Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp.

El objetivo general de este procedimiento es tamizar plantas infestadas con nematodos formadores de nódulos radiculares. Primero, cultive plántulas sanas en suelo arenoso o en bolsas de crecimiento. A continuación, produzca un inóculo de juveniles de segundo estadio altamente infectivos de nematodos formadores de nódulos radiculares.

Luego, inocule e inflija adecuadamente las plántulas. Finalmente, evalúe el desarrollo de masas de huevos de nematodos en el sistema radicular del hospedador. Demostraremos ensayos de alta y baja capacidad de procesamiento de plantas con raíces, no con nematodos.

Y las principales ventajas del sistema de alto rendimiento son la necesidad de un espacio limitado para el crecimiento de las plantas y la facilidad para evaluar la infección. Por lo tanto, estos enfoques darán lugar a una infección reproducible y uniforme, y a la infección de las raíces de las plantas por nematodos, lo que permitirá una mejor evaluación del estado de hospedador de la planta. En general, las personas que son nuevas en la evaluación de plantas con nematodos en las raíces probablemente tendrán dificultades debido a que no utilizan la etapa de desarrollo adecuada para infectar las raíces con nematodos.

Y también utilizando juveniles de etapa infecciosa de varios días de antigüedad, que típicamente tienen baja infectividad. El procedimiento será demostrado por Hug Upatian, estudiante de posgrado. En mi laboratorio, demostraré el procedimiento para el tamizaje en bolsas de crecimiento para ensayos en macetas. Siembre semillas de tomate en una sola maceta llena de suelo rico en materia orgánica, como la mezcla Sunshine, manteniendo un invernadero a una temperatura de 22 a 28 grados Celsius tras la germinación.

Riegue una vez por semana con Miracle Grow aproximadamente dos semanas después de la germinación. En el estadio de las dos hojas verdaderas, trasplante plántulas individuales a macetas llenas con suelo arenoso estéril, compuesto por 90% de arena y 10% de materia orgánica. Añada fertilizante de liberación lenta Osmocote y mantenga en un invernadero a 22-28 grados Celsius durante dos semanas. Continúe fertilizando una vez por semana con Miracle Grow.

Para ensayos de alto rendimiento, siembre directamente las semillas de la planta en bandejas con suelo arenoso. Cubra con papel plástico hasta la germinación y mantenga como se describió anteriormente. Después de la germinación, agregue fertilizante de liberación lenta Osmocote y fertilice una vez por semana con Miracle-Gro. Germinar las semillas en una placa de Petri forrada con varias capas de papel Kimwipe, mantenida en un incubador a 25-28 grados Celsius, y luego transfiera las plántulas a bolsas individuales.

Alternativamente, coloque las semillas en la ranura de papel para germinar directamente en bolsas individuales. Coloque las bolsas en una carpeta plástica colgante, una por carpeta, y organice las carpetas en un estante, en posición vertical.

Coloque el estante en una cámara de ambiente controlado mantenida a una temperatura de 25 a 28 grados Celsius y 16 horas de luz. Durante el ciclo de 8 horas de oscuridad, riegue las bolsas una o dos veces al día con agua de ósmosis inversa. Aproximadamente entre 10 y 14 días después de la siembra, cuando se haya desarrollado un sistema radicular adecuado con puntas de raíces terciarias, las plántulas estarán listas para la inoculación. Antes de comenzar la extracción de huevos, lave cuidadosamente el área de trabajo y todas las herramientas con agua caliente para evitar contaminación.

Coloque un cubo en un fregadero para recolectar, pase la solución y coloque un soporte de malla metálica en la parte superior. Apile tres tamices de arriba hacia abajo en orden decreciente de tamaño de apertura, de modo que los huevos se recojan en el tamiz de 25 micrones. Corte las partes superiores de las plantas infectadas y deseche con cuidado.

Saque la planta de la maceta y lave las raíces sumergiéndolas en un balde de plástico lleno de agua. Enjuague las raíces más a fondo bajo agua corriente hasta que se eliminen las partículas de suelo. Luego, extraiga los huevos de nematodos formadores de nódulos de las raíces infectadas de tomate.

Primero, corte las raíces en trozos pequeños usando tijeras, desechando la raíz principal. Coloque las raíces picadas de una sola planta en un frasco plástico grande con tapa y agregue la cantidad suficiente de solución de lejía al 10% para cubrir las raíces. Cierre la tapa y agite el frasco durante dos minutos.

Abra el frasco y vierta las raíces sobre el tamiz superior y lávelas con una manguera conectada a una boquilla pulverizadora. Lávelas bien hasta que desaparezca por completo el olor a lejía. Utilice un mazo para golpear los lados de los tamices y evitar que se obstruyan.

Deténgase, retire el tamiz superior y enjuague los restos. Y el segundo tamiz. Retire el segundo tamiz y recoja los restos finos, que incluyen los huevos del último tamiz, con un chorro suave de una botella de agua.

Mueva los restos a un lado del tamiz. Recoja los restos y los huevos en un vaso de precipitados limpio con la mínima cantidad de agua posible. Pase el agua recolectada en el cubo a través del tamiz de 25 micrones para recoger cualquier huevo que pueda haberse escapado.

