Name: Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp. /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprende métodos de cribado de alto y bajo rendimiento para evaluar plantas infestadas con nematodos Meloidogyne spp. Estas técnicas permiten evaluaciones no destructivas y reproducibles en programas de mejoramiento vegetal.

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La investigación en Kaloshian laboratorio está financiado por una donación de Estados Unidos Instituto Nacional de la Agricultura y la Alimentación (2007-35607-17765). La investigación en laboratorio de Roberts es un proyecto financiado por subvenciones de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional (GDG-G-00-02-00012-00 y A-EDH-00-07-00005) y la de California en seco de la Junta Consultiva frijol.

1. Crecimiento de las plántulas de tomate en macetas y bandejas <ol><li> Para los ensayos de marihuana, semillas de plantas de tomate en una sola olla en un suelo rico en materia orgánica, como mezcla de sol. Mantener en un invernadero a 22-28 º C. Después de la germinación, fertilizar una vez a la semana con Miracle-Gro. </li><li> Unas dos semanas después de la germinación, en los dos verdadera hoja de etapa, el trasplante de forma individual las plantas de semillero en macetas (10 cm de diámetro y 17 cm de profundidad) con suelo de arena estéril que contiene un 90% de arena y 10% mezcla orgánica. Añadir Osmocote fertilizante de liberación lenta y mantener en un invernadero a 22-28 ° C durante dos semanas. Continuar para fertilizar las plantas una vez por semana con Miracle-Gro. </li><li> Para pantallas de alto rendimiento, las semillas de las plantas directamente en las bandejas en el suelo arenoso, cubrir la bandeja con papel plástico hasta la germinación y mantener que el anterior. Después de la germinación, agregar fertilizante de liberación lenta Osmocote y fertilizar una vez a la semana con Miracle-Gro. </li></ol> 2. Caupí crecimiento de las plántulas en bolsas <ol><li> SEEDS son o bien germinaron en una placa de Petri, revestida con varias capas de papel Kimwipe, y se transfieren individualmente a bolsas o coloca directamente en la ranura de papel de la bolsa y se germinaron. </li><li> Coloque las bolsas en una carpeta de plástico colgando, dos por cada carpeta, y organizar las carpetas en un bastidor en posición vertical. Coloque el bastidor en una cámara controlada entorno mantenido a una temperatura de 25-28 ° C y 16 h luz / 8 h oscuridad ciclo. Bastidores también se puede mantener en un invernadero, pero requieren una lámina o cubierta de papel rígido colocado sobre el bastidor en ambos lados de los tallos de las plantas, para reducir el potencial de contaminación por hongos. </li><li> Las bolsas de agua una o dos veces por día con agua de ósmosis inversa. Alrededor de 10 a 14 días después de la siembra, cuando un sistema radicular adecuado, con puntas de las raíces terciarias ha desarrollado (Figura 1), las plántulas están listas para la inoculación. </li></ol> 3. La extracción de huevos de nematodos Extracción de correoSGG de las raíces infectadas se modifica a partir de un protocolo desarrollado por Hussey y Barker (1973). <ol><li> Tres o cuatro días antes de la inoculación de nematodos, extraer nódulo de la raíz huevos de nematodos de las raíces de tomate infectadas. Antes de iniciar la extracción de huevos, lave el área de trabajo a fondo con agua caliente para evitar la contaminación. También lave en agua caliente una. Licuadora, dos cubos, un soporte de malla de alambre, un mazo de goma, tres tamices de 425, 90 y 25 m de apertura, una probeta graduada y unas tijeras </li><li> Apilar los tamices de arriba a abajo en el siguiente orden: 425, 90 y 25 m de apertura. Los huevos se recogerán en el tamiz 25 micras en la parte inferior. Coloque los tamices sobre una rejilla metálica apoyada en el fregadero. Coloque una cubeta debajo de la