Name: La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a disecar y cultivar ganglios estatoacústicos y médula espinal de pollo en geles de colágeno tridimensionales. Este método permite evaluar el crecimiento de neuritas en respuesta a factores de crecimiento en condiciones libres de suero.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant RO1DC002756 y la Fundación de Investigación de Purdue. Damos las gracias a Doris Wu y Chang Wiese para el consejo con los experimentos y McPhail Rodney para ayudar con las cifras.

Recetas Timbres de pollo <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Agua (grado de cultivo de tejidos) </td></tr></tbody></table> Nota: Ajustar el pH a 7.4. Alcanzar un volumen final de 1000 ml con agua. PBS 10 veces <table border="1"><tbody><tr><td> 40 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,2 g </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 ml </td><td> DEPC agua </td></tr></tbody></table> Nota: Ajustar el pH a 7.4. Traiga finalesvolumen a 500 ml con agua. Concentración de trabajo (1X) se hace mediante la dilución de un stock de piezas 10 veces en 9 partes de agua de grado de cultivo de tejidos, como la obtenida con un sistema de irradiación UV Millipore para generar agua con 18 mW cm de conductividad. SAG medio de la celebración de explante <ul><li> DMEM/F12 con L-glutamina, Hepes 10 mM </li><li> 10% de la insulina, la transferencia, el selenio (ITS 1) </li><li> 1% de la pluma de estreptococos </li></ul> Explante medio de cultivo <ul><li> SAG medio de la celebración de explante </li><li> 10 ng / ml neurotrofina 3 (NT-3) </li><li> 10 ng / ml de factor neurotrófico ciliar (CNTF) </li></ul> Disección de la médula espinal y el medio de mantenimiento <ul><li> L-15 </li><li> 10% de suero fetal bovino </li><li> 1% de la pluma de estreptococos </li></ul> Huevos se incuban a 37-38 ° C. Esterilizar las herramientas de disección y un plato Sylgard disección en el 70% de etanol. La disección de los platos y las herramientas también pueden ser esterilizados UV durante la noche. <ol><li> Cuentas a cabo en un microtubo con 1 ml de PBS estéril, mezclar y esperar a que las cuentas se deposite en el fondo del tubo. </li><li> Lave las cuentas varias veces, eliminando el sobrenadante después de las cuentas se han establecido y se resuspenden en PBS. </li><li> Incubar las cuentas de la proteína purificada (diluida en PBS) o PBS solo (control) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Aclarar las cuentas en PBS y guardar en una placa de 24 pocillos con 1 ml de PBS hasta que se coloque en el colágeno. </li></ol> 2. La disección ganglionar Statoacoustic <ol><li> En E4 extraer el embrión del huevo y colocarlo en un plato de pollo con una solución de Ringer para eliminar las membranas embrionarias. </li><li> Lugar al embrión en un plato de petri Sylgard © alineados llenos de HBSS frío y la posición del embrión en su lado de la vesícula ótica hacia arriba. Pin del embrión al plato con alfileres de disección. </li><li> El uso de dos pines de disección, hacer un corte horizontal a través de la piel inmediatamente ventral a labolsas de canal, aproximadamente donde se encuentra el conducto coclear. Haga un corte vertical anterior y posterior a la SAG. El uso de fórceps o un alfiler de disección para levantar y remover la capa de piel bordeado por los tres cortes. Nota: El SAG se localiza en el borde anteroventral del otocyst, a medio camino entre la bolsa dorsal que es fácilmente visible con iluminación de campo claro de base, y el conducto coclear ventral que se proyecta ventromedially y es oscurecida por los arcos faríngeos. El conducto coclear se alarga por lo que su dimensión dorsoventral irá aumentando progresivamente en la E4 entre Hamilton Hamburguesa etapas de 23 hasta 25 sept. </li><li> Tire de la otocyst en dirección posterior para separarla de la SAG. Desplazar el tejido que rodea el SAG con alfileres de disección y retire con cuidado la SAG desde el embrión utilizando # 55 pinzas. Eliminar grandes porciones de tejido mesenquimal y manojos de nervios que sobresalen de la SAG. </li><li> Con una punta de pipeta de boca ancha, la transferencia de los explantes a un24 pocillos con 0,5 ml de la celebración de explante SAG medio. Mantener los explantes en hielo oa temperatura ambiente por hasta 4 horas. </li></ol> 3. Disección de la médula espinal <ol><li> Extraer el embrión E6 del huevo y colocarlo en un plato de pollo que contiene la solución de Ringer. Quitar la cabeza y las membranas embrionarias. </li><li> Colocar el cuerpo en un Sylgard © plato que contiene la disección fría disección de la médula espinal medio. Posición y el pin del embrión &quot;abajo ventral&quot; y caudal hacia el experimentador. Coloque pasadores de disección a través de cada miembro y por el extremo anterior. </li><li> El uso de pinzas y / o la disección de los pernos, retire con cuidado la piel y el tejido, se mueve en dirección ventral, hasta que la superficie dorsal de la médula espinal es visible. </li><li> Cortar la línea media dorsal de la médula espinal con una aguja de disección, en una posterior a la dirección anterior, a lo largo de toda la longitud de la médula espinal. Esto crea un &quot;libro abierto&quot;, como los lados izquierdo y derecho de la médula espinal por separado. </li><li&gt; Eliminar los tejidos circundantes, lateralmente, para aislar a la médula espinal y exponer los ganglios de la raíz dorsal (GRD). Retire el DRG y las meninges frotando un pin o una pinza de disección entre la médula espinal y DRG. </li><li> Eliminar la médula espinal del cuerpo por la celebración de la final-la mayoría de caudal de la médula espinal con unas pinzas y el levantamiento de arriba y lejos del experimentador. Quitar DRG restantes y las meninges. </li><li> Sostenga un extremo de la médula espinal con unas pinzas el (o pin a la placa) y el uso de tijeras para cortar a lo largo de Vannas la línea media ventral, a dividir en dos la columna