Crear transitoria poros de la membrana de células utilizando una impresora de inyección de tinta estándar

El objetivo general de este procedimiento es crear poros transitorios en las membranas celulares mediante impresión por inyección de tinta. Esto se logra modificando primero una impresora de inyección de tinta estándar. El segundo paso es vaciar y limpiar un cartucho de tinta de impresora para permitir la inserción de la tinta biológica.

A continuación, las células de interés se suspenden en una solución de monómeros de actón marcados con fluorescencia y PBS para crear la solución de biotinta. El paso final es imprimir la biotinta en portaobjetos de microscopio utilizando la impresora y el cartucho modificados. En última instancia, la microscopía fluorescente se puede utilizar para mostrar que los cuatro monómeros de actina G conjugados con flúor han sido internalizados por las células impresas a través de poros transitorios de membrana.

La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas estándar de transfección y microinyección celular es que esta técnica de impresión es fácil de usar y produce una alta viabilidad celular. Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre la genética, también se puede aplicar a otros campos de estudio, como la biofísica celular y la ingeniería de tejidos en biofísica celular. Esta técnica se puede utilizar para observar fácilmente el citoesqueleto de una célula durante la migración celular.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando quisimos poder visualizar los cambios en la disposición del citoesqueleto debido a las fuerzas aplicadas sobre las células. Comience desbloqueando los clips de plástico de la base inferior de la impresora y luego levante lentamente la carcasa de plástico superior. A continuación, desconecte el panel de luz de la pantalla de botones de la parte superior de la impresora, dejándolo conectado a la placa base de la impresora.

Uso de toallitas Kim y etanol. Limpie el interior de la impresora, especialmente las áreas donde descansa el cartucho de tinta y donde se realiza la impresión. A continuación, localice el cable que suministra energía a los mecanismos de alimentación de papel para el escritorio HP Jet 500.

Están justo debajo de la bandeja de papel a la izquierda de la parte delantera y desconectan los cables de la placa base. Ahora ubique el mecanismo de detección de papel y fije un lazo de cable a la palanca de plástico gris que se encuentra encima y detrás del mecanismo de alimentación de papel de impresión para que sirva como manija manual, coloque una etapa aquí. El soporte de envío de espuma para 15 tubos de centrífuga se utiliza con varios portaobjetos de microscopio pegados con cinta adhesiva en la región de impresión delante del mecanismo de alimentación de papel para llevar los portaobjetos de impresión deseados a un nivel justo debajo del cabezal de impresión del cartucho.

Finalmente, para mantener la técnica aséptica, coloque la impresora dentro de una campana de flujo laminar. Comience por retirar el cartucho de su embalaje, dejando la cinta protectora cubriendo los contactos de la impresora y el cabezal de impresión. Estabilice el cuerpo del cartucho con una abrazadera, dejando la parte superior verde libre de cualquier obstáculo, utilizando una herramienta de corte rotativa manual.

Corta la tapa verde del cartucho, vacía la tinta restante del depósito y, a continuación, retira la cinta protectora de plástico que cubre los contactos de la impresora y el cabezal de impresión. Es probable que el agua se escape del cabezal de impresión durante este proceso, pero no causará ningún daño al cartucho. Cuando el agua salga clara, deje que el cartucho se seque.

Para mantener un entorno de impresión limpio, comience sumergiendo completamente el cartucho en un vaso de precipitados lleno de agua desionizada y, a continuación, sonique el cartucho durante 15 minutos. Después de la sonicación, retire el cartucho y sacuda el exceso de agua. Rocíe etanol al 70% en el cartucho para crear un ambiente más aséptico.

Después de cosechar las células de interés, centrifugar las células en cinco mililitros de medio fresco en un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros durante cinco minutos a 250 veces G a temperatura ambiente. A continuación, aspire el medio y luego vuelva a suspender las células a una vez de 10 a la quinta célula por mililitro en una solución madre de G actina fluorescente recién preparada Para crear tinta biológica, tenga en cuenta que 250 microlitros de tinta biológica imprimen tres cubreobjetos con el patrón de líneas que se muestra aquí. Después de encender y calentar la impresora, coloque aquí la superficie de impresión deseada, se utilizan cubreobjetos de 22 milímetros por 22 milímetros en el centro de la etapa previamente ensamblada.

A continuación, abra un programa de software de dibujo y seleccione el patrón deseado. Ahora pipetee aproximadamente 100 a 120 microlitros de la suspensión celular en el pequeño pocillo circular en la parte inferior del compartimento del cartucho. Imprima el archivo a medida que la impresora se caliente de nuevo, el cartucho se moverá a la posición de listo.

Cuando el cartucho se mueve ligeramente a la izquierda de la tinta, gotea bien y permanece allí. Tire hacia arriba del mecanismo de alimentación de papel, el alambre y comenzará la impresión. La impresora imprimirá en el cubrebocas colocado en el centro de la etapa de impresión utilizando una impresora HP Desk Jet 500 con una tinta biológica que consiste en una suspensión de células de fibroblastos en una solución de monómero de actina G.

Dentro de una serie HP 26, las celdas de los cartuchos de tinta se imprimían en cubreobjetos de microscopio de vidrio. Esta figura ilustra un resultado representativo de células de fibroblastos impresas que muestran monómeros de actina fluorescentes incorporados. Este patrón se utilizó en la figura anterior para crear una línea continua de la solución de impresión a lo largo de la mayor parte del portaobjetos del microscopio.

En esta figura, se muestra la línea recta en la que el bioenlace y las células se depositaron mutuamente. Tenga en cuenta que inmediatamente después de la impresión, hay un aumento de la fluorescencia de fondo porque la solución de biolink en la que se suspenden las células contiene monómeros de actina fluorescentes libres que incuban las células durante unos 10 minutos después de la impresión y facilita la adhesión al portaobjetos, lo que permite que el exceso de solución de monómero se lave del sustrato con medios de crecimiento frescos, lo que reduce significativamente la fluorescencia de fondo. Aquí, una imagen representativa de tres fibroblastos T 3 impresos en una zona de impresión localizada, como se muestra en esta fotomicrografía de microscopía fluorescente de una célula tomada 15 minutos después de la impresión muestra giin en verde, el núcleo en azul y la superposición de tanto la actina GI como el tinte nuclear.

Las siguientes dos imágenes muestran microscopía fluorescente de dos fibroblastos en un patrón de líneas tres horas después de la impresión. Esta primera imagen muestra monómeros de actina marcados con fluorescencia dentro de las células. Esta segunda imagen es una superposición del canal fluorescente con la imagen de fondo para mostrar que, aunque puede haber algunos residuos en el portaobjetos en la esquina inferior izquierda, no es fluorescente.

Finalmente, se presenta un grupo de control de células no impresas incubadas durante tres horas con monómeros marcados con fluorescencia para demostrar que los monómeros no pueden penetrar en la membrana celular sin la permeación de la membrana mediante la impresión celular. Al intentar este procedimiento, es importante tener varios cartuchos limpios y listos para usar, ya que la obstrucción de la impresora es uno de los problemas que ralentiza esta técnica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo convertir una impresora de escritorio estándar para imprimir células vivas, lo que ayuda a crear una fuerza transitoria en la membrana.