malla de alambre para recoger la solución de ejecución a través. </li><li> Cortar la parte superior de la planta infectada (s), utilizados como la fuente del inóculo, y desechar. Retire con cuidado la planta de la maceta. Lavar las raíces por inmersión en un cubo de plástico lleno de agua. Aclarar las raíces más en ejecutarseNing agua hasta que las partículas del suelo son arrastradas desde las raíces. </li><li> Cortar las raíces con tijeras en trozos pequeños. Deshágase de la raíz principal. </li><li> Coloque las raíces cortadas de una sola planta en un frasco grande de plástico con tapa, agregar suficiente solución de lejía al 10% para cubrir las raíces y cierre la tapa. </li><li> Agite bien el frasco que contiene las raíces de 2 min. </li><li> Abra el frasco y vierte las raíces en el tamiz superior y lavar con una manguera conectada a una boquilla de nebulización. Lavar bien hasta que todo el olor a lejía se ha ido. Utilice un martillo para insertar las caras de los tamices para evitar la obstrucción de los poros del tamiz. </li><li> Retire el tamiz superior y enjuagar los restos en el segundo tamiz. </li><li> Eliminar el segundo tamiz y recoger la basura fina, que incluye los huevos, desde el tamiz pasado. Con una corriente suave de una botella de agua, mover los escombros a un lado del tamiz. Recoger la basura y los huevos en un recipiente limpio con una cantidad mínima de agua. </li><li> Tamizar una vez más el agua recogida en elcubeta a través del tamiz 25 micras para recoger los huevos que pueden haber escapado. Enjuague bien con agua y se acumulan en el mismo vaso. </li><li> Desechar los restos de la planta desde el tamiz superior y lavar a fondo los tres tamices con agua a presión. No toque la parte de malla de los tamices, ya que puede distorsionar el tamaño de los poros. </li></ol> 4. Los huevos para incubar de nematodos <ol><li> Línea de una canasta de metal limpio, con unas pocas capas de papel Kimwipe y cabe en un plato de Petri de vidrio. Permitir una distancia de 1 cm entre la parte inferior de la cesta y el plato. </li><li> Verter los huevos de nematodos extraídos en el papel en el cesto de alambre. Añadir suficiente líquido de modo que la parte inferior de la cesta de alambre toca la superficie del agua, pero no está sumergido en agua. Cubra la parte superior con una tapa de plástico. </li><li> Cada día visita para la evaporación de agua y añadir algo de agua en la placa de Petri de modo que el fondo de la cesta toca el agua. Esto evitará que los huevos de la desecación. </li><li> Cada dos días, recogerá el water que contiene los J2S de las placas de Petri en un vaso de precipitados. Si no se utiliza inmediatamente, airear el inóculo recogido a temperatura ambiente usando un suministro de aire o de laboratorio de aire generada por una bomba de acuario. Utilizar el inóculo celular dentro de 2 días. J2S se puede recoger de la eclosión establecido durante un período de 6-8 días. </li></ol> 5. Infección de las raíces de tomate en macetas o bandejas y evaluación de la infección <ol><li> Utilizar tres alícuotas de los nematodos recogidos para contar el número de J2S en una diapositiva o plato contando, calcular el promedio y determinar el volumen deseado para la inoculación. Normalmente se utilizan J2S 3000 por planta en macetas y 500 J2S para las plantas cultivadas en bandejas de plántulas. </li><li> Agitar el inóculo en una placa de agitación magnética a baja velocidad. </li><li> Antes de inocular las plantas, asegúrese de que el suelo está húmedo pero no mojado también. Para la inoculación olla, hacer tres agujeros alrededor de la mitad de la olla de profundidad en la arena alrededor de cada sistema de raíces de tomate con un lápiz (Figura 2 </strong&gt;). Inocular cada planta mediante la entrega de los J2S en los tres agujeros usando una pipeta. Después, cubrir los agujeros. </li><li> Para las pantallas de alto rendimiento en