Name: Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a aislar líquido extracelular de Caenorhabditis elegans mediante microinyección para estudiar señalización RNAi y composición del fluido pseudocelómico. Este método permite analizar vías de señalización intercelular.

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Nos gustaría reconocer la naturaleza de colaboración del laboratorio de Hunter, y darles las gracias por el debate útil y la asistencia que han hecho del desarrollo de esta técnica posible y divertido. Nos gustaría dar las gracias a Nigel Delaney y el Caenorhabditis Centro de Genética para el gusano y las cepas bacterianas. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM089795 a CPH.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos presentado aquí un nuevo método que permite el aislamiento y la caracterización de líquido extracelular del organismo modelo C. elegans. La técnica comienza con la manipulación genética o física de gusanos donantes a incrementar su volumen total de fluido extracelular. Fluido extracelular se aísla a continuación usando una técnica de microinyección modificada. Los gusanos están montados para la microinyección usando almohadillas secas de agarosa para mantener los gusanos inmóvil durante el procedimiento. ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Día</strong</td&gt;<td<strong&gt; Worm Prep</strong</td&gt;<td<strong&gt; Material Prep</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 O antes</td&gt;<td&gt; Mantener limpio y bien alimentados<em&gt; Clr-1 (e1745)</em&gt; N2 y gusanos</td&gt;<td&gt; Hacer almohadillas de inyección, placas de NGM, NGM + Carb / placas de IPTG, OP50 acciones LB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Streak por RNAi comida en LB + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Inocular 3 ml durante la noche con comida RNAi</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; Mover embriones para RNAi placa</td&gt;<td&gt; Semilla RNAi placa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; Cambie los gusanos a 25 durante 4 horas</td&gt;<td&gt; Hacer las placas de ensayo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Mover gusanos para limpiar las placas de NGM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampírico transferencia</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Recuperar destinatario</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +1</td&gt;<td&gt; Eliminar destinatario de la transferencia</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +2</td&gt;<td&gt; Resultado Progenie</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabla 1.</strong&gt; Timeline preparación de materiales.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Equipos</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Presión del inyector picolitros</td&gt;<td&gt; Warner Instruments</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / Brown micropipeta Puller</td&gt;<td&gt; Sutter Instruments</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; Reactivos</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Aceite Mineral</td&gt;<td&gt; EM Science</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 n º 1 ½ cubierta de cristal</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE agarosa</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vidrio borosilicato capilares</td&gt;<td&gt; Mundo Precisiones Instrumentos</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Solución de hipoclorito de sodio (5% de cloro disponible)</td&gt;<td&gt; JT Baker</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt; Y Cepas bacterianas</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Clr-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; El Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; GLP-1</em&gt; RNAi vector<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Fuente Bioscience (Biblioteca Ahringer Alimentación)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Pal-1</em&gt; RNAi vector<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; El Centro de Genética Caenorhabditis (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabla 2.</strong&gt; Reactivos y equipos específicos.</p

vampiric aislamiento de líquido extracelular de<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

El organismo genéticamente tractable modelo C. elegans ha ayudado a comprender un gran número de cuestiones biológicas, habilitado por su corto tiempo de generación, facilidad de crecimiento y el tamaño pequeño. Este pequeño tamaño, sin embargo, ha rechazado un número de enfoques técnicos encontrados en otros sistemas modelo. Por ejemplo, las transfusiones de sangre en los sistemas de mamíferos y las técnicas de injerto en plantas permiten hacer preguntas de composición del sistema circulatorio y señalización. El sistema circulatorio de la lombriz, el pseudoceloma, ha sido hasta hace poco imposible de ensayo directamente. Para responder a las preguntas de la señalización intercelular y el sistema circulatorio composición C. investigadores elegans tradicionalmente han convertido a un análisis genético, de célula / tejido de rescate específico, y el análisis de mosaico. Estas técnicas proporcionan un medio para inferir lo que está pasando entre las células, pero no son universalmente aplicables en la identificación y caracterización de moléculas extracelulares. Aquí les presentamos una neWLY técnica desarrollada a ensayo directamente el fluido pseudocoelomic de C. elegans. La técnica comienza con cualquiera de manipulación genética o física para aumentar el volumen de fluido extracelular. Después, los animales se someten a una técnica de microinyección vampírica inversa usando una plataforma de microinyección que permite un control fino balance de la presión. Después del aislamiento de fluido extracelular, el líquido recogido puede ensayarse por transferencia a otros animales o por medios moleculares. Para demostrar la eficacia de esta técnica se presenta un enfoque detallado para el ensayo de un ejemplo específico de moléculas de señalización extracelular, durante un largo dsRNA de respuesta RNAi. Aunque la caracterización de RNAi sistémico es una prueba de principio ejemplo, vemos esta técnica como ser adaptable para responder una variedad de preguntas de la composición del sistema circulatorio y de señalización.

