Luz correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) como una herramienta para visualizar moléculas microinyección y sus objetivos eucariotas subcelulares

El objetivo general del siguiente experimento es introducir pequeñas moléculas o proteínas marcadas con fluorescencia en el citoplasma de una célula de mamífero cultivada, y observar los cambios morfológicos inducidos de una resolución micrométrica a multinanométrica. Esto se logra cultivando primero células de mamíferos en cubreobjetos de vidrio rejillados y microinyectándolas con una pequeña molécula o proteína de interés marcada con fluorescencia. A continuación, las células se fijan en formaldehído y se observan y obtienen imágenes mediante microscopía de fluorescencia.

Luego, las células se fijan con glutaraldehído, se seccionan, se tiñen y se obtienen imágenes mediante microscopía electrónica. Finalmente, las imágenes tomadas durante la microscopía fluorescente de campo claro y electrónica se combinan y alinean. En última instancia, la correlación de estas imágenes permite al investigador obtener imágenes a alta resolución de perturbaciones inducidas por la pequeña molécula o proteína de interés.

Hola, soy el Dr. Evan Reddick en el laboratorio del Dr. Neil Alto en el departamento de microbiología del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas. Hoy os voy a hablar del procedimiento M Clem o de la microinyección de luz correlativa y microscopía electrónica. La principal ventaja de este procedimiento sobre las técnicas independientes, como la microinyección o la microscopía, es que aquí se realizan en concierto y se ayudan con el uso de un cubreobjetos de vidrio rejilla.

Es este cubreobjetos cuadriculado el que permite a los investigadores volver a la misma celda durante diferentes partes del protocolo. Además, esta técnica permite al investigador observar los cambios arquitectónicos subcelulares inducidos a partir de una amplia variedad de pequeñas moléculas inyectables o proteínas de interés, y hacerlo desde una resolución micrométrica hasta una multinanmétrica. Para prepararse para el cultivo por microinyección, las células como el riñón de rata normal o las células de cáncer de cuello uterino inmortalizadas en cubreobjetos rejilla de vidrio fotograbado adheridos a dos placas de células vivas incuban las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2.

Dependiendo de la línea de tiempo experimental que se vaya a utilizar, ajuste la cofluidez de las células. Una placa completamente confluente hará que la identificación de las células microinyectadas en el microscopio electrónico sea muy difícil. Por lo tanto, las células semilla como ellas alcanzan alrededor del 50% de fluidez en el día de un experimento corto y alrededor del 25% de fluidez en la co.

El día de un experimento más largo, prepare el ADN de proteínas marcadas con fluorescencia o moléculas pequeñas en el tampón apropiado hasta un volumen final de 50 microlitros. Dependiendo de la fuente de flúor que elijas, agrega un tinte de seguimiento como el rojo de Texas o el azul cascada. Añade una concentración de 0,5 a un miligramo por mililitro.

Filtre la solución a través de un filtro centrífugo de 0,22 micras. Después de extraer las agujas de microinyección siguiendo las pautas del fabricante, pipetee cuidadosamente los microlitros de solución en el extremo posterior de la aguja. Cargue la aguja en el brazo micromanipulador de un dispositivo de microinyección comercial conectado a un microscopio invertido.

Coloque una placa de células cultivadas en el soporte de la placa del microscopio invertido. Busque las celdas que crecen dentro de una cuadrícula fotograbada y observe el identificador alfanumérico de las cuadrículas. Esto se utilizará en todos los pasos posteriores.

Es importante elegir celdas para la microinyección que estén adheridas cerca del centro del cubreobjetos y evitar las que estén cerca de la periferia. Esto es importante ya que asegurará una transferencia eficiente de sus células de interés a la pieza central de resina epon utilizada más tarde para la microscopía electrónica Manual, baje manualmente el brazo de inyección sobre el cubreobjetos y use el micro manipulador para bajar la aguja hasta que la punta toque suavemente la superficie de las células. Micro inyecte cada dos células dentro de la rejilla elegida para celdas cultivadas a aproximadamente el 50% de fluidez Co espere alrededor de 80 celdas por cada cuadrícula de 600 micrómetros cuadrados, lo que dará un N de aproximadamente 30 a 40 celdas experimentales y controladas.