las bandejas, utilice una aguja modificada punta sellada con agujeros en los lados pegados a una punta de pipeta de 5 ml a lo largo de un pipeteador (Figura 3) para entregar los J2S en el suelo. Alternativamente, los nematodos se puede enviar como en el paso 5,3. </li><li> Mantener las plantas en un invernadero a 24-27 ° C durante seis a ocho semanas. Continuar para fertilizar dos veces al mes con Miracle-Gro. </li><li> Para la evaluación de la infección, retirar con cuidado las plantas de las macetas y lavar las raíces (como se describe en el paso 3,3). </li><li> Mancha de las masas de huevos azules, sumergiendo las raíces en 1 mg / L erioglaucine, durante 15 minutos. </li><li> Lavar las raíces en agua y evaluar contando las masas de huevos manchados en el sistema de raíz individual. Una lupa de mesa de iluminación se puede utilizar para ayudar a visualizar las masas de huevos. </li><li> Si las plantas apantallados son necesarios para g másLos estudios enetic, no corte la parte superior antes de lavar las raíces para su evaluación. Después de la tinción y recuento de las masas de huevos, trasplantar las plántulas en suelo orgánico, podar las copas en gran medida a reducir la transpiración, y mantener en un invernadero. </li></ol> 6. Caupí infección de las raíces en bolsas y evaluación de la infección <ol><li> Contar el inóculo de nematodos y se agita en una placa de agitación magnética como se describió anteriormente. </li><li> Eliminar las bolsas de las carpetas colgantes y colocar en una superficie horizontal. Inocular cada bolsa con 1500 J2S en 5 ml. Levante la cubierta de plástico de la bolsa y distribuir los nematodos uniformemente sobre la superficie de las raíces. </li><li> Mantenga las bolsas en posición horizontal durante 24 horas después de la inoculación, cubierto con papel oscuro para evitar la luz, a continuación, volver a las carpetas que cuelgan en la cámara de crecimiento. </li><li> Riegue las plantas cuando sea necesario, una o dos veces al día, con Hoagland medio-concentración de la solución (Hoagland y Arnon, 1950, Tabla 1 </&gt; fuerte) hasta una respuesta al fertilizante se observa, reverdecimiento follaje típicamente mejorada y crecimiento de los brotes más vigorosa. Por lo general, las plantas se riegan con Hoagland de fuerza media de 3 días seguidos. Después, mantenga las bolsas húmedo con agua. </li><li> Aproximadamente 30 días (rango 28-35 días) después de la inoculación, infusión de cada bolsa con alrededor de 10-20 ml de 75 mg / L erioglaucine. Mantener las bolsas inundadas con el colorante en una posición horizontal durante la noche. </li><li> Vacíe las bolsas y evaluar los sistemas de raíces, contando las masas de huevos en una lupa mesa iluminada. </li><li> Si las plantas examinadas son necesarios para posteriores estudios genéticos o el trabajo de reproducción, tire con cuidado las raíces del papel, el trasplante en suelo orgánico en macetas y mantener en un invernadero. </li></ol> 7. Los resultados representativos Las etapas apropiadas de las plantas de tomate y caupi para inoculaciones de nematodos de los dos sistemas descritos se muestra en las figuras1 y 2. Además, los ejemplos de bien infectadas raíces de tomate y caupi se muestran en las figuras 4 y 5. Como en la mayoría de las pantallas de resistencia a enfermedades, es aconsejable utilizar al menos 6-10 plantas por genotipo para la inoculación de nematodos para calcular el promedio de la tasa de infección. La variación en la infección por nematodos entre las plantas, del mismo genotipo, se puede reducir mediante el uso de tamaño de la planta uniforme y la cantidad exacta y la entrega de inóculo. El uso de bandejas y bolsas de crecimiento permite el cribado de los cientos de miles de plantas en un espacio pequeño crecimiento. Bolsas de crecimiento también permiten rápida y eficiente evaluación no destructiva de infecciones por nematodos agalladores sin necesidad de raíces de lavado (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Figura 1. Un dos semanas de edad planta caupi crecido en una bolsa y listo para agallador NEMATode la inoculación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Figura 2. A tres semanas de edad, planta de tomate preparada para la inoculación nematodo agallador. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Figura 3. Una aguja modificado y punta de la pipeta utilizada para la inoculación de alto rendimiento de los nematodos. La parte inferior de una aguja se selló y tres conjuntos de agujeros se perforaron en la aguja utilizando un rayo láser. Entonces, la aguja modificado fue pegado a una punta de pipeta de 5 ml. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Figura 4. Un sistema de raíces de tomate infectadas con el nematodo agallador. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Figura 5. Un sistema de raíces de caupí, con masas de huevos teñidos con erioglaucine 30 días después de la inoculación crecido a28 ° C.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Hay dos pasos fundamentales para una pantalla de nematodos éxito: preparación de un inóculo muy infecciosos y el uso de plantas en la etapa de desarrollo adecuado. Tasa de eclosión de huevos de nematodos nudo de la raíz es muy variable y oscila entre 5 a 50%. Por lo tanto para obtener niveles óptimos de escotilla y J2S altamente infecciosos, se debe prestar mucha atención a la extracción de huevos para incubar y de los procedimientos. Los huevos deben ser expuestos a cloro por un período mínimo de tiempo y cloro debe enjuagarse bien de la mezcla de las raíces. Cuando la eclosión de los huevos, la suspensión que contiene los huevos no deben ser sumergidas en agua. Además, evitar el derrame de los huevos en la caja de Petri subyacente, donde los juveniles nacidas son capturadas. Una forma de evitar el derrame de los huevos durante el proceso de incubación no es añadir agua directamente a la Kimwipe que el papel puede romperse. En su lugar se añade el agua directamente a la placa de Petri. Para obtener los mejores resultados, utilice J2S recién nacidos. Si el HATCtasa h es baja y más inóculo se necesita, J2S puede ser almacenado a 15 ° C durante un período más largo. Caliente el inóculo almacenado a temperatura ambiente para revivir los nematodos antes de la inoculación. Sin embargo, no guarde los J2S durante períodos prolongados, incluso a 15 ° C como J2S muertos de hambre no se infectan de manera eficiente. Las plántulas son la mejor etapa de desarrollo para la inoculación nematodo agallador. Sin embargo, esto tiene que ser equilibrada con la formación de un sistema radicular adecuado que proporcione un número suficiente de puntas de las raíces como puntos de entrada para los J2S. El mantenimiento de un estado óptimo crecimiento de las plantas también es fundamental para las pantallas. Evitar el exceso de riego las plantas especialmente los que crecen en las bolsas. El exceso de riego de las bolsas, como se indica por el agua estancada en la parte inferior de la bolsa, puede promover el crecimiento de hongos y disminuir salud de las raíces. Con los dos ensayos de evaluación adicional de la infección por nematodos y el cálculo del número de huevos por sistema radicular y los huevos / gramo de frecuenciaraíz sh se puede realizar. Para los ensayos de tomate, las raíces individuales se pesan y se extrajeron los huevos como se describe para la preparación de inóculo (sección 3). Al procesar gran número de muestras de plantas, los sistemas individuales de raíz podría ser macerado utilizando un mezclador para la extracción de huevo. El número de huevos deben ser contados por lo menos en tres partes alícuotas y se calculan los huevos / gramo de sistema de raíces fresca. Para los ensayos de bolsa, el sistema de raíces es arrancado de la inserción de papel, se pesaron, y se extrajo huevos.