vertebral. </li><li> Sostenga un extremo del explante con una pinza para inmovilizar el tejido y el uso de tijeras para cortar Vannas explantes pequeños (100-500 um de longitud) a lo largo de la longitud del tejido. La placa de piso puede ser reconocido como un engrosamiento del tejido claro lo largo del borde explante uno. </li><li> Utilice una punta de pipeta de boca ancha para la transferencia de los explantes a un plato y 24 con 0,5 ml de medio de la disección en frío. Mantener los explantes en el hielo para mantener la viabilidad del tejido, fo hasta 4 horas. </li></ol> 4. Explante cultura con proteínas purificadas para poner a prueba la capacidad de respuesta de neuritas <ol><li> Prepare un 1,5 mg / ml solución de colágeno en un tubo cónico de 15 ml, en el hielo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Verificar la solución de colágeno tiene un pH de 7-7,4 papel con indicador de pH. Ajustar el pH mediante la adición de NaOH en volúmenes de 1 l. </li><li> La transferencia de los explantes a una placa de 24 pocillos con una pipeta de punta de la boca ancha y el exceso de líquido aspirado. Explantes múltiples pueden ser cultivadas en un pozo, pero se debe colocar por lo menos 500 m uno del otro. </li><li> Añadir 0,5 ml de colágeno en el pozo que contiene el explante. La posición del explante en la superficie del fondo del pozo. Asegúrese de ajustar cada cultura antes de proceder con la siguiente y debido a que el colágeno se empiezan a polimerizar a temperatura ambiente. </li><li> Colocar la placa de cultivo de A ° C más caliente de diapositivas durante 30-45 min para polimerizar el colágeno 37. Cuando el colágeno se ha polymerized que se asemejan a un gel. </li><li> Añadir 0,5 ml de medio de cultivo de explantes cálida complementada con proteínas purificadas (diluido en PBS) o PBS (control) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Efectos sobre el crecimiento de las neuritas debe ser visible a las 24 horas. NOTA: Hemos utilizado el mismo protocolo de explantes SAG cultura hasta 42 horas. </li></ol> 5. Explante co-cultivo con cubierta de proteínas cuentas para poner a prueba neurite direccional <ol><li> Comience con pasos explante cultura 4.1-4.4. </li><li> Con una pipeta, transferir 5.1 cuentas de PBS a la fuente que contiene la solución de colágeno y explante. </li><li> Use unas pinzas para colocar cuentas de 50 a 500 micras desde el borde del explante. </li><li> Coloque la placa en A ° C más caliente de diapositivas por 30-45 min para polimerizar el colágeno 37. El tejido o cordón puede llegar a ser desplazados como el colágeno se polimeriza. Compruebe las culturas y volver a colocar el tejido y los granos durante los primeros 5 min. </li><li> Añadir 0,5 ml SAG medios de comunicación a cada pocillo e incubar durante 24 horas. </li></ol> 6. Visualización de crecimiento de las neuritas mediante técnicas de inmunohistoquímica <ol><li> Enjuague las culturas en PBS y fijar, por 1 hora a temperatura ambiente en el 4% de paraformaldehído en PBS. </li><li> Liberación de los geles de las paredes de los pozos mediante el trazado de los bordes de los geles con el extremo redondeado de una espátula de teflón micro. Realizar la inmunotinción con los geles en los pozos. Enjuagar varias veces con PBS. </li><li> Incubar en 0,5 ml de solución de bloqueo (10% de suero de ternera, 0,1% Triton X-100, azida de sodio al 0,1% en PBS) durante la noche a 4 ° C. </li><li> Incubar en 0,5 ml de anticuerpo primario (anti-β-tubulina anticuerpo diluido 1:500 en solución de bloqueo) la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuagar varias veces con PBS. Incubar en el anticuerpo secundario de 0,5 ml (Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón de anticuerpos IgG 2b diluido 1:500) durante la noche a 4 ° C. A partir de este paso adelante, mantener las placas en la oscuridad o envolver en papel de aluminio, debido a la sensibilidad a la luz desecundaria de anticuerpos. </li><li> Enjuagar varias veces con PBS y se almacena a 4 º C en PBS durante hasta una semana. </li></ol> 7. Resultados representante <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> Figura 1. Los resultados representativos de los efectos de promoción de neuritas purificada NT-3 y NT-3-revestida de piedras en los explantes E4 SAG pollo. SAG cuerpos neuronales de células y axones se immunostained con β-tubulina y la imagen con un objetivo de 10x en un microscopio confocal. Después de 24 horas in vitro, los explantes SAG mostrado un mayor crecimiento de las neuritas en la presencia de 100 ng / ml humana purificada NT-3 añade al medio de cultivo celular (1B), en comparación con los controles (1A). Neuronas SAG fueron co-cultivadas con granos empapados IN100 ng / ml de NT-3 para demostrar que una fuente puntual de NT-3 a nivel local puede promover crecimiento de las neuritas. Los explantes se muestra más y más densa extensión de neuritas en el lado de laexplante frente al cordón en comparación con el lado opuesto (1D) y en comparación con el control de las culturas con los granos remojados en PBS (1C). Barra de escala = 200 micras. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos de los efectos de promoción de neuritas purificada Wnt5a y cuentas Wnt5a recubierto en la médula espinal de pollo E6. Explantes de la médula espinal se immunostained con β-tubulina y la imagen con un microscopio confocal. Después de 24 horas de crecimiento en presencia de agua purificada ratón Wnt5a (400ng/ml), crecimiento de las neuritas a partir de explantes de pollo de la médula espinal se incrementó (2B), en comparación con los controles cultivados sin Wnt5a (2A). Bolas empapadas en 500 ng / ml Wnt5a, puesto 300-500 m desde el borde de los explantes de la médula espinal, también se promueve crecimiento de las neuritas (2D) en comparación con el control de las culturas (2C). Similares de co-cultivo resultados fueron publicados previamente con Wnt5a células que expresan 8. Barra de escala = 200micras.

