Flujo de ácido nucleico cerrado Citometría de fluorescencia In situ (LNA flujo-FISH): un método para la detección de bacterias pequeñas de ARN

El objetivo general de este procedimiento es detectar la expresión de ARN bacteriano en células bacterianas individuales. Esto se logra primero diseñando una sonda de ácido nucleico bloqueado o LNA con una modificación de biotina TEG en el extremo cinco prime. Si luego las células bacterianas se fijan, tratan con dathyl, percarbonato o dsy y a continuación se permeabilizan, el ARN se desnaturaliza y la sonda LNA se hibrida.

En tercer lugar, las células se lavan, bloquean y tiñen. Finalmente, se mide la fluorescencia celular mediante citometría de flujo. En última instancia, se pueden evaluar los cambios en la expresión de ARN a lo largo del tiempo y dentro de las poblaciones.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la presencia relativa y la abundancia de especies de ARN dentro de una sola célula, y el grado en que esta expresión cambia dentro de poblaciones homogéneas o heterogéneas. Aunque este método se está utilizando actualmente para monitorear la expresión de ARN pequeños en bacterias, en teoría, puede emplearse para detectar ARN en prácticamente cualquier tipo celular. Después de diseñar la secuencia de la sonda LNA, utilice blast para asegurarse de que la sonda sea específica únicamente para el ARNs o el ARNm de interés.

Al solicitar la sonda, agregue una modificación de biotina TEG en el extremo cinco prime del oligonucleótido LNA. La biotinilación es necesaria para la tinción posterior a la hibridación con un conjugado de estreptavidina marcado. Se deben incluir tres controles negativos en el método: uno A, control sin LNA, en el cual no se agrega sonda LNA durante la hibridación.

Paso dos, un control sin tinte en el que la sonda LNA se hibrida con el ARNs diana, pero el evento de hibridación no se detecta debido a la ausencia del tinte fluorescente. Y tres, un control de ARNs o ARNm no expresado que utiliza una sonda LNA que diana un ARNs inexistente o no expresado con el fin de monitorear la hibridación no específica. Comience recolectando 1 × 10⁸ células de la bacteria de interés y transfiriéndolas a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Luego, haga un pellet de las células bacterianas a 2300 × g durante cinco minutos tras la centrifugación.

Elimine el sobrenadante mediante pipeteo y no por decantación. A continuación, reuspenda el sedimento en 400 microlitros de PBS, agregue 400 microlitros de solución fijadora de PBS con ácido acético y PFA, y mezcle bien las células. Incube ahora la suspensión durante 10 minutos a 25 grados Celsius.

Agitar por vórtex una vez después de cinco minutos, tras centrifugar nuevamente las células. Esta vez a 4.500 ×g durante dos minutos. Lavar el sedimento dos veces con 400 microlitros de PBS.

Finalmente, resuspenda el sedimento en 400 microlitros de PBS y almacene las células fijadas a cuatro grados durante hasta siete días. Comience añadiendo 400 microlitros de una solución recién preparada al 0,1 % a cada muestra de células bacterianas fijadas y luego mezcle bien las soluciones celulares mediante pipeteo.

Incube esta mezcla durante 12 minutos a 25 grados Celsius, y luego, tras lavar las células dos veces con 400 microlitros de PBS, añada 800 microlitros de una solución recién preparada de lisozima a las células. Mezcle bien la solución de células y lisozima mediante vortex y incube las células durante 30 minutos a 25 grados Celsius con mezclados ocasionales. Después de centrifugar las células, añada 800 microlitros de una solución recién preparada de proteinasa K al precipitado y mezcle bien la solución de células rehidratadas mediante pipeteo.

Incube las células durante 15 minutos a 25 grados Celsius, agitando en vórtex a la mitad del periodo de incubación; tras centrifugar y lavar las células con 400 microlitros de PBS, reuspenda las células en otros 400 microlitros de PBS y agregue 100 microlitros de la suspensión en cuatro tubos microcentrífugos separados de 1,5 mililitros, luego centrifugue las células y deseche los sobrenadantes. Ahora incube las cuatro muestras en 100 microlitros cada una de tampón de hibridación a 60 grados Celsius durante 60 minutos. Tras la hibridación, agregue un mililitro de SSC más tween 20 o SSCT a la mezcla de hibridación para permitir que las células se separen de la solución viscosa de hibridación.