alto y bajo rendimiento pantallas con nematodos- meloidogyne spp.</em

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Los nematodos parásitos (del género Meloidogyne) son parásitos obligados de plantas. Son extremadamente polífaga y considerado uno de los nematodos parásitos de mayor importancia económica. El microscopio de la segunda etapa juvenil (J2), muda una vez en el huevo, es la etapa infecciosa. Los J2S salen de los huevos, se mueven libremente en el suelo dentro de una película de agua, y localizar puntas de las raíces de las especies vegetales adecuadas. Después de penetrar en la raíz de la planta, que migran hacia el cilindro vascular en el que establecer un sitio de alimentación e iniciar la alimentación con sus estiletes. El sitio de alimentación pluricelular está compuesto de varias células alargadas multinucleadas llamadas &#39;células gigantes&#39; que se forman a partir de células que se sometieron a cariocinesis (se repite la mitosis) sin citocinesis. Las células vecinas periciclo dividir y ampliar de tamaño dando lugar a una agalla típica o nudo de la raíz, el síntoma característico de la infección por el nematodo agallador. Una vez que se inicia la alimentación, J2S una vida sedentaria y la ONUdergo tres mudas adicionales para convertirse en adultos. La hembra adulta pone 150-250 huevos en una matriz gelatinosa sobre o debajo de la superficie de la raíz. De los huevos eclosionan J2S nuevos infecciosos y comenzar un nuevo ciclo. El ciclo del nematodo del nudo de la vida se completa en 4-6 semanas a 26-28 ° C. Aquí les presentamos el protocolo tradicional para infectar a las plantas, cultivadas en macetas con nematodos, y dos métodos de alto rendimiento ensayos. La primera de alto rendimiento método se utiliza para las plantas con semillas pequeñas como el tomate, mientras que el segundo es para las plantas con semillas grandes, como frijol caupí y común. Las semillas grandes apoyan el crecimiento de plántulas extendida con suplemento de nutrientes mínimos. El primer ensayo de alto rendimiento utiliza plántulas crecidas en arena en bandejas, mientras que en las plantas de ensayo segundo se cultivan en bolsas en la ausencia de suelo. El crecimiento de las plántulas bolsa está hecha de una mecha 15,5 x 12,5 cm de papel, doblada en la parte superior para formar un canal 2-cm de profundidad en la cual se coloca la semilla o las plántulas. Lamecha de papel se encuentra dentro de una bolsa de plástico transparente. Estas bolsas de crecimiento permiten la observación directa de síntomas de la infección por nematodos, escoriaciones de las raíces y la producción de masa de huevo, bajo la superficie de una bolsa transparente. Ambos métodos permiten el uso de las plantas examinadas, después de fenotipado, para el cruce o la producción de semillas. Una ventaja adicional del uso de bolsas de crecimiento es la necesidad de espacio pequeño, porque las bolsas de plástico se almacenan en carpetas colgantes dispuestos en bastidores.

Dos métodos distintos a las plantas de pantalla con nematodos, se describen. Los enfoques descritos son de alto rendimiento de las pantallas con los nematodos en una manera no destructiva para facilitar el uso de estas plantas en los programas de mejoramiento.

Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp.</em

Los nematodos gallinducinges (género Meloidogyne) son parásitos obligados de las plantas. Son extremadamente polífagos y se consideran uno de los más importantes desde el punto de vista económico...