<ol><li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li>
<li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inner+ear+afferent+connections%3A+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li>
<li>Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+conveys+semaphorin+and+VEGF+signaling+during+neural+and+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development.</a> Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).</li>
<li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li>
<li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li>
<li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons%3A+comparison+with+an+otocyst-derived+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li>
<li>Juurlink, B. ernhardH. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture.%22%5BJournal%5D)">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li>
<li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li>
<li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li>
<li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens%3A+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li>
<li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li>
<li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se presenta un método para analizar la cultura y la SAG E4 y E6 explantes de la médula espinal, de pollo, bajo condiciones libres de suero. Este procedimiento se utiliza actualmente en nuestro laboratorio para estudiar los efectos de diferentes ligandos secretados en la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas. Aspectos novedosos de este protocolo incluye el uso de un sistema libre de suero para los explantes de cultivo y el uso de los granos remojados en factores de crecimiento para estudiar los ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Equipo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td></td><td></td><td> Nosotros usamos un microscopio estereoscópico Leica M80 con campo claro base de la iluminación </td></tr><tr><td> Deslice más cálido </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Polimerización del colágeno </td></tr><tr><td> Incubadora de huevo de gallina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 humidificado incubadora de cultivo celular </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Materiales disección </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard ycopia, revestido placa de Petri </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> De 24 y placa de cultivo celular </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Pasadores de acero inoxidable de disección </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26002-10 </td><td> Embrión de la fijación, la disección fina </td></tr><tr><td> Moria cuchara perforada </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10370-17 </td><td> Embrión de la cosecha / transferencia </td></tr><tr><td> 200 l de ancho consejos boca pipeta </td><td> Punto Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Explante de transferencia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 y E6 huevos de pollo </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Solución de Ringer de pollo </td><td></td><td></td><td> Embrión de la cosecha </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG disección </td></tr><tr><td> L15 </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Disección de la médula espinal medio </td></tr><tr><td> Suero fetal bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11150 </td><td> Disección de la médula espinal medio </td></tr><tr><td> Vannas Tijeras </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 501778 </td><td> Disección de la médula espinal </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colágeno preparación </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> De cola de rata colágeno de tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Explante cultura </td></tr><tr><td> 10X PBS (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralize colágeno </td></tr><tr><td> NaOH 1N (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralizar el colágeno </td></tr><tr><td> Agua destilada (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralizar el colágeno </td></tr><tr><td> papeles indicadores de pH (6.0-8.1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Para comprobar el pH de colágeno </td></tr><tr><td> 15 ml tubos cónicos </td><td> Punto Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 l de ancho consejos boca pipeta </td><td> Punto Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Al colágeno pipeta </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explante cultura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Medio DMEM/F12 </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explante medio de cultivo </td></tr><tr><td> SU 1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Suplemento de medio </td&gt; </tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Suplemento de medio </td></tr><tr><td> CNTF (rata) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Suplemento de medio </td></tr><tr><td> NT-3 (humanos) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Suplemento de medio </td></tr><tr><td> Purificada ratón Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel azul perlas de gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inmunohistoquímica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fijación </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Enjuagues </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> Sodioazida </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> De suero de ternera </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Solución de bloqueo </td></tr><tr><td> Monoclonal de ratón anti-β IgG2b tubulina 1 + II de anticuerpos </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Etiquetas de los cuerpos celulares y axones </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón de anticuerpos IgG2 b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Detecta anticuerpos β tubulina </td></tr><tr><td> Espátula de teflón micro </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Liberación de geles de colágeno, así </td></tr></tbody></table>