Después de la centrifugación, añadir 200 microlitros de solución de formamida SSCT a los pellet y mezclar completamente. A continuación, incubar las muestras durante 30 minutos a 65 grados Celsius en un bloque térmico. Ahora, añadir un mililitro de SSCT a la mezcla y, tras centrifugar las células nuevamente, resuspender las células en 500 microlitros de SSCT e incubar la solución celular durante 40 minutos en el bloque térmico.

Después de la centrifugación, agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo a los pellet de células hibridadas y luego incube las células durante 30 minutos a 25 grados Celsius. Después de una nueva centrifugación, agregue 50 microlitros de una solución de avidina desprovista de colorante a los pellet y mezcle bien las células para el control sin colorante. Añada 50 microlitros de tampón de bloqueo.

Incubar únicamente todas las muestras durante otros 12 minutos a 25 grados Celsius con mezcla constante en un mezclador térmico, protegiendo los tubos de la luz utilizando papel de aluminio. A continuación, lavar las células una vez con 500 microlitros de tampón SSCT y una vez con 400 microlitros de PBS más tween 20 o PBST. Después de eliminar los sobrenadantes, añadir 100 microlitros de antis biotinilados, strippin y PBS durante 30 minutos a 25 grados Celsius con mezcla ocasional; este anticuerpo se unirá al conjugado de strippin DI introducido en el paso anterior.

Luego, tras centrifugar y lavar las células dos veces con 400 microlitros de PBST, tiña por segunda vez añadiendo 50 microlitros de la solución de avidina desprovista de colorante a las células y mezcle bien. Este paso aumenta la señal emitida por sonda LNA hibridada en el control sin colorante. Nuevamente, añada solo 50 microlitros de tampón bloqueante y, a continuación, incube todos los tubos durante 12 minutos a 25 grados Celsius con mezcla constante en un mezclador térmico.

Después de la incubación con la solución de colorante, lave las células una vez más con 500 microlitros de tampón SSCT y luego una vez con 400 microlitros de PBST tras el segundo lavado. Reuspenda el precipitado en 200 microlitros de PBST y almacene las células a cuatro grados Celsius hasta que estén listas para el análisis por citometría de flujo. Para células bacterianas más pequeñas, ajuste la velocidad de flujo del citómetro a lenta para reducir el tamaño del núcleo. Además, en citómetros de flujo con umbrales de corte de dispersión frontal, establezca el umbral lo más bajo posible para asegurar que se detecten las células bacterianas pequeñas.

Un ejemplo de células que están fijadas y permeabilizadas de manera eficaz se muestra aquí en este gráfico de dispersión de citometría de flujo al utilizar las condiciones recién descritas. Para la permeabilización, la población celular es pequeña y homogénea, lo que indica pocos agregados celulares. Sin embargo, cuando se usan concentraciones más altas de lisozima, las células tienen mayor tendencia a agregarse y muestran valores aumentados de dispersión hacia adelante, indicativos de partículas más grandes, como se observa en este gráfico de dispersión.

Aquí se muestra un ejemplo de datos de citometría de flujo procedentes de un experimento exitoso de LNA flow FISH. El histograma demuestra la detección específica de un ARNs diana junto con tres controles negativos. El control negativo sin colorante, en color morado, produce la menor fluorescencia, seguido por los controles negativos sin LNA y con ARNs no expresado, en azul y rojo respectivamente.

Por último, la muestra con la sonda LNA específica para ARNs produce la mayor fluorescencia en negro. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente seis horas si se lleva a cabo correctamente. Además, esta técnica proporciona más información y es más rentable que la R-T-P-C-R.

Tras seguir este procedimiento, se pueden marcar sondas adicionales con otros HAPS y añadirlas durante la etapa de hibridación para permitir la detección multiplex de ARN.I.