El objetivo general de este procedimiento es tamizar plantas infestadas con nematodos formadores de nódulos radiculares. Primero, cultive plántulas sanas en suelo arenoso o en bolsas de crecimiento. A continuación, produzca un inóculo de juveniles de segundo estadio altamente infectivos de nematodos formadores de nódulos radiculares.Luego, inocule e inflija adecuadamente las plántulas. Finalmente, evalúe el desarrollo de masas de huevos de nematodos en el sistema radicular del hospedador. Demostraremos ensayos de alta y baja capacidad de procesamiento de plantas con raíces, no con nematodos.Y las principales ventajas del sistema de alto rendimiento son la necesidad de un espacio limitado para el crecimiento de las plantas y la facilidad para evaluar la infección. Por lo tanto, estos enfoques darán lugar a una infección reproducible y uniforme, y a la infección de las raíces de las plantas por nematodos, lo que permitirá una mejor evaluación del estado de hospedador de la planta. En general, las personas que son nuevas en la evaluación de plantas con nematodos en las raíces probablemente tendrán dificultades debido a que no utilizan la etapa de desarrollo adecuada para infectar las raíces con nematodos.Y también utilizando juveniles de etapa infecciosa de varios días de antigüedad, que típicamente tienen baja infectividad. El procedimiento será demostrado por Hug Upatian, estudiante de posgrado. En mi laboratorio, demostraré el procedimiento para el tamizaje en bolsas de crecimiento para ensayos en macetas. Siembre semillas de tomate en una sola maceta llena de suelo rico en materia orgánica, como la mezcla Sunshine, manteniendo un invernadero a una temperatura de 22 a 28 grados Celsius tras la germinación.Riegue una vez por semana con Miracle Grow aproximadamente dos semanas después de la germinación. En el estadio de las dos hojas verdaderas, trasplante plántulas individuales a macetas llenas con suelo arenoso estéril, compuesto por 90% de arena y 10% de materia orgánica. Añada fertilizante de liberación lenta Osmocote y mantenga en un invernadero a 22-28 grados Celsius durante dos semanas. Continúe fertilizando una vez por semana con Miracle Grow.Para ensayos de alto rendimiento, siembre directamente las semillas de la planta en bandejas con suelo arenoso. Cubra con papel plástico hasta la germinación y mantenga como se describió anteriormente. Después de la germinación, agregue fertilizante de liberación lenta Osmocote y fertilice una vez por semana con Miracle-Gro. Germinar las semillas en una placa de Petri forrada con varias capas de papel Kimwipe, mantenida en un incubador a 25-28 grados Celsius, y luego transfiera las plántulas a bolsas individuales.Alternativamente, coloque las semillas en la ranura de papel para germinar directamente en bolsas individuales. Coloque las bolsas en una carpeta plástica colgante, una por carpeta, y organice las carpetas en un estante, en posición vertical.Coloque el estante en una cámara de ambiente controlado mantenida a una temperatura de 25 a 28 grados Celsius y 16 horas de luz. Durante el ciclo de 8 horas de oscuridad, riegue las bolsas una o dos veces al día con agua de ósmosis inversa. Aproximadamente entre 10 y 14 días después de la siembra, cuando se haya desarrollado un sistema radicular adecuado con puntas de raíces terciarias, las plántulas estarán listas para la inoculación. Antes de comenzar la extracción de huevos, lave cuidadosamente el área de trabajo y todas las herramientas con agua caliente para evitar contaminación.Coloque un cubo en un fregadero para recolectar, pase la solución y coloque un soporte de malla metálica en la parte superior. Apile tres tamices de arriba hacia abajo en orden decreciente de tamaño de apertura, de modo que los huevos se recojan en el tamiz de 25 micrones. Corte las partes superiores de las plantas infectadas y deseche con cuidado.Saque la planta de la maceta y lave las raíces sumergiéndolas en un balde de plástico lleno de agua. Enjuague las raíces más a fondo bajo agua corriente hasta que se eliminen las partículas de suelo. Luego, extraiga los huevos de nematodos formadores de nódulos de las raíces infectadas de tomate.Primero, corte las raíces en trozos pequeños usando tijeras, desechando la raíz principal. Coloque las raíces picadas de una sola planta en un frasco plástico grande con tapa y agregue la cantidad suficiente de solución de lejía al 10% para cubrir las raíces. Cierre la tapa y agite el frasco durante dos minutos.Abra el frasco y vierta las raíces sobre el tamiz superior y lávelas con una manguera conectada a una boquilla pulverizadora. Lávelas bien hasta que desaparezca por completo el olor a lejía. Utilice un mazo para golpear los lados de los tamices y evitar que se obstruyan.Deténgase, retire el tamiz superior y enjuague los restos. Y el segundo tamiz. Retire el segundo tamiz y recoja los restos finos, que incluyen los huevos del último tamiz, con un chorro suave de una botella de agua.Mueva los restos a un lado del tamiz. Recoja los restos y los huevos en un vaso de precipitados limpio con la mínima cantidad de agua posible. Pase el agua recolectada en el cubo a través del tamiz de 25 micrones para recoger cualquier huevo que pueda haberse escapado.Lave bien con agua y recoga en el mismo vaso de precipitados. Forre un cesto metálico limpio con varias capas de papel Kim. Pase