. </li><li> Incubar todas las muestras en un horno o un baño de agua entre 65 y 80 ° C durante 1 hora. Vortex ocasionalmente para asegurarse de que los metabolitos en el vial se disuelven. </li><li> Centrifugar las muestras a 20000 × g durante 10 minutos, y luego transferir el sobrenadante a los nuevos viales de GC. El sobrenadante debe ser una solución clara y amarillenta. Debido a la saturación de los detectores, GC-MS precisión de la medición puede verse afectada por la alta concentration de inyección TBDMS derivado de aminoácidos (las muestras a menudo muestra de color marrón oscuro), por lo tanto, hay que diluir las muestras con THF antes de GC-MS medición 6. </li><li> Analizar las muestras por GC-MS (usar un split 1:5 o 1:10, el volumen de inyección = 1 l, de transporte de gas helio = 1,2 ml / min). Utilice el siguiente programa de GC temperatura: mantener a 150 º C durante 2 minutos, el aumento de 3 ° C por minuto hasta 280 ° C, aumentando a 20 ° C por minuto hasta 300 ° C y mantenga durante 5 minutos. Espera para el solvente se puede establecer como ~ 5 minutos (para una columna de 30 metros GC). El rango de la masa de carga (m / z) en la EM se puede establecer entre 60 y 500. </li></ol> 4. GC-MS análisis de datos <ol><li> TBDMS derivado de medición de aminoácidos también pueden verse afectados por la discriminación de isótopos en la separación de GC. Isótopos ligeros se mueven ligeramente más rápido que levantar los isótopos en la columna GC. Para reducir el potencial de sesgo de medición, es posible que la media del espectro de masas de todo elaminoácido rango máximo 6 </li><li> La GC y los espectros de MS de metabolitos TBDMS derivado se ha informado antes de las 7. El tiempo de retención GC y los picos únicos m / z para cada aminoácido se ilustra en la Figura 3. </li><li> Derivatización de aminoácidos o de metabolitos central introduce grandes cantidades de isótopos naturales marcado, entre ellos 13 C (1,13%), 18 S (0,20%), de 29 años Si (4,70%), y 30 Si (3,09%). La medición del ruido de los isótopos naturales en el espectro de masa isotopomer primas pueden ser corregidos mediante el uso de software publicado 5, 8. Los datos finales de etiquetado isotópico se presentan como fracciones de masa, por ejemplo, M 0, M 1, M 2, M 3 y M 4 (en representación de los fragmentos que contienen cero a cuatro átomos de carbono marcados 13 C). </li><li> La medición de los aminoácidos pueden proporcionar información sobre el etiquetado isotópico ocho metabolitos precursores crucial: 2-oxo-glutarcomió, 3-P-glicerato, acetil-CoA, eritrosa-4-P, oxalacetato, fosfoenolpiruvato, piruvato y la ribosa-5-P. Los patrones de etiquetado de estos metabolitos pueden ser utilizados para identificar varias rutas metabólicas centrales (Figura 2) 9. El resultado de los experimentos de etiquetado puede ser confirmado mediante otros métodos bioquímicos (por ejemplo, RT-PCR). </li></ol> 5. Vía de análisis utilizando datos de la etiqueta de aminoácidos Al investigar sólo algunos ácidos clave amino producidos a partir de experimentos bien diseñados 13 C del marcador, que puede revelar varias vías únicas o las actividades de la enzima sin necesidad de realizar sofisticados 13 C-metabólico análisis de flujo del metabolismo central de todo. <ol><li> Entner-Doudoroff vía: [1 - 13 C] glucosa puede ser utilizada como fuente de carbono. Si la vía está activa, el etiquetado serina será significativamente menor que el etiquetado de la alanina 10. </li><li> Ciclo ramificada TCA: [1 - 13 C]piruvato puede ser utilizado como fuente de carbono. Si el ciclo de TCA se ha roto, aspartato pueden ser etiquetados por dos átomos de carbono, mientras que el glutamato es etiquetado con sólo un átomo de carbono 11, 12. </li><li> Fijación de CO 2 por Calvin-Benson-Bassham ciclo en el metabolismo mixotróficos: no marcado y etiquetado de CO 2 sustratos de carbono son utilizados como fuentes de carbono. Si el ciclo de Calvin es funcional, serina y etiquetado histidina será significativamente diluida, en comparación con otros aminoácidos. Tal método puede determinar la relación CO 2 cuando la fijación de fuentes orgánicas de carbono están presentes en el medio 13. </li><li> Vía oxidativa de las pentosas fosfato: [1 - 13 C] glucosa puede ser utilizada como fuente de carbono. Si la vía está activa, la alanina sin etiqueta será&gt; 50% 12. </li><li> Anapleróticas vía (por ejemplo, PEP + CO 2 oxalacetato a): 13 CO 2 y no de carbono marcado sustratos (por ejemplo, el glicerol o pyruvate) se puede utilizar como fuente de carbono. Si la vía está activa, el etiquetado aspartato se ha enriquecido considerablemente, en comparación con alanina y serina 