Después de inyectar, vuelva a colocar la placa en la incubadora durante el tiempo deseado para realizar la microscopía fluorescente. Deseche el medio de crecimiento y fije las células con formaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Reemplace el fijador por un XPBS.

A continuación, documente la disposición de las celdas tomando de cinco a 10 imágenes de campo claro de la cuadrícula elegida con aumento bajo y alto. Para identificar las células microinyectadas, tome imágenes fluorescentes en las longitudes de onda de excitación y emisión del ojo de tinte de inyección inerte. Usando un microscopio confocal, recoja un Zack de imágenes de células microinyectadas a gran aumento dentro de la misma cuadrícula previamente fotografiada.

Se necesita un gran aumento para correlacionar las imágenes fluorescentes con las estructuras subcelulares que se identificarán mediante microscopía electrónica. Después de la obtención de imágenes confocal, use un líquido de extracción de cubreobjetos para separar el cubreobjetos de la placa y colóquelo con la célula hacia arriba en una placa de cultivo fresca que contenga un XPBS. Proceda al procesamiento para microscopía electrónica.

Siga los protocolos EM estándar. Para fijar, manchar y deshidratar las muestras, prepare resina epon y coloque la tapa con el lado de la celda deslizante hacia abajo encima de un tubo lleno de resina eon. Deje que la resina polimerice a 60 grados centígrados durante 24 horas.

Para quitar el cubreobjetos de la resina epon. Sumérgelo rápidamente en nitrógeno líquido. La temperatura osciló entre los 60 grados centígrados y los 196 grados centígrados negativos.

Quita el cubreobjetos del tubo de resina. Espere de cinco a 10 minutos, luego recupere el tubo, que ahora está libre del cubreobjetos. Bajo un telescopio de disección, inspeccione la superficie de la resina para localizar la cuadrícula de interés.

Con una hoja de afeitar estéril o un bisturí, recorte el bloque de epón de manera que solo la cuadrícula de interés esté en el vértice del bloque con un corte ultra microtono. Las secciones seriadas del bloque recortado usan acetato de urinario y citrato de plomo para contrastar las secciones utilizando protocolos estándar. Reubique las células deseadas en el microscopio electrónico utilizando la posición relativa de las células como guía. Utilizando las imágenes fluorescentes de alta resolución capturadas anteriormente.

Identificar regiones de interés en la micrografía electrónica que corresponden a la señal fluorescente. Utilice puntos de referencia como la posición de la heterocromatina y la envoltura nuclear para determinar qué imagen fluorescente de Zack corresponde al corte EM. Actualmente se está fotografiando con un programa de imagen como Image J o Adobe Photoshop, reduzca la opacidad de la imagen fluorescente al 50% y superpóngala en la imagen TEM correspondiente.

Alinee las imágenes ajustando la escala que se muestra. Estos son los resultados de la microinyección y la microscopía óptica y electrónica correlativa. Esta imagen muestra la micrografía de campo claro de las células NRK creciendo en un cubreobjetos de vidrio rejiculado grabado con láser.

Observe las letras de fondo b y m utilizadas para identificar la cuadrícula que contiene las celdas inyectadas. Las flechas indican las dos células identificadas y fotografiadas con microscopía electrónica. Aquí se muestra una imagen fluorescente de la cascada de colorante de seguimiento inerte azul utilizada para identificar las células microinyectadas.

Aquí hay una superposición de las señales de campo claro y fluorescentes de la molécula pequeña marcada con amina. Este panel representa la correlación de la microscopía fluorescente de campo claro y electrónica de una célula inyectada. La punta de flecha indica puntos fluorescentes fotografiados con mayor aumento en este panel.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo microinyectar una proteína de interés y rastrear sus cambios morfológicos subcelulares que induce utilizando el procedimiento de microinyección Clem o microscopía correlativa de luz y electrónica.