el papel y colóquelo sobre una placa de Petri de vidrio, dejando una distancia de un centímetro entre la parte inferior del cesto y la placa.Vierta los huevos de nematodos extraídos sobre el papel, en la canasta de alambre. Añada suficiente líquido para que la parte inferior de la canasta de alambre toque la superficie del agua, pero no quede sumergida en ella.Cubra la parte superior con una tapa de plástico todos los días. Verifique la evaporación del agua y agregue un poco de agua en la placa de Petri para que la base de la canastilla toque el agua. Con el fin de evitar que los huevos se sequen, cada dos días durante seis a ocho días, recoja el agua que contiene los juveniles de segundo estadio o J dos de la placa de Petri en un vaso de precipitados.Si no se utiliza inmediatamente, airee el inóculo recolectado a temperatura ambiente utilizando una fuente de aire del laboratorio o aire generado por una bomba de acuario. Comience el siguiente paso agitando el inóculo en una placa agitadora magnética a baja velocidad. Utilice tres alícuotas de los nematodos recolectados.Para contar la cantidad de J twos en contabilidad. Deslice o coloque en una placa, calcule el promedio y determine el volumen deseado para la inoculación. Estos son J twos tal como se observan bajo un microscopio.Normalmente, se utilizan 3000 J twos por planta en macetas y 500 J twos para plantas cultivadas en bandejas de semillero. Antes de inocular las plantas, asegúrese de que el suelo esté húmedo pero no demasiado mojado. Para la inoculación en macetas, haga tres agujeros de aproximadamente la mitad de la profundidad de la maceta en la arena alrededor de cada sistema radicular de tomate.Utilizando un lápiz, inocule cada planta introduciendo los J twos en los tres orificios mediante una pipeta. Posteriormente, cubra los orificios para las pantallas de alto rendimiento en bandejas. Utilice una aguja de punta modificada y sellada con orificios laterales pegada a una pipeta de cinco mililitros.Deposite a lo largo de una pipeta para aplicar el J dos en el suelo. Mantenga las plantas en un invernadero a 24 a 27 grados Celsius durante seis a ocho semanas. Continúe fertilizando dos veces por mes con miracle grow.Para la evaluación de la infección. Corte las partes superiores y retire cuidadosamente las plantas de las macetas, luego lave las raíces. A continuación, tiña las masas de huevos de azul sumergiendo las raíces en un miligramo por litro.Realice un aerio durante 15 minutos. Enjuague las raíces en agua y evalúe contando las masas de huevos teñidas en sistemas radiculares individuales. Se puede utilizar una lupa iluminada para ayudar a visualizar las masas de huevos, contar el nematodo, el inóculo y agitar en una placa agitadora magnética como se describió anteriormente.Retire los sobres de las carpetas colgantes y colóquelos sobre una superficie horizontal. Inocule cada sobre con 1.500 J2 en cinco mililitros. Levante la cubierta de plástico del sobre y distribuya los nematodos uniformemente sobre la superficie de las raíces.Mantenga las bolsas en posición horizontal durante 24 horas después de la inoculación, cubiertas con papel oscuro para excluir la luz. Posteriormente, devuelva las bolsas a las carpetas colgantes en la cámara de crecimiento con agua. Las plantas necesitan ser regadas una o dos veces al día durante aproximadamente tres días con solución de Hoagland al medio vigor hasta observar una respuesta al fertilizante.Generalmente se observa un enverdecimiento foliar mejorado y un crecimiento de brotes más vigoroso. Después de tres días, mantener las bolsas húmedas con agua. Aproximadamente 30 días después de la inoculación, infundir cada bolsa con unos 10 a 20 mililitros de 75 miligramos por litro.Brillante aeróreo. Mantenga las bolsas inundadas con el colorante en posición horizontal durante la noche. Al día siguiente, drene las bolsas y evalúe los sistemas radiculares contando las masas de huevos bajo una mesa iluminada.La lupa muestra aquí las raíces de una planta de tomate bien infectada, con masas de huevos extendidas teñidas de azul. El uso de bandejas permite el cribado de cientos de plantas en un espacio de crecimiento reducido. Las bolsas de crecimiento también permiten una evaluación rápida y deficiente no destructiva de las raíces, no infecciones por nematodos, sin necesidad de lavar las raíces.Este método también permite el cribado de alto rendimiento de miles de plantas en un espacio de crecimiento reducido. Aquí, el sistema radicular de una planta de soja crecida en una bolsa muestra masas de huevos teñidas de azul tras la inoculación. El momento de la infección es muy crítico para los ensayos con plantas y nematodos.Por lo tanto, retrasar la infección incluso unos pocos días puede dar lugar a niveles de infección muy elevados. Tras ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo infectar y evaluar plantas con nematodos formadores de nódulos radiculares. No olvide que las raíces infectadas con nematodos deben manipularse adecuadamente.La autoclave de las raíces antes de desecharlas limitará la propagación del nematodo. Además, tenga cuidado al usar glifosato aéreo en dosis altas, ya que es carcinogénico.Por lo tanto, es necesario usar guantes al manipular raíces infectadas con este producto químico, así como al preparar este compuesto.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

