Etiquetado inmunohistológica de microtúbulos en las dendritas neurona sensorial, tráqueas y los músculos en el Drosophila Larva pared del cuerpo

El objetivo general de este procedimiento es marcar los microtúbulos en las dendritas de las neuronas sensoriales en la etapa temprana de la larva de Drosophila. Esto se logra primero fijando una larva en una cámara de disección magnética, luego diseccionándola rápidamente en un filete de larva. Luego, aún en la cámara magnética, el filete se fija inmediatamente y se inmunotiñe.

El paso final es montar el tejido, la microscopía de inmunofluorescencia confocal puede revelar la distribución microtubárica en las dendritas de la neurona sensorial dopaminérgica. Hola, mi nombre es Ol Kareem. Hoy demostraré un protocolo para el marcaje inmunohistológico de microtúbulos en neurodendritas sensoriales, tráquea y músculos en la pared del cuerpo de las larvas.

Este método está diseñado para proporcionar información sobre la organización de Myco TL en las neuronas sensoras periféricas. Además, se puede aplicar al estudio de las redes Myco TL y otros tipos celulares y tejidos de la pared corporal larvaria antes de comenzar. Es fundamental para el éxito de este protocolo que el fijador se haga fresco inmediatamente antes del inicio de este protocolo.

Los antecedentes genéticos de la población también son críticos. Por ejemplo, para examinar las neuronas dendríticas de arborización, seleccione animales que expresen una etiqueta en las membranas de esas neuronas, como la cereza MCDA o la naranja MCDA, RA. Con un lazo de pelo, lave rápidamente una larva del primer estadio en agua y luego muévala a la cámara de disección.

Ahora, para examinar las neuronas del grupo ventral, oriente las larvas con el lado dorsal hacia arriba y el lado ventral sobre el vidrio. Para examinar las neuronas del grupo dorsal, invierta la orientación con un alfiler de insecto, asegure el extremo anterior cerca de los ganchos bucales. Coloque el alfiler cerca del extremo para obtener mejores resultados.

Las redes micro y triples, y en particular las de DDR sensorizadas, se descompondrán rápidamente después del inicio de la disección. Lograr la primera disección y la fijación rápida son factores clave en el éxito de este protocolo. Corta la punta muy posterior de la larva con unas microtijeras con pinzas.

Agarre el tejido intestinal que sobresale de la nueva abertura y extraiga suavemente todo el intestino. Ahora con micro tijeras, inserte una hoja en la misma abertura y corte a lo largo de la línea media ventral hacia la parte anterior. Ahora sujete con alfileres las esquinas posteriores ahora libres y estire suavemente para abrir el filete de larva si es necesario.

Limpieza rápida de los órganos internos restantes. A continuación, proceda inmediatamente a la fijación. Para preservar los frágiles microtúbulos.

Comience aspirando el tampón HL 3.1 sin calcio con una pipeta mientras llena inmediatamente la cámara con un fijador recién preparado. Con una pipeta diferente, reemplace inmediatamente este fijador diluido. Con un fijador nuevo, todos los pasos de fijación y bipedestación se llevan a cabo en la cámara de disección.

Durante este proceso, tenga cuidado de no golpear los alfileres de insectos que sostienen la lava como este MEL para dañar los tejidos. Ahora deje que la fijación proceda sin interrupciones durante 20 minutos a temperatura ambiente para finalizar la fijación. Lave el filete de larva seis veces con PBST durante 10 minutos por lavado.

Por lo tanto, las larvas se enjuagaron sin fijador durante un total de una hora a temperatura ambiente. La agitación durante las incubaciones es innecesaria y es probable que cause daño tisular inadvertido. Para prepararse para la tinción, retire el último lavado de PBST y bloquee el filete fijo llenando la cámara con suero de cabra al 5% en PBST, reemplace la solución de bloqueo con anticuerpos primarios diluidos en suero de cabra al 5% en PBST.

Los anticuerpos primarios utilizados son ratón, antifa, tubulina y rata anti CD ocho, ambos diluidos de uno a 1000 para evitar que el experimento se seque. Coloque la cámara en un recipiente de plástico con pañuelos húmedos. Incubar el filete en los anticuerpos durante al menos 16 horas a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, elimine los anticuerpos primarios no unidos con seis lavados de PBST durante 10 minutos por lavado, como se hizo para eliminar el fijador. Después de una hora de lavados con PBST, agregue la solución de anticuerpos secundarios diluida en suero de cabra al 5% en PBST. En este ejemplo, los anticuerpos son LOR 4 88, IgG anti ratón y P SI tres IgG anti rata cubren la cámara a partir de este punto para evitar el fotoblanqueo de flúor 4 y luego incuban el filete en el secundario durante dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados, seguido de una hora a temperatura ambiente.

Después de la incubación secundaria de anticuerpos, elimine los anticuerpos no unidos con el mismo programa riguroso de seis lavados en PBST a 10 minutos por lavado. Ahora que el filete está listo para el montaje para un montaje rápido, sumerja el tejido en una pequeña gota de glicerol al 80% con pinzas. Sujete la punta del extremo anterior cerca de los ganchos bucales y transfiérala a un portaobjetos con la cutícula hacia abajo, selle los lados del cubreobjetos con esmalte de uñas para mejorar la limpieza del tejido y obtener una muestra estable permanente.

Como se describió anteriormente, la tinción fluorescente reveló que diferentes ramas dentro de un árbol de dendritas tienen diferente organización citoesquelética en un árbol de una neurona DA de clase cuatro de una larva de primer estadio, las ramas principales son positivas para tubulina. Si bien algunas ramas laterales delgadas no son un ensamblaje de secciones seriadas a través de una tinción similar de una neurona DA de clase uno convertida en una película, es más reveladora cuando la tinción inmunológica de tubulina en los tejidos circundantes realiza un análisis de la organización microtubárica y las neuronas. La tubulina antigrasa de ratón difícil se puede sustituir con antich de ratón específico de neurona diluido uno a 1000.

Las ramas principales de las neuronas de la clase cuatro son fch positivas. Mientras que algunas ramas laterales delgadas son fch negativas. Un conjunto de secciones seriadas de los músculos de la pared corporal reveló las redes de microtúbulos en este tejido.

Una proyección de varias secciones confocales seccionadas a través de la pared corporal, los músculos y la tráquea, mostró las complejas redes de microtúbulos en estos tejidos. Al acercarse a un conjunto de secciones en serie a través de un extremo traqueal en la pared del cuerpo, el músculo reveló las complejidades de la organización microtubaria. Por lo tanto, la combinación de este procedimiento con otros métodos, como la generación de MX genéticos de neuronas sensoras periféricas larvales, puede responder a preguntas adicionales, como qué mecanismos controlan la organización de micro TL en las dendritas.