La determinación óptima de la actividad citotóxica de las células T específicas Her2Neu CD8 Humanos comparando el Ensayo de liberación de Cr51 al Sistema xCELLigence

El objetivo general del siguiente experimento consiste en determinar la actividad de los linfocitos T citotóxicos comparando un enfoque basado en la impedancia mediante el sistema EXOGEN con el ensayo de liberación de cromo. El primer paso se logra separando las células mononucleares de la sangre periférica de sangre completa utilizando fial. A continuación, se añaden las CPMSP a pozos junto con antígeno peptídico, IL-2 recombinante humana y CPMSP irradiadas para generar linfocitos T CD8 específicos del antígeno.

Las células T CD8 específicas para el antígeno se cultivan luego en cocultivo con células tumorales en ambos ensayos para inducir la muerte celular tumoral. Se obtienen resultados que muestran el porcentaje de lisis de las células tumorales utilizando tanto el método de impedancia como el ensayo de liberación de cromo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el ensayo de liberación de cromo es que el sistema basado en impedancia recopila datos en tiempo real y requiere menos células, las cuales no necesitan etiquetado alguno. Para este protocolo, la sangre de donantes sanos y positivos para HLA-A2 proporciona una fuente de pbmc o células mononucleares de sangre periférica siguiendo el protocolo del fabricante.

Utilice F call PA plus para separar los P BMCs de la sangre. A continuación, cargue aproximadamente 4 millones de P BMCs en placas de seis pocillos con dos mililitros de medio por pocillo. A cada pocillo, añada el péptido de unión HLAA dos para obtener una concentración final de 10 microgramos por mililitro en cultivo.

Las células en días alternos para ayudar a estimular y expandir los linfocitos T. Añada medio fresco suplementado con IL recombinante humana dos hasta una concentración final de 50 unidades por mililitro. Después de una semana, prepare un cultivo de pbmc autólogos, irradie las células y expóngalas durante dos horas al mismo hla.

Un péptido con dos sitios de unión a 10 microgramos por mililitro vuelve a estimular la cultura al agregar un mililitro de las PBMC autólogas irradiadas a cada una. Continúe agregando medio fresco suplementado con IL-2 cada dos días; tras otra semana, vuelva a estimular las culturas de la misma manera por segunda vez. Después de seis días más en cultivo, las células estarán listas para su uso.

Prepare la estación de medición de impedancia de inteligencia equilibrándola a 37 grados Celsius bajo un 5 % de dióxido de carbono durante al menos una hora. Recolecte células tumorales humanas al 75 % de confluencia utilizando tripsina al 0,25 % y centrifugación. Cuente las células tumorales utilizando un hemocitómetro y reconstitúyalas en RPMI.

Medio tumoral a una concentración de 7.500 células por microlitro. A continuación, el software del agente Excel configuró la página de diseño con el esquema de pocillos. Configure la página de programación para tomar lecturas de impedancia cada cinco minutos durante un período de 40 horas; durante las primeras 18 horas, el sistema Xceligent solo tomará lecturas de impedancia de las células tumorales.

Luego, agregue 100 microlitros de medio tumoral RPMI por pocillo. Tome una lectura de fondo en los EPL midiendo la impedancia en ausencia de células. Después de añadir las células tumorales, cargue las placas en la estación EPL y comience a tomar lecturas.

Las células tumorales comenzarán inmediatamente a adherirse a las EPL. Después de aproximadamente 18 horas de incubación, las células tumorales se habrán adherido a las EPL y se habrán duplicado hasta alcanzar 15.000 células tumorales por pocillo. En este momento, recolecte las células T preparadas mediante raspado suave y centrifugación con agitación.

Las células T, reconstitúyalas en medio RPMI con 10 % de FBS y cuéntelas utilizando un hemocitómetro. Una vez conocida la densidad celular, prepare una serie de diluciones al doble de las células T de manera que, cuando se añadan 200 microlitros de células T a las células tumorales, la concentración más alta sea de 40 células T por célula tumoral. La última dilución de la serie debe proporcionar 1,25 células T por célula tumoral.

Pausar la estación EXOGEN y retirar el EPL utilizando una pipeta. Eliminar el medio de los pocillos, luego cargar 200 microlitros de linfocitos T utilizando todas las concentraciones de la serie de diluciones como control negativo. Usar medio puro, devolver el EPL a la estación y continuar el programa al final del ensayo.

