Name: Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprende a cuantificar la actividad desmetilasa de lisina mediante espectrometría de masas MALDI y metilación isotópica con formaldehído deuterado. Este método permite medir cambios en la metilación de lisina con alta precisión en estudios epigenéticos.

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Damos las gracias al Fondo para UAMS Proteómica para el apoyo de espectrometría de masas. Los fondos para este proyecto fue proporcionado por el NIH subvenciones P20RR015569, P20RR016460 y R01DA025755.

Este protocolo se ha modificado de Blair et al. 6. 1. LSD1 desmetilación Ensayo <ol><li> En un volumen final de 20 l, se combinan 125 LSD1 recombinante ng con 0,25 g de di-metilo histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) en tampón desmetilasa (50 mM Tris-Cl, pH 8,5, KCl 50 mM, 5 mM de MgCl 2, 5% glicerol). Además, realizar un control de péptido solo sin enzima. El control es de la sección 3 y no necesita la metilación reductiva. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Para recoger los péptidos, añadir 8 POROS l R2 20 micras perlas a cada muestra y agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Preparar perlas POROS suspendiendo 1 volumen de perlas con un volumen de metanol, y luego añadir 10 volúmenes de 5% de ácido fórmico / 0,2% de TFA. </li><li> Condición dos C 18 ZipTips de aspiración 20 l de TFA al 0,1% en la punta y empujando hacia atrás con una pipeta. Hacer esto dos veces con 0,1% TFA, cuatro veces con 70% acetonitrilo / 0,1% TFA, y cuatro veces de nuevo con 0,1% de TFA. </li><li> Coloque las dos muestras (control y la reacción desmetilasa) en los condicionados C 18 ZipTips pipeteando la suspensión cordón detrás de la resina de C 18 en los ZipTips y empujando el volumen a través de una pipeta. </li><li> Lavar ZipTips dos veces con 20 l de TFA al 0,1%. </li><li> Eluir en 40 l de 70% acetonitrilo / 0,1% de TFA. </li><li> Liofilizar cada eluyente por completo con un concentrador SpeedVac. </li></ol> 2. La metilación reductiva Esta porción del protocolo es una modificación de Blair y cols. Y Rayment et al. 6,7. <ol><li> Vuelva a suspender la reacción desmetilasa en 100 l de tampón fosfato 50 mM, pH 7,4. </li><li> Para la reacción desmetilasa, añadir 8 l de 15 mg / ml de borano de dimetilamina. Borano dimetilamina se disolvió en tampón fosfato 50 mM, pH 7,4, para dar el 15 mg / ml de solución madre.Esto debe hacerse fresco. </li><li> Para la reacción desmetilasa, añadir 16 l de formaldehído 250 mM deuterado. El formaldehído 250 mM deuterado se prepara diluyendo el stock en H 2 0. Esto debe hacerse fresco. </li><li> Incubar a 4 ° C durante 2 horas. </li><li> Repita los pasos 2.2, 2.3 y 2.4. </li><li> Repita el paso 2.2. </li><li> Incubar a 4 ° C durante ~ 15 horas. </li><li> Para la muestra desmetilasa, añadir 12,5 l de Tris 1M, pH 7,4 para sofocar la reacción de metilación reductiva. </li></ol> 3. Espectrometría de masas MALDI <ol><li> Añadir POROS R2 20 micras cuentas a la reacción desmetilasa, y se acumulan en ZipTips como se describe en los pasos 1.3-1.6. </li></ol> Nota: Re-suspender el control en 100 l de tampón fosfato 50 mM, pH 7,4 y tratar como la otra muestra de partida en la etapa 3.1. <ol start="2"><li> Eluir el control y muestras desmetilasa de reacción de los ZipTips sobre una placa de muestra MALDI usando 2 l de 33% saturard ácido 2,5-dihidroxibenzoico. Para preparar el 33% de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, hacer una solución saturada de ácido 2,5-dihidroxibenzoico en 70% de acetonitrilo / TFA al 0,1% y luego se diluye hasta 33% saturado en 70% de acetonitrilo / TFA al 0,1%. Permitir que las muestras eluidas a secar y cristalizar. </li><li> Recoge los espectros de masas con un PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF espectrómetro de masas de alta resolución o disposición de espectrometría de masas MALDI 8,9,10. </li><li> Ver espectros y extraer áreas de los picos que utilizan el software PerkinElmerSciex TOFworks o software proporcionado por el fabricante del espectrómetro de masas. </li><li> Verifique que los productos de reacción por MS 2 con un sistema de espectrometría de masa disponible que proporciona capacidades de espectrometría de masas en tándem. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Con el fin de compensar el solapamiento isotópicos creados mediante el uso de formaldehído pesada (Figura 1B), determinar el área del pico (A) de 13 C 2 y 13 C relativ 4 isótopose para el pico monoisotópico para la muestra de control, que no ha sufrido metilación reductiva (Fig. 2A). La ecuación 1: 13C2 / A 12C = r 1 La ecuación 2: 13C4 / A 12C = r 2 Esto le dará la relación de péptido que existe en estos estados isotópica (r 1 y r 2) específica para su experimento y espectrómetro de masas. </li><li> Utilice la r 1 y los valores de r 2 en las siguientes fórmulas para cuantificar la cantidad relativa de péptido existente en cada estado modificación en la muestra de reacción desmetilasa (Fig. 2B): La ecuación 3: H3K4me2 = A-1 La ecuación 4: H3K4me = A 2 - R 1 (A 1) La ecuación 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - R 1 (A 1))] </li></ol> 5. Los resultados representativos Usando LSD1, se muestra la eficacia de MassSQUIRM para cuantificardesmetilación lisina. Como se describe en la sección de texto del protocolo, se realizó un ensayo desmetilasa con 125 ng de LSD1 y 0,25 g de di-metilo histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina). El control y las muestras de desmetilasa reacción fueron sometidos a la metilación reductiva y espectrometría de masa MALDI. La reacción de control que no se sometieron a la metilación reductiva mostró la envoltura típica isotópica para este péptido y proporcionan áreas de los picos de las ecuaciones 1 y 2 (Figura 2A). El espectro de masas para la reacción desmetilasa proporcionan áreas de los picos de las ecuaciones 3-5 (Figura 2B). Uso de las áreas de los picos del control y la reacción desmetilasa, se determinó que el péptido LSD1 desmetilado para dar a los productos de reacción siguientes: el 33,7% di-metil Lys4, el 42,3% de mono-metil Lys4, y el 24% de la ONU-metilado Lys 4. Consulte a Blair et al. Para el análisis completo de la actividad LSD1 desmetilasa, así como inhibidores de 6 estudios. Nótese que las variables cambiantes, tales como, el tiempo de reacción de la enzimala concentración de la concentración y el sustrato que permitirá un análisis en profundidad de la actividad. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> Figura 1. Visión MassSQUIRM. (A) Un péptido N-terminal de la histona H3 se muestra como siendo sin-(verde), mono-(rojo), o di-(azul) metilado en lisina 4. La variación en la composición química de cada péptido conduce a la ionización diferencial haciendo complejo cuantificación. (B) metilación reductiva convierte todos los residuos de lisina en el estado de di-metilo que provoca que todos los péptidos para ionizar de manera similar. El uso de formaldehído pesado en la reacción de metilación reductiva permite la retención de la identidad de la metilación original. Los círculos vacíos indican metilación luz, mientras que los círculos cerrados indican metilación pesado. Modificado de Blair y cols. 2011 6. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> Figure 2. MassSQUIRM puede utilizarse para cuantificar péptidos diferencialmente metilado. (A) Un di-metilado sintético histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) se analizó mediante espectrometría de masas y los coeficientes máximos relativos al pico monoisotópico se observó como r 1 y r 2 en las ecuaciones 1 y 2. (B) El péptido sintético mismo se incubó con 125 ng LSD1 en tampón desmetilasa de dos horas a 37 ° C. Las muestras se sometieron entonces a MassSQUIRM análisis. Una población mixta de superposición de picos representa los tres estados diferentes de metilación como se ve en la Figura 1B. Las áreas bajo los picos monoisotopic se observa como A 1, A 2 y A 3. Áreas de los picos se utiliza en las ecuaciones 3-5. Los círculos vacíos indican metilación luz, mientras que los círculos cerrados indican metilación pesado. Modificado de Blair y cols. 2011 6.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

