Aplicación de MassSQUIRM para mediciones cuantitativas de la actividad desmetilasa Lisina

El protocolo de retorsión masiva tiene como objetivo cuantificar la actividad de la lisina desmetilasa utilizando la metilación isotópica y la espectrometría de masas de Maldi, primero realizar reacciones de desmetilación catalizadas por enzimas en péptidos que contienen lisina metilada. Luego, los residuos metilan químicamente los productos peptídicos de la reacción de la desmetilasa con formaldehído deuterado para producir péptidos uniformemente metilados que se ionizan de la misma manera mediante maldi, se procede a cuantificar cada especie de péptido con espectrometría múltiple a masiva y se tiene en cuenta la superposición isotópica. Con el fin de identificar las cantidades relativas de un mono colorante y recortar los péptidos metilados, los resultados de la retorsión de masa determinan las cantidades relativas de cada producto de la reacción de la desmetilasa en función de los cambios en la masa.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la espectrometría de masas mohosa de rutina, es que la puntuación de masa tiene en cuenta las diferencias en la ionización entre péptidos metilados de manera diferente. La primera vez que tuvimos la idea de este enfoque fue cuando desarrollamos un método para medir los niveles de acetilación de histonas utilizando anhídrido acético pesado isotópico. El desafío de esta técnica es extraer datos de área de pico, que pueden complicarse por la superposición de envolturas isotópicas de péptidos.

Para la reacción de desmetilasa se combinaron 125 nanogramos de lisina específica recombinante, desmetilasa una enzima, con 0,25 microgramos de dimetilhisona H tres péptidos biotinilados en un volumen final de 20 microlitros de tampón desmetilasa. También prepare una muestra de control que contenga 0,25 microgramos de péptido sin la enzima LSD, incube la reacción y los tubos de control durante dos horas a 37 grados centígrados. A continuación, para preparar R, dos perlas porosas de 20 micras mezclan volúmenes iguales de perlas y metanol.

A continuación, añada 10 volúmenes de ácido fórmico TFA, añada ocho microlitros de perlas porosas a cada muestra y agite durante 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, acondiciona dos puntas de cremallera C 18. Pipeteo dos veces con 20 microlitros de 0,1%TFA, cuatro veces con 70%acetonitrilo, 0,1%TFA, y cuatro veces de nuevo con 0,1%TFA.

A continuación, cargue las dos muestras en las puntas de cremallera acondicionadas. Con una pipeta, empuje el volumen a través de la resina C 18. Repita hasta que el volumen total de ambas muestras haya pasado por las puntas de la cremallera.

A continuación, lavar las puntas de la cremallera dos veces con 20 microlitros de muestras eluidas al 0,1%TFA en un tampón ilusión de 40 microlitros y proceder a secar completamente con un concentrador de aspiración rápida. En primer lugar, resuspender la muestra en 100 microlitros de tampón de fosfato de 50 milimolares pH 7,4. A continuación, añada ocho microlitros de dimetilamina y 16 microlitros de formaldehído desactivado.

Incubar a cuatro grados centígrados durante dos horas. Repita la metilación reductora agregando dimetillamina perforante y formaldehído deuterado e incube durante dos horas. La tercera vez, agregue la dimetillamina aburrida e incube a cuatro grados centígrados durante 15 horas.

Apague la reacción con 12,5 microlitros de un tris molar. pH 7,4 y proceda a secar completamente con un concentrador de aspiración rápida. En primer lugar, suspender las muestras de control y reacción de desmetilasa en 100 microlitros de tampón de fosfato de 50 milimolares pH 7,4.

Ahora agregue ocho microlitros de perlas porosas a las muestras de reacción de control y desmetilasa y recoja en las puntas de la cremallera como se muestra anteriormente. Eludir en volúmenes de dos microlitros sobre una placa de muestra MALDI y dejar secar a temperatura ambiente hasta la cristalización. Proceda al análisis de muestras por espectrometría de masas.

Abra los archivos de espectro en el software de trabajo y expórtelos al software M sobre Z. Verifique aún más los productos de reacción mediante espectrometría de masas en tándem. En primer lugar, determine la relación de área máxima de los isótopos de carbono 13 C dos y carbono 13 C cuatro en relación con el pico monoisotópico para la muestra de control.

Utilice estas proporciones calculadas para cuantificar la cantidad relativa de péptido existente en cada modificación. Estado de la muestra de reacción de desmetilasa. La enzima LSD uno se puede utilizar eficazmente en la cuantificación de la desmetilación de la lisina.

Dado que la reacción de control no sufre metilación reductora, indica la envoltura isotópica típica para este péptido. Las áreas de pico resultantes determinan las proporciones de fondo del péptido existente en el carbono 13 C dos y el carbono 13 C cuatro. Los estados isotópicos, áreas de pico del espectro de masas para la reacción de control, permiten cuantificar la cantidad relativa de péptido existente en cada estado de modificación. En la reacción de desmetilasa, las áreas pico de estas reacciones de control y desmetilasa determinan 33,7 % de dimetil lisina 4 42 0,3 % de lisina monometil cuatro y 24 % de lisina no metilada cuatro.

Este enfoque de squam masivo ofrece información clave en el campo de la epigenética de histonas, como la forma en que la desmetilación de los residuos de lisina de histonas contribuye a diversas enfermedades. Si bien este ensayo de metilación se ha aplicado para estudiar las demetilasas, también se puede usar para estudiar las metiltransferasas.