la disección del ganglio y cultura polluelo statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Los órganos sensoriales del oído interno de pollo son inervados por los procesos periféricos del ganglio statoacoustic (SAG), las neuronas. Inervación sensorial del órgano depende de una combinación de señales de orientación axón 1 y 2 factores de supervivencia situadas a lo largo de la trayectoria de los axones en crecimiento y / o dentro de sus objetivos órgano sensorial. Por ejemplo, la interferencia funcional con una vía axón orientación clásica de señalización, semaforina-neuropilina, genera misrouting de los axones ótica 3. Además, varios factores de crecimiento expresados ​​en los objetivos sensoriales del oído interno, incluyendo la neurotrofina-3 (NT-3) y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), han sido manipulados en animales transgénicos, lo cual también misrouting de 4 axones SAG. Estas mismas moléculas promueven la supervivencia y crecimiento de las neuritas de neuronas SAG pollo in vitro 5,6. En este sentido, describir y demostrar el método in vitro que actualmente ucantar para poner a prueba la capacidad de respuesta de neuritas SAG de pollo a las proteínas solubles, como morfógenos conocido como el Wnts, así como los factores de crecimiento que son importantes para promover la extensión de neuritas SAG y la supervivencia de las neuronas. El uso de este sistema de modelo, que esperamos para sacar conclusiones sobre los efectos que los ligandos secretados pueden ejercer sobre la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas. Explantes SAG se diseccionan en el día embrionario 4 (E4) y cultivadas en geles de colágeno tridimensional bajo condiciones libres de suero durante 24 horas. En primer lugar, la capacidad de respuesta de neuritas es probado por el cultivo de explantes con la proteína-medio suplementado. Luego, para preguntar si las fuentes puntuales de ligandos secretados pueden tener efectos direccionales en neurite, los explantes son co-cultivadas con granos recubiertos de proteínas y ensayados para la capacidad de la cuenta para promover a nivel local o inhibir la extensión. También se incluye una demostración de la disección (protocolo modificado 7) y la cultura de E6 explantes de la médula espinal. Nosotrosutilizan de forma habitual explantes la médula espinal para confirmar la bioactividad de las proteínas y los granos remojados en proteínas, y para verificar las especies de reactividad cruzada con los tejidos de pollo, bajo la mismas condiciones de cultivo como explantes SAG. Estos ensayos in vitro son convenientes para la rápida detección de las moléculas que ejercen trófica (supervivencia) o el trópico (direccional) efectos sobre las neuronas de la SAG, especialmente antes de la realización de estudios in vivo. Además, este método permite el ensayo de las moléculas individuales en condiciones libres de suero, con una alta supervivencia de las neuronas 8.