El organismo modelo<em&gt; C. elegans</em&gt; Utiliza fluido pseudocoelomic como un sistema circulatorio pasiva. Ensayo directo de este fluido no ha sido posible anteriormente. Aquí se presenta una técnica novedosa de ensayo directamente en el espacio extracelular, y utilizar las señales sistémicas silenciamiento durante una respuesta de RNAi como una prueba de principio ejemplo.

Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

El organismo modelo genéticamente manejable *C. elegans* ha proporcionado conocimientos sobre una miríada de cuestiones biológicas, gracias a su corto tiempo de generación, ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar el líquido extracelular para responder preguntas sobre el pseudolíquido, su composición y función, como aquellas relacionadas con la señalización de ARN en el ojo. Esto se logra primero alimentando a los gusanos con bacterias que expresan ARN de doble cadena (DS RNA), lo que produce un fenotipo de ARNi fácilmente cuantificable. A continuación, se permite que los gusanos diseminen las señales de silenciamiento de ARNi a lo largo de todo el cuerpo.Luego, se incrementa el volumen total del líquido extracelular disponible. Finalmente, se utiliza una aguja de microinyección para extraer el líquido extracelular e inyectarlo en un gusano naïve a ARNi. En última instancia, la presencia de señales de silenciamiento por ARNi puede demostrarse mediante la evaluación de la descendencia de los gusanos inyectados.Mediante este método, podemos analizar la composición del fluido extracelular para obtener información no solo sobre el ARNi sistémico, sino también sobre una variedad de vías de señalización intercelular. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades debido a la rapidez con la que se debe trabajar. Para prep

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Investigación

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Biología

Este video describe un método para disociar gusanos enteros en una suspensión unicelular adecuada para FACS o inmunoprecipitación de células intactas.

Disociación unicelular de Caenorhabditis elegans: un método para aislar células vivas

Fuente: Petersen, C. et al., Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demuestra el aislamiento y cultivo de especies bacterianas asociadas a Caenorhabditis elegans. Una lisis basada en perlas de C. elegans, seguida de un cultivo selectivo, permite aislar diversas cepas microbianas para su análisis posterior.

Aislamiento y cultivo de Caenorhabditis elegans - Bacterias asociadas

Este video muestra el aislamiento de neuronas marcadas con fluorescencia de Caenorhabditis elegans. Se obtiene una suspensión celular a partir de gusanos transgénicos modificados para expresar transportadores vesiculares transmembrana fusionados con proteínas fluorescentes en neuronas colinérgicas. A continuación, las neuronas marcadas con fluorescencia se aíslan mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se mantienen en cultivo.

Aislamiento de neuronas de Caenorhabditis elegans mediante clasificación celular activada por fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento simple de grupos específicos de células neuronales vivas que expresan proteína fluorescente verde de líneas transgénicas de Caenorhabditis elegans.  Este método permite una variedad de estudios ex vivo centrados en neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar las células para el cultivo a corto plazo.

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

Este artículo presenta métodos para generar, purificar y cuantificar vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans.

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

El protocolo describe un diseño simple de chip microfluídico y una metodología de microfabricación utilizada para cultivar C. elegans en presencia de un suministro continuo de alimentos durante hasta 36 h. El dispositivo de crecimiento e imágenes también permite obtener imágenes intermitentes de alta resolución a largo plazo de procesos celulares y subcelulares durante el desarrollo durante varios días.

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.

Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios

Aquí se presenta una descripción del aislamiento directo y relativamente rápido del ADN genómico de Caenorhabditis elegans de uno o unos pocos animales utilizando un kit de tejido disponible comercialmente. La preparación de gDNA resultante es una plantilla adecuada para PCR.

Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe un ensayo para cuantificar la tasa de alimentación de Caenorhabditis elegans basado en la medición del aclaramiento de bacterias en cultivo líquido.

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Aquí, describimos las condiciones de cultivo in vitro , el aislamiento y el aumento de la generación de vesículas extracelulares (EV) de Echinococcus granulosus. Los pequeños vehículos eléctricos se caracterizaron mediante dispersión dinámica de la luz y microscopía electrónica de transmisión. La captación por las células dendríticas derivadas de la médula ósea y su modulación fenotípica se estudiaron mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Aislamiento y absorción de células dendríticas de pequeñas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aprende a aislar líquido extracelular de Caenorhabditis elegans mediante microinyección para estudiar señalización RNAi y composición del fluido pseudocelómico. Este método permite analizar vías de señalización intercelular.

Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de

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