La construcción de un hidrogel de colágeno para la entrega de la madre microesferas cargadas con células quitosano

Este protocolo ofrece una estrategia in vitro para entregar células madre a partir de microesferas de quitosano en un andamio de gel de colágeno, cosechar y cultivar. A continuación, las células madre de los adipocitos primarios emulsionan y recuperan una preparación de microesferas de quitosano. A continuación, siembre las células madre en las microesferas de quitosano y cultívelas en un inserto de placa de cultivo de membrana de ocho micras de tamaño de poro para producir un CSM cargado de CS, finalmente mezcle el sistema de administración de microesferas con un andamio de gel de colágeno tridimensional.

En última instancia, este sistema CSM ofrece potencial para su uso en medicina regenerativa y administración de fármacos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inyección celular o la microencapsulación, es la capacidad de las células para unirse a un material portador y persistir después de la aplicación inicial. Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las microesferas de esan tienen una carga estática inherente.

Y cargar las células sobre un lecho de microesferas será un desafío sin perturbarlas. Extirpe y lave, el tejido adiposo perineal y epidérmico de una envoltura pique el tejido, luego transfiera de uno a dos gramos a 25 mililitros de HBSS que contienen 1% de FBS. Después de la centrifugación, recoja la capa de tejido adiposo que flota libremente en un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros.

Añadir 25 mililitros de colagenasa tipo dos e incubar la reacción en un agitador orbital. Ahora retire con cuidado la fracción líquida debajo de la capa de aceite y adiposo y filtre secuencialmente a través de filtros de malla de nailon de 170 micras. Recolectar las células por centrifugación después de dos lavados con 25 mililitros.

HBSS Resus, suspenda el pellet en 30 mililitros de medio de crecimiento mesen pro suplementado. Divida las células madre derivadas del tejido adiposo purificadas en dos matraces de cultivo T 75 y amplifique la preparación de A SC en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Este protocolo CSM es un proceso de emulsificación de agua en aceite que utiliza una técnica de coer iónico.

Emulsionar seis mililitros de una solución acuosa de quitosano en 100 mililitros de una mezcla en fase oleosa utilizando agitación aérea y magnética simultáneamente en direcciones opuestas durante una hora a la emulsión estable de agua y aceite, añadir 1,5 mililitros de hidróxido de potasio al 1% en n octal cada 15 minutos durante cuatro horas. Una vez completada la reacción de reticulación iónica, decantar lentamente la fase oleosa e inmediatamente agregar las esferas a 100 mililitros de acetona. Lave las esferas con acetona hasta que la fase oleosa se elimine por completo.

A continuación, seque las esferas recuperadas al vacío. Desecar determine el tamaño de partícula promedio, el área de superficie por miligramo y el volumen cúbico unitario utilizando el analizador de tamaño de partícula. Proceda a lavar CSM tres veces con agua estéril para eliminar las sales residuales.

Ahora esterilice la preparación de CSM con alcohol absoluto para su uso en experimentos celulares en un tubo de vidrio de 50 mililitros, mezcle cinco miligramos de microesferas con un mililitro de solución de TNBS al 0,5% e incube durante cuatro horas a 40 grados Celsius. Luego agregue tres mililitros de ácido clorhídrico normal y cocine a 60 grados centígrados durante dos horas. Después de enfriar las muestras a temperatura ambiente, agregue cinco mililitros de agua desionizada y 10 mililitros de éter Ethel.

Para extraer el TNBS libre, retire una alícuota de cinco mililitros de la fase acuosa y caliéntelo a 40 grados centígrados en un baño de agua durante 15 minutos para evaporar cualquier éter residual después de enfriar a temperatura ambiente. Diluir con 15 mililitros de agua con un espectrofotómetro. Mida la absorbancia de las microesferas de quitosano preparadas a 345 nanómetros utilizando TNBS como blanco.

Mida también el quitosano utilizado para la preparación del CSM. Ahora, calcule el número de grupos amino libres del CSM en relación con el número total de grupos amino en el quitosano. Equilibre cinco miligramos de CSM esterilizado en HBSS estéril durante la noche.

Transfiera el CSM a un inserto de membrana de ocho micras para placas de cultivo de 24 pocillos. Una vez que el CSM se haya asentado, aspire cuidadosamente el HBSS. Ahora agregue 300 microlitros de medio de crecimiento al interior del inserto y 700 microlitros de medio de crecimiento al exterior del inserto. Resus.

Suspender las células madre derivadas del tejido adiposo en 200 microlitros de crecimiento, medio y semilla sobre el CSM dentro de la placa de cultivo. Inserte la incubación durante 24 horas en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Transfiera el CSM cargado con SC a un tubo de microcentrífuga estéril sin perturbar las células que han migrado a la membrana del inserto.

Ahora retire el medio residual y agregue 250 microlitros de medio de crecimiento fresco a cada tubo. Añadir 25 microlitros de cinco miligramos por mililitro de solución de MTT e incubar durante cuatro horas. Retire el medio y agregue 250 microlitros de vórtice de óxido de sulfato de dimetilo para solubilizar la forma como una centrífuga compleja, el CSM a 2, 700 G durante cinco minutos.

Mida la absorbancia del sobrenadante a 570 nanómetros utilizando 630 nanómetros como referencia. Proceda a determinar el número de celdas asociado con el CSM en relación con el valor de absorbencia obtenido a partir de números conocidos de A SC viables. Mezcle cinco miligramos de un CSM cargado con SC con 7,5 miligramos por mililitro. Colágeno tipo uno extraído de ratas.

Tendón de cola, ajuste el pH a 6.8 usando dos hidróxido de sodio normales y vierta en una placa de cultivo. Inserte para fibrilar, ahora transfiera a una placa de 12 pocillos e incube durante 30 minutos. Continúe refrescando el medio para los geles de colágeno A-S-C-C-S-M cada dos días del período de incubación.

También monitoree, libere y migre las células de CSM al gel utilizando técnicas de microscopía estándar. El siguiente ejemplo describe la estrategia in vitro para administrar células madre derivadas del tejido adiposo a partir de microesferas de quitosano en un andamio de gel de colágeno. Las imágenes SEM y TEM indican una preparación de CSM poroso de tamaño uniforme.

La incubación de las microesferas con células madre derivadas del tejido adiposo primario indica 4.000 células por miligramo de calcio CSM am. La tinción de un SC muestra la propagación sobre el CSM con la extensión de los filopodios hacia las grietas porosas de la microesfera. Cuando el CSM cargado de células se mezcló con el gel de colágeno, las células migran al gel y se pueden seguir a lo largo del tiempo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden inmediatamente hacia la terapia de la pérdida masiva y crónica de tejido. Sin embargo, este régimen de tratamiento tiene mucho más potencial debido a su versatilidad para integrarse con una variedad de células y/o biomateriales utilizados para tratar diferentes niveles de pérdidas de tejido blando y cardíaco. Sin dudas, este método puede proporcionar información sobre la entrega de la célula huésped.

También se puede aplicar a otros sistemas, como los inyectables, la administración de fármacos terapéuticos, el desarrollo de sistemas híbridos para administrar tanto células como fármacos terapéuticos juntos.