La evaluación de alteraciones hepáticas metabólicas durante la colonización progresiva de la libre de gérmenes de ratón por ¹ H espectroscopía de RMN

El objetivo de este procedimiento es evaluar el impacto de una colonización progresiva sobre el metabolismo hepático del huésped. Esto se logra colonizando primero progresivamente ratones libres de gérmenes. El proceso de colonización se monitoriza mediante la evaluación de la excreción urinaria de cometabolitos microbianos mediante espectroscopia de RMN.

Tras el seguimiento del proceso de colonización, se recoge una biopsia hepática del ratón y se prepara para la elaboración de perfiles metabólicos. El perfil metabólico hepático se puede adquirir a partir de la biopsia intacta utilizando espectroscopia de RMN de ángulo mágico de ángulo giratorio no destructiva de alta resolución. En última instancia, este uso de la espectroscopia de RMN de protones revela varios metabolitos implicados en las vías metabólicas, como las vías de energía y estrés oxidativo.

Por lo tanto, este experimento puede proporcionar información sobre las funciones hepáticas durante la colonización. También se puede aplicar a través del sistema como el riñón. Para colonizar a los animales, retire los ratones libres de gérmenes de los aisladores y colóquelos en una sala de cría convencional en jaulas, equipadas con un filtro frente a los animales convencionales que sirven como controles.

A continuación, mezcle la mitad de una camada de tres días de edad extraída de la jaula convencional de control con la camada de los animales libres de gérmenes, recoja la orina en un microtubo de 1,5 mililitros manipulando el ratón sobre el tubo y con la ayuda de un suave masaje intestinal. Se requiere un mínimo de 20 microlitros para la adquisición con una sonda de RMN de cinco milímetros, pero se recomienda utilizar 30 microlitros para mejorar la calidad del perfil metabólico. Congele la orina inmediatamente en nitrógeno líquido, almacene al menos menos 40 grados centígrados hasta el análisis de RMN.

Antes de la adquisición de la RMN, prepare una solución tampón de fosfato de sodio 0,2 molar en agua pesada. pH 7,4 que contenga un milimolar TSP mezcle 30 microlitros de la ésima orina con 30 microlitros de tampón de fosfato de sodio. Transfiera 50 microlitros de la solución mezclada a un tubo capilar de RMN de 1,7 milímetros utilizando una jeringa de vidrio de 50 microlitros equipada con una aguja metálica.

Tenga cuidado de evitar las burbujas. Coloque el adaptador capilar en la parte superior del capilar que contiene la muestra de orina y colóquelo en un microtubo de RMN de 2,5 milímetros para una sonda de RMN de cinco milímetros. Esta combinación de tubos se puede utilizar como un tubo de RMN estándar de cinco milímetros para la adquisición espectral.

En esta demostración, se utiliza un espectrómetro de RMN de 700 megahercios avanzado de Bruer para recopilar los datos. Adquiera espectros de RMN de protones unidimensionales utilizando los parámetros discutidos en el protocolo escrito. Después de la adquisición de la RMN, use la varilla de extracción para extraer el capilar del tubo de RMN de 2,5 milímetros enroscando suavemente el adaptador capilar para sacarlo después de la eutanasia de animales como se describe en el protocolo escrito.

Prepárese para la biopsia de hígado. No utilice ningún producto que contenga alcohol para evitar la contaminación y lave las herramientas con agua o solución salina. Recoja biopsias hepáticas del lóbulo izquierdo para obtener biopsias reproducibles.

Recoja consistentemente en el centro del lóbulo izquierdo, evitando las áreas periféricas donde el tejido es más delgado. Tenga cuidado de no perforar la vesícula biliar en caso de fuga de bilis. Lave el pañuelo inmediatamente con agua o solución salina.

Congele las biopsias en nitrógeno líquido inmediatamente y guárdelas a menos 80 grados Celsius hasta el análisis de RMN Para configurar el H-R-M-A-S-N-M-R, inserte la tercera biopsia en un rotor de circonio y llene el resto del volumen con agua pesada pura para el bloqueo de RMN. Tenga cuidado de no formar burbujas, ya que podrían alterar la calidad de las cuñas posteriores y la adquisición de datos. Inserte un espaciador de teflón de 50 microlitros con el tornillo cilíndrico.

Desenróscalo y ublíralo con el medidor de profundidad en el lado corto. Coloque el pasador de rosca en el espaciador y atorníllelo suavemente con el destornillador. Secar el agua, cualquier agua residual con un trozo de pañuelo.

A continuación, coloque la tapa en la parte superior del rotor e insértela en el empaquetador del rotor. Presione firmemente hasta que la tapa esté en su lugar. No debe quedar ningún espacio entre el rotor y su tapa, marque la mitad de la parte inferior del rotor con un rotulador negro para permitir la detección óptica de la velocidad de giro.

Una vez que el rotor se haya empacado lo suficiente, colóquelo dentro del espectrómetro de RMN y comience a girar hasta cinco kilohercios. Aquí. Se utiliza un espectrómetro bru advanced three de 500 megahercios. Adquiera el espectro de RMN de protones utilizando una secuencia de pulsos CP MG.

De acuerdo con las directrices del fabricante, el abundante pico de glucosa alfabórica y numérica de 5,22 partes por millón podría utilizarse para calibrar los espectros de RMN resultantes. Para desembalar el rotor, proceda a quitar la tapa, use el removedor de tapas, desenrosque el pasador de la rosca y retire el espaciador de teflón. Con el tornillo cilíndrico, el aparato se puede lavar a fondo con agua y detergente.

La aparición de cometabolitos microbianos intestinales a lo largo del proceso de colonización se ilustra claramente en este espectro de protones de un perfil metabólico urinario para un animal colonizado durante 20 días. Este animal no excretó ningún sulfato dócil y cantidades muy pequeñas de fenilacetilglicina, PAG abreviado y sulfato de células que en el estado libre de gérmenes. A medida que avanza la colonización, estos tres marcadores del metabolismo de las proteínas por parte de la microbiota intestinal aumentan considerablemente y alcanzan un equilibrio a los 20 días.

Al integrar el pico específico del triplete PAG, fue posible cuantificar el aumento de este marcador en particular a lo largo del tiempo. Este diagrama representa la concentración promedio de PAG durante la colonización para un grupo de siete animales utilizando espectroscopía de protones H-R-M-A-S-N-M-R, se obtuvo el perfil metabólico hepático de dos ratones antes y después de la colonización. Esta figura ilustra bien la información que se puede derivar del perfil metabólico basado en A-M-A-S-N-M-R.

Se pueden visualizar numerosos aminoácidos, así como metabolitos derivados del metabolismo energético. Estos perfiles también contienen información relevante sobre el estrés oxidativo, el metabolismo de los nucleótidos y el metabolismo de las metilaminas. En este ejemplo, está muy claro que el ratón libre de gérmenes casi no muestra glucógeno y tiene cantidades muy bajas de glucosa y triglicéridos.

Por lo tanto, siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar múltiples herramientas estadísticas como la quimioterapia para agrupar muestras lógicas según el perfil metabólico y resaltar los biomarcadores asociados con el estado metabólico.