Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

En este procedimiento, mostramos un enfoque de microscopía intravital cuantitativa para evaluar la dinámica del paso del parásito a través del bazo. En un modelo de malaria en roedores, los ratones infectados con parásitos transgénicos GFP se preparan para la microscopía intravital de la canulación de la vena del bazo que permitirá la inyección de tintes intravitales. Durante el experimento, las células fluorescentes son imágenes que se mueven en diferentes áreas del bazo.

Proporcionamos la mitología para describir la movilidad del parásito en el compartimento lento tridimensional de la pulpa roja y calcular el flujo sanguíneo de los vasos. Estos parámetros se utilizaron para comparar la dinámica del bazo de dos cepas de PUE. Hola a todos.

Mi nombre es Nando El Portillo y una de las principales preguntas de investigación en mi laboratorio es tratar de entender el papel del bazo en la malaria. La esplenomegalia S es uno de los puntos de referencia de esta enfermedad, pero debido a cuestiones técnicas y éticas es muy difícil tratar de abordar los estudios de este órgano. Para ello, hemos habilitado tecnologías que nos permiten ver el paso dinámico de este parásito y cuantificar este fenómeno.

Esto es lo que explicarán Lorena y MI en estos protocolos. Esta investigación se está llevando a cabo en parte en colaboración con los grupos del Dr. Ler de la Universidad de Hamburgo en Alemania y la Dra. Maria Kbo aquí en el Hospital Clinic y ha recibido la financiación general de fion Cellex encontrado y la CIA ministerial En Español, la infección se inicia a partir de un donante M infectado con parásitos GFP letales o no letales al 10% de parásitos. Para controlar el parásito, tome una pequeña gota de sangre de la vena de la cola del ratón y extiéndala en un microscopio.

Deslice una tinción métrica chole con GIMs. Una solución permitirá la visualización de los glóbulos rojos infectados una vez secos, fijar el frotis de sangre con metanol durante dos minutos, aplicar una solución a los GIM e incubar durante 20 minutos. Lave el portaobjetos con agua corriente del grifo y seque el porcentaje de pbcs sobre el total de glóbulos rojos utilizando un microscopio óptico con cien x aceite. Objetivo.

Infectar ratones con parásitos letales o no letales obtenidos de la sangre de la cola de ratones donantes diluidos en PBS. Ajustar la dosis para inyectar medio millón de parásitos por ratón con el fin de alcanzar un parásito periférico del 1% al tercer día post-infección e inyectar Intraperitoneal. Alternativamente, los glóbulos rojos marcados con FITC se pueden usar en el control.

Los animales recogen un mililitro de sangre arterial de un ratón y lavan el pellet por centrifugación en PBS que contiene EDTA re span en solución de FITC e incuban durante dos horas en la oscuridad con una suave agitación. Pasado ese tiempo, retirar el sobrenadante por centrifugación y lavar abundantemente. Inyectar en un ratón de control hasta un promedio del 1% en circulación periférica y proceder a experimentos in vivo.

Hola, soy mija. Para obtener imágenes del bazo in vivo, necesitamos realizar una pequeña sinergia del animal para exponer el bazo de una manera obvia con esta técnica. Lo aprendí de Stephanie GR en el laboratorio de la trabajadora Heisler, a quien me gustaría agradecer y ahora les mostraré cómo proceder.

Imagen de miosis infectada Se realiza al tercer día después de la infección, cuando la proporción es del 1% en ambas cepas. Mantenga el ratón anestesiado y a temperatura regulada durante todo el procedimiento. Proteja los ojos de la hidratación y verifique que el ratón esté completamente anestesiado haciendo ping a la almohadilla del pie antes de proceder para facilitar la administración intravenosa de sustancias.

Durante el transcurso del experimento, canula la vena de la cola del ratón para construir la cánula. Inserte una aguja pequeña en un extremo de un tubo y su aplicador en el otro. Cargue la cánula con suero fisiológico que elimine las burbujas y compruebe que la solución fluye correctamente a través de la cánula.

La vena lateral de la cola quedará canulada limpia. Mejora su visibilidad haciendo una constricción suave en la base de la cola. Introducir la punta de la cánula en el interior de la vena.