MassSQUIRM es un método económico y cuantitativo para el análisis integral de la actividad de la lisina desmetilasas involucrados en mono-y di-metilación. MassSQUIRM ofrece cuantificación no sólo del producto de la reacción, sino también para los productos intermedios. Este ensayo se puede utilizar como una poderosa herramienta en el estudio del mecanismo de desmetilasas histonas LSD1 y otros. También será útil para la clasificación de muchos recién descubiertos enzimas desmetilasa lisina como PHF8 y podrían ser utiliza...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biociencias </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotina péptido </td><td> Elaboración propia </td><td> ninguno </td></tr><tr><td> Poros R2 20 micras cuentas </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> acetonitrilo </td><td> Pescador </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihidroxibenzoico ácido </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borano de dimetilamina </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> isotópicamente pesada d 2-formaldehído </td><td> Cambridge Laboratorios de isótopos </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescador </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Pescador </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Pescador </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Pescador </td><td> G-33 </td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> El metanol </td><td> Pescador </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Fosfato de Na </td><td> Pescador </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac Concentrador </td><td> Sabio </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF espectrómetro de masas y el software TOFworks </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> ninguno </td></tr></tbody></table>

aplicación de masssquirm para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa lisina

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recientemente, los reguladores epigenéticos se han descubierto como actores clave en muchas enfermedades diferentes 1-3. Como resultado, estas enzimas son los principales objetivos para los estudios de moléculas pequeñas y 4 desarrollo de fármacos. Muchos reguladores epigenéticos sólo recientemente se han descubierto y todavía están en proceso de ser clasificados. Entre estas enzimas son desmetilasas lisina que eliminan los grupos metilo de lisinas de las histonas y otras proteínas. Debido a la naturaleza novedosa de esta clase de enzimas, ensayos de pocos se han desarrollado para estudiar su actividad. Este ha sido un obstáculo en el camino tanto para la clasificación y el estudio de alto rendimiento de desmetilasas histonas. Actualmente, los ensayos desmetilasa existen muy pocos. Las que existen tienden a ser de naturaleza cualitativa y no se puede al mismo tiempo discernir entre los estados de metilación de lisina diferentes (un-, mono-, di-y tri-). La espectrometría de masas se utiliza comúnmente para determinar la actividad desmetilasa pero los ensayos actuales de espectrometría de masasno abordar si péptidos diferencialmente metilado ionizar diferente. Ionización diferencial de péptidos metilado hace comparando los estados de metilación difícil y ciertamente no cuantitativa (Figura 1A). Así, los ensayos disponibles no están optimizados para el análisis integral de la actividad desmetilasa. Aquí se describe un método llamado MassSQUIRM (cuantificación de espectrometría de masas utilizando metilación reductiva isotópica) que se basa en la metilación reductiva de grupos amina con formaldehído deuterado para forzar a todos lisinas ser di-metilado, lo que les hace esencialmente las mismas especies químicas y por lo tanto ionizar el misma (Figura 1B). La única diferencia química después de la metilación reductiva es hidrógeno y deuterio, que no afecta a la eficiencia de ionización MALDI. El ensayo MassSQUIRM es específico para los productos de reacción con desmetilasa lisinas un-, mono-o di-metilados. El ensayo es también aplicable a metiltransferasas lisina dando el saMe productos de reacción. Aquí, se utiliza una combinación de la química metilación reductiva y espectrometría de masa MALDI para medir la actividad de LSD1, un desmetilasa lisina capaz de eliminar di y mono-metil grupos, en un sustrato peptídico sintético 5. Este ensayo es simple y fácilmente susceptibles a cualquier laboratorio con el acceso a un espectrómetro de masas MALDI en el laboratorio oa través de una instalación de la proteómica. El ensayo tiene ~ 8 veces el rango dinámico y es fácilmente escalable para formato de placa 5.