13. </li><li> Re-citrato sintasa: [1 - 13 C] piruvato puede ser utilizado como fuente de carbono. Si la enzima está activa, el glutamato es etiquetada en β-carboxilo grupo de 3, 4. </li><li> Vía Citramalate: [1 - 13 C] piruvato, [2 - 13 C] glicerol, o [1 - 13 C] acetato se puede utilizar como fuente de carbono. Si la vía está activo, las cantidades de etiquetado leucina e isoleucina son idénticos 14. </li><li> Serina-isocitrato liasa ciclo: [1 - 13 C] piruvato o [1 - 13 C] lactato puede ser utilizado como fuente de carbono. Si la vía está activa, la tercera posición de carbono en la serina se etiquetarán 15. </li><li> Utilización de los nutrientes (es decir, aminoácidos exógenos): un medio de cultivo con sustratos de carbono completamente etiquetados y no etiquetados aminoácidosse puede utilizar. Si las células de forma selectiva utilizar estos nutrientes complementa los no etiquetados, vamos a ver una dilución significativa de etiquetado de estos aminoácidos en la biomasa. Este método puede ser utilizado para investigar lo que los suplementos de nutrientes son los preferidos por la celda 16. </li></ol> 6. Resultados representante Estudios recientes han reavivado el interés de bioenergía en el uso de nuevos microorganismos fototróficas para la producción de bioenergía y la captura de CO 2. En los últimos años, un buen número de metabolismo de la 13C-análisis, incluyendo avanzados análisis de flujo metabólico-13C (13C-AMF), se han aplicado para investigar el metabolismo central en bacterias fototróficas, porque el conocimiento bioquímico de las rutas metabólicas centrales no está bien fundada en estos organismos que no son modelo 10, 11, 17-20. Aquí, se presenta un ejemplo del descubrimiento de una vía alternativa en isoleucina Cyanothece 51.142 21. Cianothece 51.142 no contiene la enzima (EC 4.3.1.19, treonina amonio-liasa), que cataliza la conversión de treonina a 2-cetobutirato en la vía de síntesis de isoleucina típico. Para resolver la vía isoleucina, crecemos Cyanothece 51.142 (20 ml) en medio ASP2 22 con glicerol de 54 mm (2-13C,&gt; 98%). Cyanothece 51142 utiliza 2 ª posición de glicerol etiquetados como fuente de carbono principal. Observamos que la treonina y alanina tienen una etiqueta de carbono, mientras que la isoleucina es etiquetado con tres carbonos. Por lo tanto, la síntesis de Cyanothece 51142 no se puede derivar de la ruta treonina empleado por la mayoría de los organismos (Figura 4). Por otro lado, leucina e isoleucina tienen patrones idénticos de etiquetado basado en fragmentos (M-15) y el fragmento + (M-159) +. Por ejemplo, los datos isotopomer de [M-15] + (que contiene los aminoácidos no fragmentado) muestran el etiquetado idénticas de leucina (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0.21, M3 = 00.69) e isoleucina (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0.24, M3 = 0,67). Así, leucina e isoleucina se sintetiza a partir de los precursores del mismo (es decir, el piruvato y el acetil-CoA). Esta observación es consistente con la transición de carbono marcado en la vía citramalate para la síntesis de isoleucina. Para confirmar esta vía, que buscar en la base de datos Joint Genome Institute y encontrar la presencia de una sintasa citramalate Cima (cce_0248) en Cyanothece. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. El 13 C con ayuda de los pasos de análisis vía. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Los aminoácidos utilizados para la adquisición del patrón de etiquetado de sus precursores metabólicos. ACOA, la acetil-CoA, AKG, α-cetoglutarato; C5P, ribosa 5-fosfato, CIT, citrato; E4P, eritrosa 4-fosfato, G6P, glucosa 6-fosfato, OAA,<html> oxalacetato, PEP, fosfoenolpiruvato, PGA, 3-fosfoglicerato, PYR, el piruvato. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Picos GC de 16 aminoácidos. TBDMS aminoácidos derivatizados están agrietadas por los Estados miembros en dos fragmentos: (M-57) +, que contiene el ácido amino todo, y (M-159) +, que carece del grupo α carboxilo del aminoácido. De leucina e isoleucina, el + (M-57) fue solapado por los picos de masas. Sugerimos el uso de fragmentos (M-15) + para analizar el etiquetado completo de aminoácidos. El grupo (F302) + se detecta en la mayoría de los aminoácidos, que contiene sólo el primero (α-carboxilo del grupo) y los carbones segundo en una red troncal de aminoácidos. Debido a que este pico de MS a menudo ha de ruido a la señal de ratios, (F302) + no se recomienda para analizar cuantitativamente los flujos metabólicos 7. igura 4 &quot;/&gt; Figura 4. Etiquetado de las transiciones en las vías de isoleucina en Cyanothece 51.142 (modificado a partir de nuestro trabajo anterior) 21.

