La evaluación de alteraciones hepáticas metabólicas durante la colonización progresiva de la libre de gérmenes de ratón por ¹ H espectroscopía de RMN

El objetivo de este procedimiento es evaluar el impacto de una colonización progresiva sobre el metabolismo hepático del huésped. Esto se logra primero colonizando progresivamente ratones libres de gérmenes. El proceso de colonización se monitorea mediante la evaluación de la excreción urinaria de co-metabolitos microbianos mediante espectroscopía de RMN.

Después de monitorear el proceso de colonización, se obtiene una biopsia hepática del ratón y se prepara para el perfilado metabólico. El perfil metabólico hepático puede entonces adquirirse a partir de la biopsia intacta mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de alta resolución con ángulo mágico giratorio no destructiva. En última instancia, este uso de la espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protones revela diversos metabolitos implicados en vías metabólicas como las vías de energía y de estrés oxidativo.

Por lo tanto, este experimento puede proporcionar información sobre las funciones hepáticas durante la colonización. También puede aplicarse a través del sistema, como en el riñón. Para colonizar los animales, retire los ratones libres de gérmenes de los aisladores y colóquelos en una sala de cría convencional, en jaulas equipadas con un filtro frente a los animales convencionales, que sirven como controles.

Luego, mezcle la mitad de una camada de tres días de antigüedad tomada de la jaula convencional de control con la cama de los animales libres de gérmenes. Recolecte la orina en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros manipulando el ratón sobre el tubo y ayudando mediante un suave masaje del intestino. Se requiere un mínimo de 20 microlitros para la adquisición con una sonda de RMN de cinco milímetros, pero se recomienda usar 30 microlitros para mejorar la calidad del perfilado metabólico. Congele rápidamente la orina en nitrógeno líquido y almacénela a al menos menos 40 grados Celsius hasta el análisis por RMN.

Antes de la adquisición de RMN, prepare una solución de tampón de fosfato de sodio 0,2 molar en agua pesada. Ajuste el pH a 7,4 con TSP 1 milimolar, mezcle 30 microlitros de orina con 30 microlitros de tampón de fosfato de sodio. Transfiera 50 microlitros de la solución mezclada a un tubo capilar de RMN de 1,7 milímetros utilizando una jeringa de vidrio de 50 microlitros equipada con una aguja metálica.

Tenga cuidado para evitar burbujas. Coloque el adaptador capilar en la parte superior del capilar que contiene la muestra de orina y colóquelo en un tubo micro para RMN de 2,5 milímetros para una sonda de RMN de cinco milímetros. Esta combinación de tubos puede utilizarse como un tubo estándar de RMN de cinco milímetros para la adquisición del espectro.

En esta demostración, se utiliza un espectrómetro NMR Bruer avanzado de 700 megahercios para recopilar los datos. Adquiera espectros unidimensionales de protones NMR utilizando los parámetros descritos en el protocolo escrito. Tras la adquisición NMR, use la varilla de extracción para retirar la capilar del tubo NMR de 2,5 milímetros enroscando suavemente el adaptador de capilar para extraerlo tras la eutanasia de los animales, tal como se indica en el protocolo escrito.

Prepárese para la biopsia hepática. No utilice ningún producto que contenga alcohol para evitar contaminación y lave las herramientas con agua o solución salina. Recolecte las biopsias hepáticas del lóbulo izquierdo para obtener biopsias reproducibles.

Recoger de forma consistente en el centro del lóbulo izquierdo, evitando las áreas periféricas donde el tejido es más delgado. Tener cuidado de no perforar la vesícula biliar en caso de fuga de bilis. Lavar inmediatamente el tejido con agua o solución salina.

Congele rápidamente las biopsias en nitrógeno líquido de inmediato y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta el análisis por RMN. Para preparar la H-R-M-A-S-R-M-N, inserte la tercera biopsia en un rotor de circonio y llene el resto del volumen con agua pesada pura para el bloqueo de RMN. Tenga cuidado de no generar burbujas, ya que podrían alterar la calidad del shimado posterior y la adquisición de datos. Inserte un espaciador de politetrafluoroetileno (PTFE) de 50 microlitros utilizando el tornillo cilíndrico.

Desenrósquelo y calíbrelo utilizando el medidor de profundidad del lado corto. Coloque el pasador de rosca sobre el espaciador y enrósquelo suavemente con el destornillador. Seque la vivienda, así como cualquier agua residual, con un trozo de papel de tejido.

A continuación, coloque la tapa en la parte superior del rotor e insértela en el compactador del rotor. Presione firmemente hasta que la tapa quede colocada. No debe quedar ningún espacio entre el rotor y su tapa. Marque la mitad de la parte inferior del rotor utilizando un rotulador negro para permitir la detección óptica de la velocidad de giro.

Una vez que el rotor se haya compactado suficientemente, colóquelo dentro del espectrómetro de RMN e inicie la rotación a cinco kilohercios. Aquí se utiliza un espectrómetro Bruker Avance III de 500 megahercios. Adquiera el espectro de RMN de protones utilizando una secuencia de pulsos CP MG.

Según las instrucciones del fabricante, el doblete abundante de glucosa alfa y numérico a 5,22 partes por millón podría utilizarse para calibrar los espectros de RMN resultantes. Para desarmar el rotor, proceda retirando la tapa con el desatornillador de tapas, desenrosque el pasador de rosca y retire el espaciador de teflón. Utilizando el tornillo cilíndrico, el aparato puede lavarse completamente con agua y detergente.

La aparición de co-metabolitos microbianos intestinales durante el proceso de colonización se ilustra claramente en este espectro de protones de un perfil metabólico urinario de un animal colonizado durante 20 días. Este animal no excretó sulfato de indólico y cantidades muy pequeñas de fenilacetilglicina, abreviada como PAG, ni sulfato de quinolina en estado libre de gérmenes. A medida que avanza la colonización, estos tres marcadores del metabolismo de proteínas por la microbiota intestinal aumentan considerablemente y alcanzan un equilibrio al día 20.

Al integrar el pico específico del triplete PAG, fue posible cuantificar el aumento de este marcador particular a lo largo del tiempo. Este diagrama representa la concentración media de PAG durante la colonización en un grupo de siete animales utilizando espectroscopía de protones H-R-M-A-S-N-M-R; se obtuvo el perfil metabólico hepático de dos ratones antes y después de la colonización. Esta figura ilustra claramente la información que puede obtenerse a partir del perfil metabólico basado en A-M-A-S-N-M-R.

Se pueden visualizar numerosos aminoácidos así como metabolitos derivados del metabolismo energético. Estos perfiles también contienen información relevante sobre el estrés oxidativo, el metabolismo de nucleótidos y el metabolismo de metilaminas. En este ejemplo, es muy evidente que el ratón libre de gérmenes muestra casi ningún glucógeno y cantidades muy bajas de glucosa y triglicéridos.

Por lo tanto, tras seguir este procedimiento, se pueden aplicar múltiples herramientas estadísticas, como chemo, para agrupar muestras lógicas según su perfil metabólico y resaltar biomarcadores asociados con el estado metabólico.