Se presenta un método para el uso de espectrometría de masas MALDI y la química de la metilación reductiva para cuantificar los cambios en la metilación de la lisina.

Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina

Recientemente, se ha descubierto que los reguladores epigenéticos son elementos clave en muchas enfermedades diferentes 1-3. Como resultado, estas enzimas son objetivos primordiales para moléculas pequeñas...

El protocolo mass squirm tiene como objetivo cuantificar la actividad de lisina desmetilasa utilizando metilación isotópica y espectrometría de masas MALDI. Primero, realice reacciones de desmetilación catalizadas por enzimas sobre péptidos que contengan lisina metilada. Luego, methylate químicamente los productos peptídicos de la reacción desmetilasa con formaldehído deuterado para producir péptidos uniformemente metilados que ionizan de la misma manera mediante MALDI. A continuación, cuantifique cada especie peptídica mediante espectrometría de masas múltiple y tenga en cuenta la superposición isotópica. Con el fin de identificar las cantidades relativas de péptidos metilados no, mono, di y trimetilados, los resultados de mass squirm determinan las cantidades relativas de cada producto de la reacción desmetilasa basándose en los cambios de masa.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la espectrometría de masas rutinaria de moho es que la puntuación de masas tiene en cuenta las diferencias de ionización entre péptidos con distinta metilación. Tuvimos por primera vez la idea de este enfoque cuando desarrollamos un método para medir los niveles de aceti

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Investigación

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Biología

La actividad de la descarboxilasa inducible lisina es controlada por la reacción del sustrato L-lisina y el producto cadaverina con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic ácido para formar aductos que tienen una solubilidad diferencial en tolueno.

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Se describen dos métodos para asignar las señales de resonancia magnética nuclear de α y ε-dimetilamina de una lisina N-terminal reductivamente metilada con 13C. Un método utiliza la selectividad inducida por el pH de la reacción de metilación reductora, y el otro utiliza la aminopeptidasa para eliminar selectivamente la lisina N-terminal.

Métodos para identificar las resonancias de RMN de la amina 13C-dimetilN-terminal en proteínas metiladas reductivamente

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

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Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

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Un método eficaz para la síntesis de peptoides con monómeros de tipo mixto lisina / arginina del tipo y la evaluación de su actividad anti-Leishmania

Aquí, presentamos imparcial cuantificación de proteína específica acetilación o succinylation ocupación (estequiometría) de un proteoma completo mediante un análisis radiométrica de modificaciones endógenas a modificaciones introducidas después de cuantitativo química acilación con anhídridos marcado con el isótopo estables. En combinación con la espectrometría de masas adquisición independiente de los datos sensibles, se obtienen mediciones de ocupación del sitio exacto.

Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente

Aquí, presentamos un protocolo para medir el compromiso objetivo de KDM1A en una célula humana o animal, muestras de tejido o sangre tratadas con inhibidores de KDM1A. El protocolo emplea el etiquetado quimioprobe de la enzima KDM1A libre y la cuantificación directa de la ocupación objetivo mediante inmunoensayos basados en quimiosondas y se puede utilizar en estudios preclínicos y clínicos.

Medición directa del compromiso objetivo de KDM1A mediante inmunoensayos basados en chemoprobe

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.

Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación

Estos protocolos proporcionan la metodología utilizada para evaluar la actividad enzimática de los miembros individuales de la familia de la proteína arginina metiltransferasa (PRMT) en las células. Las pautas detalladas en la evaluación de actividad de PRMT usando los biomarkers endógenos y exógenos, los anticuerpos de reconocimiento de la metílico-arginina, y los compuestos de la herramienta del inhibidor se describen.

Métodos cuantitativos para estudiar la actividad de la arginina metiltransferasa de la proteína 1-9 en células

Este estudio estableció un método que utiliza la expansión del código genético para incorporar con éxito la lactillisina (Klac) en sitios específicos de la enolasa-1 humana (hENO1) y la GFP superplegadora (sfGFP) en Escherichia coli y células de mamíferos.

Lactilación de lisina específica del sitio mediante expansión del código genético en E. coli y células de mamíferos

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