Lave bien con agua y recoga en el mismo vaso de precipitados. Forre un cesto metálico limpio con varias capas de papel Kim. Pase el papel y colóquelo sobre una placa de Petri de vidrio, dejando una distancia de un centímetro entre la parte inferior del cesto y la placa.

Vierta los huevos de nematodos extraídos sobre el papel, en la canasta de alambre. Añada suficiente líquido para que la parte inferior de la canasta de alambre toque la superficie del agua, pero no quede sumergida en ella.

Cubra la parte superior con una tapa de plástico todos los días. Verifique la evaporación del agua y agregue un poco de agua en la placa de Petri para que la base de la canastilla toque el agua. Con el fin de evitar que los huevos se sequen, cada dos días durante seis a ocho días, recoja el agua que contiene los juveniles de segundo estadio o J dos de la placa de Petri en un vaso de precipitados.

Si no se utiliza inmediatamente, airee el inóculo recolectado a temperatura ambiente utilizando una fuente de aire del laboratorio o aire generado por una bomba de acuario. Comience el siguiente paso agitando el inóculo en una placa agitadora magnética a baja velocidad. Utilice tres alícuotas de los nematodos recolectados.

Para contar la cantidad de J twos en contabilidad. Deslice o coloque en una placa, calcule el promedio y determine el volumen deseado para la inoculación. Estos son J twos tal como se observan bajo un microscopio.

Normalmente, se utilizan 3000 J twos por planta en macetas y 500 J twos para plantas cultivadas en bandejas de semillero. Antes de inocular las plantas, asegúrese de que el suelo esté húmedo pero no demasiado mojado. Para la inoculación en macetas, haga tres agujeros de aproximadamente la mitad de la profundidad de la maceta en la arena alrededor de cada sistema radicular de tomate.

Utilizando un lápiz, inocule cada planta introduciendo los J twos en los tres orificios mediante una pipeta. Posteriormente, cubra los orificios para las pantallas de alto rendimiento en bandejas. Utilice una aguja de punta modificada y sellada con orificios laterales pegada a una pipeta de cinco mililitros.

Deposite a lo largo de una pipeta para aplicar el J dos en el suelo. Mantenga las plantas en un invernadero a 24 a 27 grados Celsius durante seis a ocho semanas. Continúe fertilizando dos veces por mes con miracle grow.

Para la evaluación de la infección. Corte las partes superiores y retire cuidadosamente las plantas de las macetas, luego lave las raíces. A continuación, tiña las masas de huevos de azul sumergiendo las raíces en un miligramo por litro.

Realice un aerio durante 15 minutos. Enjuague las raíces en agua y evalúe contando las masas de huevos teñidas en sistemas radiculares individuales. Se puede utilizar una lupa iluminada para ayudar a visualizar las masas de huevos, contar el nematodo, el inóculo y agitar en una placa agitadora magnética como se describió anteriormente.

Retire los sobres de las carpetas colgantes y colóquelos sobre una superficie horizontal. Inocule cada sobre con 1.500 J2 en cinco mililitros. Levante la cubierta de plástico del sobre y distribuya los nematodos uniformemente sobre la superficie de las raíces.

Mantenga las bolsas en posición horizontal durante 24 horas después de la inoculación, cubiertas con papel oscuro para excluir la luz. Posteriormente, devuelva las bolsas a las carpetas colgantes en la cámara de crecimiento con agua. Las plantas necesitan ser regadas una o dos veces al día durante aproximadamente tres días con solución de Hoagland al medio vigor hasta observar una respuesta al fertilizante.

Generalmente se observa un enverdecimiento foliar mejorado y un crecimiento de brotes más vigoroso. Después de tres días, mantener las bolsas húmedas con agua. Aproximadamente 30 días después de la inoculación, infundir cada bolsa con unos 10 a 20 mililitros de 75 miligramos por litro.

Brillante aeróreo. Mantenga las bolsas inundadas con el colorante en posición horizontal durante la noche. Al día siguiente, drene las bolsas y evalúe los sistemas radiculares contando las masas de huevos bajo una mesa iluminada.

La lupa muestra aquí las raíces de una planta de tomate bien infectada, con masas de huevos extendidas teñidas de azul. El uso de bandejas permite el cribado de cientos de plantas en un espacio de crecimiento reducido. Las bolsas de crecimiento también permiten una evaluación rápida y deficiente no destructiva de las raíces, no infecciones por nematodos, sin necesidad de lavar las raíces.

Este método también permite el cribado de alto rendimiento de miles de plantas en un espacio de crecimiento reducido. Aquí, el sistema radicular de una planta de soja crecida en una bolsa muestra masas de huevos teñidas de azul tras la inoculación. El momento de la infección es muy crítico para los ensayos con plantas y nematodos.

Por lo tanto, retrasar la infección incluso unos pocos días puede dar lugar a niveles de infección muy elevados. Tras ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo infectar y evaluar plantas con nematodos formadores de nódulos radiculares. No olvide que las raíces infectadas con nematodos deben manipularse adecuadamente.

La autoclave de las raíces antes de desecharlas limitará la propagación del nematodo. Además, tenga cuidado al usar glifosato aéreo en dosis altas, ya que es carcinogénico.

Por lo tanto, es necesario usar guantes al manipular raíces infectadas con este producto químico, así como al preparar este compuesto.