Demostramos cómo diseccionar y la cultura de pollo ganglio statoacoustic E4 y E6 explantes de la médula espinal. Los explantes se cultivaron en condiciones libres de suero en geles de colágeno en 3D durante 24 horas. La capacidad de respuesta neuritas se prueba con el factor de crecimiento medio suplementado y con recubrimiento de proteínas cuentas.

La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite

Los órganos sensoriales del oído interno del pollo están inervados por los prolongamientos periféricos de las neuronas del ganglio statoacústico (SAG). La inervación de los órganos sensoriales...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el crecimiento de neuritas en neuronas del ganglio estatoacústico cultivadas in vitro cuando se añaden diversos factores de crecimiento al medio. Esto se logra primero mediante la disección del ganglio estatoacústico y de médulas espinales de control a partir del embrión, para crear X explantes destinados al cultivo. Como segundo paso, los X explantes se colocan en colágeno, ya sea con proteínas solubles para evaluar el crecimiento general, o con microesferas recubiertas de proteína para evaluar el crecimiento direccional.A continuación, X explantes se marcan con anticuerpo anti-tubulina beta y se imaginan con un microscopio confocal. Con el fin de visualizar las neuritas que emergen del ganglio, se obtienen resultados que muestran los efectos que los ligandos secretados pueden ejercer sobre la supervivencia neuronal y el crecimiento de las neuritas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación auditiva, como qué moléculas son importantes para la supervivencia de las neuronas óticas y la guía axonal cuando los órganos sensoriales se inervan.Para comenzar este procedimiento, coloque las

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Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que...

Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

Este ensayo evalúa la capacidad de una molécula de señalización, la proteína morfogenética ósea 7 aquí (BMP7), para reorientar axones de la comisura. Un explante de la médula espinal dorsal de embriones se cultivaron junto a un conjunto de células secretoras de COS los factores de crecimiento candidato. Reorientado axones de la comisura de crecimiento en el explante se visualizan mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Ensayo de la capacidad de difusible moléculas de señalización para reorientar embrionarias axones de la comisura espinal

Los explantes procedentes del sistema de la dopamina mesencéfalo y el cuerpo estriado se utilizan en un ensayo para la matriz de...

Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

Este video muestra el proceso para aislar explantes de ganglios espirales del oído interno y co-cultivarlos con el órgano de Corti en una matriz de electrodos múltiples. Los ganglios espirales se extraen cuidadosamente y se seccionan en secciones de tejido más pequeñas o explantes. Estos explantes se cultivan en el área activa de la matriz de electrodos múltiples para promover el crecimiento del proceso neuronal.

Cultivo de explantes de neuronas espirales murinas en matrices de electrodos múltiples

Este video muestra la construcción de un sistema de cultivo celular de tres compartimentos utilizando colágeno y grasa no reactiva. Este sistema se utiliza para observar las interacciones entre las células de glioma y los axones en tiempo real.

Preparación de placas de cultivo compartimentadas recubiertas de colágeno para el cultivo de células neuronales

Este video muestra el modelo de coculturación de un explante de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann. En condiciones de cocultivo, el ácido ascórbico promueve la diferenciación de las células de Schwann en formas mielinizantes. Las células de Schwann mielinizantes envuelven los axones varias veces para crear una vaina de mielina, que es esencial para la función nerviosa.

Co-cultivo de un explante de ganglios de raíz dorsal con células de Schwann para la mielinización de neuronas

Aquí se describe una célula de Schwann (CS) ensayo de migración en el que las SC son capaces de desarrollar a lo largo de los axones se extienden.

Analizar el desarrollo de células murinas Schwann largo de los axones en crecimiento

Modelos de cultivo celular proporcionan un control detallado de las condiciones ambientales y por lo tanto constituyen una plataforma poderosa para dilucidar numerosos aspectos de la biología de las células neuronales. Se describe un método rápido, barato y fiable para aislar, disociar, y la cultura neuronas sensoriales de los embriones de pollo. También se proporcionan detalles de la preparación de sustratos y inmunocitoquímica.

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Presentamos un protocolo para cultivar explantes primarios de ganglios espirales murinos en matrices de electrodos múltiples para estudiar los perfiles de respuesta neuronal y optimizar los parámetros de estimulación. Dichos estudios tienen como objetivo mejorar la interfaz neurona-electrodo de los implantes cocleares para beneficiar la audición de los pacientes, así como el consumo de energía del dispositivo.

Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

Los ganglios ciliares son parte del sistema nervioso parasimpático. Cultivos neuronales de polluelos CG neuronas fueron demostrados para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones musculares nerviosas. Describimos un protocolo detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas CG a partir de embriones de polluelos.

Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Aprenda a disecar y cultivar ganglios estatoacústicos y médula espinal de pollo en geles de colágeno tridimensionales. Este método permite evaluar el crecimiento de neuritas en respuesta a factores de crecimiento en condiciones libres de suero.

La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite

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