<ol><li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li>
<li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li>
<li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluxome+analysis+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li>
<li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li>
<li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis%3A+mass+isotope+correction%2C+data+consistency+checking%2C+and+precursor+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li>
<li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li>
<li>Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li>
<li>Tang, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li>
<li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li>
<li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe%28III%29-NTA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li>
<li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li>
<li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+of+the+mixotrophic+metabolisms+in+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobaculum+tepidum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li>
<li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+dioxide+fixation+as+a+central+redox+cofactor+recycling+mechanism+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li>
<li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calvin+cycle+flux%2C+pathway+constraints%2C+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li>
<li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase%2Freductase%3A+The+ethylmalonyl-CoA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li>
<li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li>
<li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unicellular%2C+aerobic+nitrogen-%C3%AF%C2%AC%C2%81xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li>
<li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li>
<li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-based+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo consiste en alimentar la celda con un sustrato marcado y medición de los patrones resultantes isotópica de etiquetado en los aminoácidos a través de GC-MS. Desde MS de datos (m / z ratios) dar la cantidad total de etiquetado de los iones de MS, tenemos que evaluar las distribuciones de isotopomer de aminoácidos mediante el examen de la m / z ratios de ambos no fragmentado (M-57) + y fragmentado aminoácidos (es decir, (M-159) y + (F302) +). Además, podemos realizar varias c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td> De carbono marcado sustrato </td><td> Cambridge Laboratorios de isótopos </td><td> Dependen del requisito experimental </td><td> Sitio Web: <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> Cromatógrafo de gases </td><td> Agilent Technologies </td><td> Hewlett-Packard, modelo 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GC Columnas </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA </td><td> DB5 (30) </td><td> - </td></tr><tr><td> Espectrómetro de masas </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td> Reactivación-Vap EvaporAtor </td><td> Thermo Scientific </td><td> TS-18825 </td><td> Para el secado de las muestras de aminoácidos </td></tr></tbody></table>

confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 c-etiquetado de proteinogenic aminoácidos

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Los microbios tienen complejos procesos metabólicos que pueden ser investigados con métodos genómica bioquímica y funcional. Una técnica importante para examinar el metabolismo celular central y descubrir nuevas enzimas es de 13 C con ayuda de análisis de metabolismo 1. Esta técnica se basa en el etiquetado isotópico, en el que los microbios se alimentan con un 13 sustratos C etiquetados. Al trazar las rutas de transición entre el átomo de metabolitos en la red bioquímica, podemos determinar las vías funcionales y descubrir nuevas enzimas. Como un método complementario a la transcriptómica y proteómica, los enfoques de isotopomer análisis asistido de las vías metabólicas contiene tres pasos principales 2. En primer lugar, crecen las células con 13 substratos C etiquetados. En este paso, la composición del medio y la selección de sustratos marcados son dos factores clave. Para evitar los ruidos de medición de carbono no llevan la etiqueta en los suplementos nutricionales, Un medio mínimo con una única fuente de carbono es necesario. Además, la elección de un sustrato marcado se basa en la eficacia con que aclarará el camino que se analiza. Debido a nuevas enzimas a menudo implican estereoquímica reacción diferente o productos intermedios, en general, solo etiquetados sustratos de carbono son más informativos para la detección de nuevas vías que los etiquetados de manera uniforme para la detección de tres nuevas vías, 4. En segundo lugar, se analizan los patrones de amino ácido etiquetado con GC -MS. Los aminoácidos son abundantes en proteínas y por lo tanto se puede obtener a partir de la hidrólisis de la biomasa. Los aminoácidos pueden ser derivado de N-(terc-butildimetilsilil)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) antes de la separación GC. TBDMS aminoácidos derivado puede ser fragmentado por los Estados miembros y dar lugar a matrices diferentes de fragmentos. Sobre la base de la masa de carga (m / z) La proporción de aminoácidos fragmentados y no fragmentados, podemos deducir los posibles patrones de los metabolitos de la etiqueta central que seprecursores de los aminoácidos. En tercer lugar, se traza la transición 13C de carbono en las vías propuestas y, en base a los datos isotopomer, confirme si estas vías están activas 2. La medición de aminoácidos proporciona información sobre el etiquetado isotópico ocho metabolitos precursores crucial en el metabolismo central. Estos nodos clave del metabolismo pueden reflejar las funciones de los asociados vías centrales. 13 C-análisis asistido por el metabolismo de los aminoácidos a través de proteinogenic puede ser ampliamente utilizado para la caracterización funcional del metabolismo microbiano caracterizado mal 1. En este protocolo, vamos a utilizar Cyanothece 51142 como la cepa modelo para demostrar el uso de sustratos de carbono marcado por el descubrimiento de nuevas funciones enzimáticas.

13 C-etiquetado de isótopos es una técnica útil para determinar el metabolismo de la célula central para varios tipos de microorganismos. Después las células han sido cultivadas con un sustrato marcado, GC-MS medición puede revelar las vías metabólicas funcional basada en los patrones de etiquetado único en proteinogenic aminoácidos.

Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

Los microbios poseen rutas metabólicas complejas que pueden investigarse mediante métodos de bioquímica y genómica funcional. Una técnica importante para examinar...