La aparición de sangre indicará que la aguja está bien colocada. Si no es así, repita la canulación aguas arriba de la vena, luego fije la cánula a la cola con pegamento y cinta adhesiva. Exponga la parte inferior del bazo a través de una pequeña incisión en la piel y la musculatura en el lado dorsal izquierdo del animal.

Coloque un bazo donde se observe menos movimiento de la respiración y aplique PBS sobre la superficie expuesta para mantenerlo limpio de pelo de ratón e hidratado. Selle el bazo con una cubierta de sueño para permitir la visualización. Hola, mi nombre es Lorena.

El protocolo mostrado nos permitirá visualizar el movimiento de los parásitos PULI a través del bazo. Esto ha sido posible gracias a los parásitos transgénicos GFP. Por favor, haga una donación de James Burnes de la Universidad de Drexel.

Las imágenes del movimiento de los parásitos fluorescentes nos permitirán saber si hay diferencias en el comportamiento entre cepas letales y no letales. Los experimentos de microscopía de Vidal se llevaron a cabo en un microscopio multifotónico Leica, equipado con un sistema de incubación con control de temperatura y un objetivo de glicerol de 63x. Coloque al animal en la platina del microscopio con un bazo de sueño cubierto hacia abajo hacia el objetivo. Inicialmente.

La visualización del bazo con aumentos más bajos proporcionará una visión general de la estructura microcirculatoria del órgano. Enfoca el bazo utilizando tejido autofluorescente, se observan parásitos GFP que pasan a través de las diferentes áreas del bazo. Hola, mi nombre es Maria Albo de Centros Científicos y Tecnológicos de la Universidad de Barcelona, y haremos imágenes intravitales del bazo.

Para estudiar el flujo sanguíneo y la movilidad de los glóbulos rojos infectados, utilizaremos un microscopio confocal dotado de un escáner resonante que permite obtener imágenes a alta velocidad y muy útiles para evitar el movimiento del órgano. Se trata de un microscopio espectral que permite seleccionar el rango de visión. Con el fin de obtener imágenes muy rápidas, haremos la adquisición simultánea de las dos fluoresceínas, el marcaje y la reflexión.

Seleccione diferentes zonas para obtener imágenes con la ayuda de glóbulos rojos, reflexión, contraste y tintes Vidal para evidenciar la microvasculatura del bazo. Ahora explicaremos cómo medir la movilidad del parásito en el flujo sanguíneo de los vasos utilizando la microscopía Vidal y el software de imagen J para seguir el movimiento del parásito en la malla tridimensional de la pulpa roja. Adquiera imágenes a través de cinco profundidades Z utilizando un modo de escaneo de alta velocidad.

Convierta pilas de imágenes en películas de color codificadas Z para facilitar el seguimiento de una sola célula fluorescente. La información detallada se proporciona en el texto, rastree diferentes partículas a lo largo del tiempo en la profundidad de cada video utilizando las coordenadas X, Y, Z y T, los parámetros de movilidad como la direccionalidad, la velocidad media y el tiempo de residencia se pueden calcular y representar como mapas de distribución para permitir el análisis comparativo entre las poblaciones de deformación. El flujo vascular en el bazo se puede visualizar mediante la inyección sistémica de varias moléculas fluorescentes descritas en la tabla de soporte, como la dextrina.

Y mediante el uso de contraste de reflexión de eritrocitos endógenos, escanee la línea central, el flujo sanguíneo ajustando los vasos horizontalmente en la dirección del escaneo láser y utilizando un promedio de línea mejorado. En estas imágenes, las rayas resultantes del movimiento de las células se utilizarán para calcular el flujo sanguíneo, tomar imágenes de vasos con diferentes diámetros y durante el ciclo cardíaco para compensar las fluctuaciones. El bazo se ha considerado durante mucho tiempo una caja negra en la investigación de la malaria y aquí desarrollamos un enfoque de microscopía intravital cuantitativa para obtener información sobre la dinámica de la infección por parásitos y el flujo sanguíneo en este órgano, lo que nos permite abordar cuestiones biológicas importantes, como la adherencia in vivo de los glóbulos rojos infectados al bazo.

Gracias y.