En este video, demostramos un ensayo de cribado para identificar la eficacia de nematicidas de moléculas pequeñas contra nematodos. Los nematicidas se consideran eficaces si causan una disminución en el número de nematodos móviles en la muestra después de la exposición.

Ensayo de cribado de nematicidas de moléculas pequeñas: un método de rendimiento medio para cribar posibles nematicidas contra Ditylenchus dipsaci

Nematodos entomopatógenos son gusanos redondos habitan en el suelo que parasitan una amplia gama de insectos. Demostramos métodos de muestreo utilizados para el aislamiento de estos nematodos del suelo mediante dos técnicas: la de cebado de insectos y la trampa de Blanco modificada, para la recuperación de nematodos de muestras de suelo y cadáveres de insecto infectadas, respectivamente.

Muestreo de suelos y aislamiento de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Aquí, se presenta un protocolo para el cribado rápido no destructivo de genotipos de algodón para la resistencia a los nematodos reniformes. El protocolo consiste en examinar visualmente las raíces de las plántulas de algodón infectadas por nematodos para determinar la respuesta a la infección. El brote vegetativo de cada planta se propaga para recuperar las plantas para la producción de semillas.

Selección de genotipos de algodón para la resistencia de los nematodos reniformes

Este protocolo describe un método para extraer eficientemente nematodos vivos de sustratos naturales en el campo.

Aislamiento rápido de nematodos silvestres por Baermann Funnel

El presente protocolo describe un método confiable y directo para cultivar, recolectar y detectar Ditylenchus dipsaci.

Cultivo y cribado del nematodo parásito de la planta Ditylenchus dipsaci

Aquí, presentamos un método detallado de remojo de interferencia de ARN en Bursaphelenchus xylophilus para facilitar el estudio de las funciones de los genes.

Aplicación de la interferencia de ARN en el nematodo de la madera de pino, Bursaphelenchus xylophilus

El protocolo describe la infección de las raíces de Solanum tuberosum con nematodos parásitos de plantas en condiciones de invernadero in vivo y las raíces transgénicas de papa in vitro para el análisis histoquímico de la estructura de la raíz mediante microscopía óptica.

Infección in vivo e in vitro de raíces de papa con nematodos parásitos de plantas para la evaluación de cambios estructurales inducidos

Presentamos dos métodos para que los agricultores propaguen en masa nematodos entomopatógenos como bioinsecticidas. El primer método utiliza gel de poliacrilamida como sustrato de cultivo del nematodo, mientras que el segundo emplea algodón recubierto de polímero como sustrato de cultivo. Ambos métodos dependen de la propagación in vivo de nematodos dentro de cadáveres de insectos.

Propagación in vivo basada en cultivadores de nematodos entomopatógenos

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Aprende métodos de cribado de alto y bajo rendimiento para evaluar plantas infestadas con nematodos Meloidogyne spp. Estas técnicas permiten evaluaciones no destructivas y reproducibles en programas de mejoramiento vegetal.

Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp.

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