El objetivo de este protocolo es estudiar el metabolismo bacteriano mediante análisis de metabolismo asistido por carbono 13. Para comenzar, los microorganismos se cultivan en presencia de sustratos de carbono marcados, los cuales se incorporan a las proteínas microbianas. Luego, los microorganismos se recolectan y se extraen los aminoácidos, que posteriormente se hidrolizan y se derivatizan.Las muestras se aplican a un cromatógrafo de gases y espectrómetro de masas, o GCMS. Al rastrear las trayectorias de transición de átomos entre metabolitos en la red bioquímica, pueden determinarse las vías metabólicas funcionales utilizadas por el microbio. Soy Bert Burla.El método que presentamos aquí puede utilizarse como un complemento a la transcriptómica y la proteómica para determinar las vías metabólicas en microorganismos. Hemos utilizado esta técnica para investigar microorganismos fotosintéticos, como las cianobacterias, en cuanto a la utilización de carbono mixótrofa o heterótrofa. En este video, utilizaremos ANOTHE 5 1 1 42 como cepa modelo para demostrar el uso de sustratos de carbono marcados en el descubrimiento de nuevas funciones enzimáticas.El procedimiento será demostrado por mí mismo, Li Yu y Chu Yang Fang. Comience este procedimiento cultivando bacterias de *Cyanas thesi* en un medio no marcado. Cuando las bacterias alcancen la fase de crecimiento logarítmico media, inocule el 3 % en volumen en el medio marcado con carbono 13.Luego, para evitar la introducción de carbono no marcado del subcultivo inicial de inóculo en el mismo medio marcado durante la fase de crecimiento logarítmico media. Cuando las bacterias Cy Thesei marcadas con carbono 13 alcancen la fase de crecimiento logarítmico media, recoger 10 mililitros mediante centrifugación. ReSuspender el precipitado en 1,5 mililitros de ácido clorhídrico seis molar y transferirlo a un vial de cromatografía de gases (GC) de vidrio transparente con tapón roscado.Cierre los viales y colóquelos en un horno a 100 grados Celsius durante 24 horas para hidrolizar las proteínas de la biomasa en aminoácidos. La hidrólisis de los pellet de biomasa produce 16 de los 20 aminoácidos comunes tras la hidrólisis; transfiera la solución de aminoácidos a tubos microcentrífugos de dos mililitros y luego centrifugue a 20.000 Gs durante cinco minutos. Tras la hidrólisis, transfiera la solución de aminoácidos a tubos microcentrífugos de dos mililitros y luego centrifugue a 20.000 Gs durante cinco minutos para depositar las partículas sólidas.Después de la centrifugación, transfiera los sobrenadantes a nuevos viales de GC para eliminar las partículas sólidas en la solución de hidrólisis, de modo que no ingresen a la columna de GC. A continuación, los aminoácidos se derivatizan para hacerlos volátiles y permitir su separación mediante cromatografía de gases; disuelva las muestras secas con 150 microlitros de tetrahidrofurano, THF, y 150 microlitros de N-terc-butil-dimetilsililamina y metil trifluoro.Incubar todos los muestras con el reactivo de derivatización de acetamida T-B-D-M-S en un horno entre 65 y 80 grados Celsius durante una hora. Vortexar las muestras ocasionalmente para asegurarse de que los metabolitos en el vial estén disueltos. Centrifugar las muestras a 20.000 ×g durante 10 minutos y luego transferir el sobrenadante a nuevos viales de GC.El sobrenadante debe ser una solución amarillenta clara. Las temperaturas de CG son las siguientes: mantener a 150 grados Celsius durante dos minutos. Aumentar a tres grados Celsius por minuto hasta 280 grados Celsius.Aumente 20 grados Celsius por minuto hasta 300 grados Celsius, y luego mantenga durante cinco minutos. A continuación, para una columna de CG de 30 metros, ajuste el retardo del disolvente a aproximadamente cinco minutos y el rango de la relación masa a carga entre 60 y 500. Analice las muestras mediante CG-EM utilizando un volumen de inyección con una relación de división de uno a cinco o uno a 10 de un microlitro y gas portador helio de 1,2 mililitros por minuto siguiendo el análisis.Analice los datos de GC-EM utilizando Microsoft Excel. En esta figura se ilustran el tiempo de retención en cromatografía de gases y los picos únicos de relación masa/carga para cada aminoácido. Los aminoácidos derivados generalmente se dividen claramente mediante espectrometría de masas en dos fragmentos cargados: el fragmento M menos 57, que contiene todo el aminoácido, y el fragmento M menos 159, que carece del grupo carboxilo alfa del aminoácido, en leucina e isoleucina.El pico M menos 57 se superponía con otros fragmentos de picos de masa. Se puede utilizar N menos 15 para analizar la marcación completa de aminoácidos. Además, el grupo F 3 0 2 se detecta frecuentemente en la mayoría de los aminoácidos y contiene únicamente el primer grupo carboxilo alfa y los segundos carbonos del esqueleto del aminoácido.Sin embargo, debido a que este pico de Ms. suele tener altas relaciones de ruido respecto a la señal, no se recomienda utilizar F 3 0 2 para analizar cuantitativamente los flujos metabólicos. La derivatización de aminoácidos o metabolitos centrales introduce cantidades significativas de isótopos naturalmente marcados, incluyendo carbono 13, oxígeno 18, silicio 29 y silicio 30. El ruido de medición proveniente de los isótopos naturales en la masa bruta o en el espectro isotópico puede corregirse mediante el uso de software publicado.Los datos finales de marcado isotópico se reportan como fracciones de masa. Por ejemplo, M cero, M1, M dos, M tres y M cuatro, que representan fragmentos que contienen de cero a cuatro átomos de carbono marcados con carbono 13 en la ciana. Estos 5 1 1 2 no contienen la enzima treonina amonialiasa, que cataliza la conversión de treonina a 2-ceto butirato en la vía típica de síntesis de isle. Por lo tanto, para resolver la vía del isle en este organismo, se cultivó Cyana THESEI 5 1 1 42 en medio ASP dos con glicerol 54 milimolar y se analizó mediante GCMS como se describe en este video y se muestra aquí. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 utiliza glicerol marcado en la posición secundaria como fuente principal de carbono, y observamos que la treonina y la alanina, cuyo precursor es el piruvato, tienen un carbono marcado, mientras que la ISO leucina estuvo marcada con tres carbonos. Por consiguiente, la síntesis en Cyana, estas 5 1 1 4 2 no puede derivarse de la ruta de la treonina empleada por la mayoría de los organismos. Por otro lado, la leucina y la ISO leucina presentan patrones de marcado idénticos basados en el fragmento M menos 15 y el fragmento M menos 1 59.Por ejemplo, el isótopo o los datos del nitrógeno-15 provenientes de aminoácidos NO FRAGMENTADOS mostraron un etiquetado idéntico para la leucina y la isoleucina. Por lo tanto, la leucina y la isoleucina deben sintetizarse a partir de los mismos precursores, piruvato y acetil-CoA. Esta observación es coherente con la transición del carbono marcado en la vía del citramalato para la síntesis de isoleucina.Este método puede utilizarse para investigar el metabolismo de una amplia diversidad de microbios, y una vez dominado, puede realizarse de principio a fin en aproximadamente una semana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Estables flujos de trabajo que emplean isótopos de...

Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear<sup&gt; 18</sup&gt; O-agua enriquecida

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son proteínas multidominio que codifican tanto GTPasa y dominios quinasa y que son fosforilados en las células. Aquí, se presenta un protocolo para etiquetar LRRK1 y LRRK2 en las células con 32 P ortofosfato, proporcionando así un medio para medir sus niveles generales de fosforilación celular.

Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

La validación de las actividades enzimáticas implicadas en las vías bioquímicas se puede elucidar el uso de análisis de complementación funcional (FCA). Se describe en este manuscrito es el ensayo FCA que demuestra la actividad enzimática de las enzimas implicadas en el metabolismo de aminoácidos, estrictas respuesta bacteriana y la biosíntesis de peptidoglicano bacteriano.

Análisis de Complementación funcional (FCA): Un ejercicio de laboratorio diseñado e implementado para Complementar la enseñanza de la bioquímica Pathways

Este protocolo describe un procedimiento experimental cuantitativa y comprensivo investigar el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes. Este flujo de trabajo, basado en una combinación de experimentos de trazador isotópico y de un procedimiento analítico permite el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de moléculas sintetizado por microorganismos a determinar.

Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) es un método altamente sensible, confiable y fácil de realizar para detectar la modificación reversible de los residuos de cisteína (S-acylation) en una variedad de muestras biológicas.

Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

Se describen los procedimientos experimentales para realizar el etiquetado covalente a base de dietilpirocarbonato con detección espectrométrica de masas. El dietilpirocarbonato simplemente se mezcla con la proteína o complejo proteico de interés, lo que lleva a la modificación de residuos de aminoácidos accesibles al disolvente. Los residuos modificados se pueden identificar después de la digestión proteolítica y la cromatografía líquida / análisis de espectrometría de masas.

Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

Los protocolos describen métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento acoplados al índice de refracción o a la detección espectrométrica de masas para estudiar reacciones metabólicas en sistemas complejos libres de células basados en lisato.

Cromatografía líquida acoplada a la detección de índice de refracción o espectrometría de masas para perfiles de metabolitos en sistemas libres de células basados en lisato

El método desarrollado de marcaje con 13C6-glucosa combinado con espectrometría de masas de alta resolución por cromatografía líquida es versátil y sienta las bases para futuros estudios sobre los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, así como la utilización integral de estos metabolitos secundarios.

13Marcaje deC-6-glucosa asociado con LC-MS: identificación de órganos primarios de plantas en la síntesis de metabolitos secundarios

El video que acompaña describe el uso del sistema de fraccionamiento GELFREE 8100, las particiones que las muestras de proteínas complejas sobre la base del peso molecular y se recupera la fracción en fase líquida. El video describe cómo funciona la tecnología, cómo se utiliza, y proporciona los datos resultantes, con el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de homogeneizado fraccionada hígado de bovino.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

Aprende a analizar el metabolismo bacteriano mediante el etiquetado con carbono-13 y cromatografía de gases-espectrometría de masas. Este método permite trazar vías metabólicas funcionales en microorganismos fotosintéticos como cianobacterias.

Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de¹³ C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

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