Normalice los resultados. Siga siempre los procedimientos institucionales de seguridad radiológica al trabajar con cromo 51 y células diana marcadas con cromo 51, y utilice blindaje para reducir la exposición a la radiación. Comience pulsando las células tumorales durante dos horas a un millón de células por mililitro con 10 microlitros por mililitro de cromo 51 fresco.

A continuación, lave las células tumorales con 10 mililitros de medio RPMI con 10% de FBS, centrifugue las células y reconstitúyalas en el mismo medio a una concentración de un millón de células por mililitro. Luego, en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, agregue 100.000 células tumorales por pocillo para calcular la liberación espontánea.

No agregue nada a seis de estos pocillos. Agregue 100 microlitros de Triton X-100 a seis pocillos adicionales para lisisar las células y así calcular la liberación máxima en todos los pocillos restantes. Agregue linfocitos T a la placa utilizando la serie de diluciones preparada previamente.

Ahora incube las placas durante cinco horas y recoja muestras de 50 microlitros de sobrenadante de cada una; cargue las muestras en una placa luma tras secar las placas durante la noche en la campana a temperatura ambiente. Mida su CPM utilizando un contador gamma de células T y SKBR tres. Las células cancerosas se cultivaron en placas X intelligence y se midió el índice de células, que es un reflejo de la impedancia de la placa, ya que las células T no requieren adherencia para proliferar.

Su efecto sobre la impedancia fue despreciable durante un cultivo de 40 horas. Las células cancerosas cultivadas solas mostraron una medición de impedancia creciente. Sin embargo, la adición de células T a las 18 horas interrumpe esta tendencia.

Este evento requiere una normalización por software tras la adición de linfocitos T y se investiga más a fondo en el siguiente experimento. Cuando las células SK BR 3 se cultivaron en cocultivo con concentraciones variables de linfocitos T, las reducciones en la impedancia fueron muy claramente dependientes de la dosis de linfocitos T; los datos se recopilaron cada cinco minutos durante tres ensayos hasta la marca de 10 horas. Los índices celulares siguieron un polinomio de segundo orden en el rango de concentraciones de linfocitos T, lo que indica que la estación Exogen monitorea en tiempo real la muerte mediada por linfocitos T CD8+ de los tumores SK B 3 como una caída en el índice celular, para determinar si las reducciones en la impedancia de SK BR 3 inducidas por los linfocitos T eran específicas del antígeno.

Las células SK KBR tres fueron cultivadas en co-cultivo con linfocitos T específicos para FLU, positivos para HLA A dos, que no reconocen HER dos nuevo. Estas células presentaron una actividad lítica significativamente menor. Para determinar más a fondo si los linfocitos T específicos para HER dos nuevo estaban induciendo muerte de manera específica al antígeno, se incorporó un anticuerpo contra el ligando rápido en las co-cultivos. El anticuerpo no redujo la actividad lítica de los linfocitos T específicos para HER dos nuevo P 360 9.

Sin embargo, con linfocitos T que fueron activados de manera no específica mediante microesferas anti-CD3, CD28, el anticuerpo sí inhibió la lisis para determinar si la muerte ocurría de manera dependiente de la clase I del HLA. Se añadieron anticuerpos anti-clase I del HLA o anticuerpos de control isotípico a las culturas mixtas. Los resultados respaldaron firmemente esta hipótesis.

Las células T se cocultivaron posteriormente con otras células cancerosas en una proporción de uno a cinco. La línea celular tumoral negativa para HLA A2, BT 20, se utilizó como control negativo. Los resultados muestran que el método es útil para múltiples células tumorales adherentes diana.

Se añadieron cultivos colectivos de las nuevas células T específicas HER dos P 360 9 a células diana marcadas con cromo 51, seguido de análisis de CRA. El ensayo de inteligencia parece más sensible para analizar la consistencia. La variación intraensayo se calculó como el porcentaje del coeficiente de variación en cada relación celular entre uno a 40 y uno a cinco.

Esto medido estuvo por debajo del 15 % en las proporciones más bajas de células. Sin embargo, el porcentaje de CV fue alto o impredecible. Además, se examinó la variabilidad de la lisis de células T SK BR tres mediante co-cultivo con diferentes líneas de células T específicas para P 360 9.

Los datos se generaron con 30 días de diferencia. Los ensayos se realizaron por triplicado y los resultados fueron muy similares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la actividad de los linfocitos T citotóxicos utilizando linfocitos T CD8 específicos para antígenos y células tumorales, mediante un enfoque basado en impedancia.