Name: Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprende microscopía intravital cuantitativa del bazo para analizar la movilidad de parásitos de malaria y el flujo sanguíneo en ratones infectados con parásitos transgénicos GFP. Este método permite comparar dinámicas esplénicas entre cepas.

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Estamos especialmente agradecidos a S. Graewe y Heussler V. para la formación inicial y continua de entrada en la microscopía intravital de parásitos de la malaria, a J. Burns para la donación de las buenas prácticas agrarias parásitos transgénicos, A. Bosch (Unidad de Confocal, CCIT-UB, IDIBAPS) de asistencia en el análisis de imágenes y la cuantificación y P. Astola de asistencia técnica. Damos las gracias a R. Tous y Caralt I. para la producción de video. MF es un beneficiario de una beca de postgrado de la Generalidad de Cataluña. HAP es un profesor de investigación ICREA. Trabajo en el laboratorio de HAP es financiado por el Programa de la Comunidad Europea Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención N ° 242095, por la privada Fundación Cellex (Cataluña, España), y por el Ministerio español de Ciencia e Innovación ( SAF2009-07760).

<ol><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li>
<li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+enters+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li>
<li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+dermis+of+the+mammalian%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li>
<li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li>
<li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li>
<li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb%2Fc+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li>
<li>Linden, M. vander, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li>
<li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowdler%2C+AJ+%22The+complete+spleen%22">The complete spleen</a>. , Totowa. Humana Press. (2002).</li>
<li>Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+comparing+T+lymphocyte+trafficking+to+the+spleen+and+the+mesenteric+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).</li>
<li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li>
<li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria%3A+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li>
<li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La aplicación de la microscopía intravital del bazo en este modelo la malaria roedores abrió la posibilidad de investigar el paso dinámico de los parásitos a través de este órgano, que hasta ahora ha sido considerado un &quot;recuadro negro&quot;, debido a consideraciones técnicas. Aquí, un gran esfuerzo se puso a adaptar un método cuantitativo que permite el análisis comparativo de las líneas de parásito diferente en los niveles individual y poblacional. En contraste con otros tejidos y células que habían sido fotograf...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Leica TCS SP5-microscopio confocal </td><td> Leica Microsystems, Heidelberg, Alemania </td><td> TCS SP5-N º de serie. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> La ketamina (Ketolar 50 mg / ml) </td><td> Pfizer </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Midazolam 15 mg / 3 ml </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70.000 MW dextrano, conjugado con Texas Red </td><td> Las sondas moleculares </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína, isómero I (FITC) </td><td> Sigma </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1 </td><td> Solución de trabajo es del 10% en agua destilada </td></tr><tr><td> Super Glue-3 Loctite </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravital del bazo: análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

El advenimiento de la microscopía intravital en modelos experimentales de roedores malaria ha permitido grandes avances en el conocimiento de 1,2 interacciones parásito-hospedador. Por lo tanto, de imágenes in vivo de parásitos de la malaria durante el pre-eritrocítica etapas han puesto de manifiesto la entrada activa de los parásitos en los ganglios linfáticos de piel 3, el desarrollo completo del parásito en la piel 4, y la formación de un merosoma hepatocitos derivados para asegurar la migración y liberación de merozoítos en el torrente sanguíneo 5. Por otra parte, el desarrollo de parásitos individuales en los eritrocitos se ha documentado recientemente con imágenes 4D y desafió a nuestra visión actual de la exportación de proteínas de la malaria 6. Por lo tanto, la imagen intravital ha cambiado radicalmente nuestra visión sobre los acontecimientos clave en el desarrollo de Plasmodium. Desafortunadamente, los estudios del paso dinámico de parásitos de la malaria a través del bazo, un órgano linfoide importante exquisitamente adaptados para borrar rojos infectados bcélulas lood faltan debido a limitaciones técnicas. Utilizando el modelo murino de la malaria Plasmodium yoelii en ratones Balb / c, hemos puesto en marcha imágenes intravital del bazo e informó de una remodelación diferencial de la misma y la adherencia de los glóbulos rojos parasitados (pRBCs) a las células de la barrera de origen fibroblástico en la pulpa roja durante la infección con el parásito no letales línea P.yoelii 17X en lugar de las infecciones con el P.yoelii línea 17XL letal parásito 7. Para llegar a estas conclusiones, una metodología específica con ImageJ software libre fue desarrollado para permitir la caracterización de la velocidad en tres dimensiones el movimiento de un solo pRBCs. Los resultados obtenidos con este protocolo permite determinar el tiempo de la velocidad, la direccionalidad y la residencia de los parásitos en el bazo, todos los parámetros de abordar la adherencia en vivo. Además, se presenta la metodología para la cuantificación del flujo sanguíneo mediante microscopía intravital y el uso de DIFdiferentes colorantes para comprender mejor la estructura del complejo de la microcirculación del bazo. Ética declaración Todos los estudios con animales se realizaron en las instalaciones de animales de la Universidad de Barcelona, ​​de acuerdo con las directrices y los protocolos aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Barcelona UB-CEEA (Protocolo n º DMAH: 5429). Mujer ratones Balb / c de 6-8 semanas de edad se obtuvieron de Charles River Laboratories.

Se muestra el método para realizar microscopía intravital del bazo con las buenas prácticas agrarias parásitos de la malaria transgénicos y la cuantificación de la movilidad del parásito y el flujo de sangre dentro de este órgano.

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

El advenimiento de la microscopía intravital en modelos experimentales de malaria en roedores ha permitido avances significativos en el conocimiento de las interacciones parásito-huésped 1,2. ...

En este procedimiento, mostramos un enfoque cuantitativo de microscopía intravital para evaluar la dinámica del paso del parásito a través del bazo. En un modelo de malaria en roedores, se preparan ratones infectados con parásitos transgénicos GFP para la microscopía intravital; la canulación de la vena esplénica permitirá la inyección de colorantes intravitales. Durante el experimento, se obtienen imágenes de células fluorescentes en movimiento en diferentes áreas del bazo.Proporcionamos la metodología para describir la movilidad del parásito en el compartimento lento tridimensional del pulpa roja y calculamos el flujo sanguíneo en los vasos. Estos parámetros se utilizaron para comparar la dinámica esplénica de dos cepas de PULE. Hola a todos.Me llamo Nando El Portillo y una de las principales preguntas de investigación en mi laboratorio es tratar de comprender el papel del bazo en la malaria. La esplenomegalia es uno de los signos característicos de esta enfermedad, pero debido a problemas técnicos y éticos, realizar estudios sobre este órgano es muy difícil. Para lograrlo, hemos implementado tecnologías que nos permiten observar el paso dinámico de este parásito y cuantificar es

intravital-microscopy-spleen-quantitative-analysis-parasite-mobility

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Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

Un ensayo in vitro para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos

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Este artículo informa sobre un método detallado para la medición dinámica y cuantificación de la velocidad del flujo sanguíneo dentro de los vasos sanguíneos individuales de la vasculatura hepática del ratón utilizando imágenes de microscopía intravital en combinación con una metodología específica para la adquisición y análisis de imágenes.

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Los invade parásito de la malaria y se replica dentro de las células rojas de la sangre. La evaluación precisa de la invasión merozoite y parasitemia es por lo tanto crucial para evaluar el curso de la infección por malaria. Aquí se describe un protocolo basado en citometría de flujo para la medición de estos parámetros en un modelo de ratón de la malaria.

En la Evaluación in vivo de roedores Plasmodium parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo

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Debido a las sorprendentes similitudes del ciclo de vida y la biología de los parásitos del paludismo de roedores con los parásitos del paludismo humano, los modelos de malaria de roedores se han vuelto indispensables para la investigación del paludismo. En este documento, estandarizamos algunas de las técnicas más importantes utilizadas en el análisis fenotípico de especies de malaria de roedores de tipo salvaje y transgénico.

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Todas las especies patógenas de Leishmania residen y replican dentro de macrófagos de hospederos vertebrados. Aquí, presentamos un protocolo para infectar macrófagos derivados de médula ósea murinos en cultura con Leishmania, seguida por la cuantificación precisa de la cinética de crecimiento intracelular. Este método es útil para el estudio de los factores individuales que influyen en la interacción huésped-patógeno y virulencia de Leishmania .

Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

Aprende microscopía intravital cuantitativa del bazo para analizar la movilidad de parásitos de malaria y el flujo sanguíneo en ratones infectados con parásitos transgénicos GFP. Este método permite comparar dinámicas esplénicas entre cepas.

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