La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

El objetivo general de este procedimiento es detectar y cuantificar el grupo de toxina que ingresa al citosol. Para lograrlo, primero se une la toxina a la superficie de la célula huésped a cuatro grados Celsius. Luego se elimina la toxina no unida y las células se calientan a 37 grados Celsius, lo que permite el desplazamiento de la toxina hacia el sistema de endomembranas y, posteriormente, al citosol del huésped. A continuación, se utiliza dig tonin para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática tras la permeación celular.

Los extractos celulares se separan en fracciones membranal y citosólica separadas mediante centrifugación diferencial como paso final. La resonancia de plasmones de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) abreviada como SBR se utiliza para detectar y cuantificar la entrada de toxina al citosol mediante la perfusión de la fracción citosólica sobre un sensor SPR recubierto con un anticuerpo antitoxina. Este método ayudará a responder preguntas clave en el campo de la biología de toxinas, como la eficiencia y la cinética de la entrada de la toxina al citosol, la cantidad de toxina que ingresa al citosol y la posible inhibición farmacológica del tráfico de la toxina hacia el citosol. Antes de comenzar este protocolo, prepare las células heli para la intoxicación celular según se describe en el protocolo escrito, tras una incubación nocturna de las células HeLa.

Sustituya el medio de cultivo por un mililitro de DMEM que contenga 100 nanogramos por mililitro de gangliósido GM1 e incube durante una hora a 37 grados Celsius. Esto aumenta el número de sitios de unión para la toxina del cólera. Dado que las toxinas, el receptor GM1, se insertarán en la membrana plasmática de las células expuestas a una solución de GM1.

Tras una incubación de una hora, retire el medio de cultivo GM y lave las células dos veces con DMEM. A continuación, agregue un mililitro de DMEM que contenga un microgramo por mililitro de toxina del cólera, y coloque las células a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Retire el medio que contiene la toxina y lave las células dos veces.

Luego, incubar las células en un mililitro de DMEM a 37 grados Celsius durante el tiempo deseado. Al final de cada período de seguimiento, lavar las células con PBS y luego incubar cada pocillo con 250 microlitros de EDTA 0,5 milimolar en PBS. Tras una incubación de 10 minutos en hielo, retirar las células de la placa de seis pocillos mediante TRI vigoroso con un pipetador P 1000.

Después de recolectar un pocillo de células, combínelo con el segundo y luego con el tercer pocillo de la misma condición. A continuación, coloque la suspensión celular combinada de los tres pocillos replicados en un único tubo de microcentrífuga. Ahora, centrifugue el tubo de microcentrífuga en una microcentrífuga de banco durante cinco minutos.

En 5.000 × g, se deben obtener pellets celulares de tamaño aproximadamente equivalente para todas las condiciones. Descarte el sobrenadante y luego resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de una solución de trabajo al 0,04 % previamente preparada y enfriada de digitonina. Coloque la suspensión celular en hielo durante 10 minutos; utilizando una microcentrífuga de banco, centrifugue la digitonina y las células permeabilizadas a 16.000 × g durante 10 minutos.

Transfiera el citosol que contiene la fracción sobrenadante a un tubo fresco de microcentrífuga y conserve la fracción de pellet que contiene orgánulos. Los patrones de la toxina SPR se preparan en concentraciones de ciento diez, uno y 0,1 nanogramos por mililitro en tampón HCN. Las muestras se preparan diluyendo fracciones sobrenadantes que contienen citosol en tampón HCN hasta un volumen final de un mililitro. Son necesarios volúmenes de muestra de al menos un mililitro para asegurar que el aire sea expulsado del bucle de muestra de 500 microlitros antes de la inyección. Las fracciones de pellet que contienen orgánulos se resuspenden en un mililitro de tampón HCN que contiene 1 % de Triton X-100.

La adición de detergente es necesaria para liberar el grupo de toxina incluida en la membrana. Además, prepare conjuntos paralelos de fracciones citosólicas y de órgano L para un experimento control que confirme la fidelidad del procedimiento de fraccionamiento; suspenda la fracción citosólica en 20 microlitros de tampón de muestra 4x y la fracción de órgano L en 120 microlitros de tampón de muestra 1x. Resuelva volúmenes equivalentes de cada fracción mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) e investigue mediante análisis de transferencia Western para demostrar la distribución de una proteína citosólica en la fracción sobrenadante y de una proteína soluble del retículo endoplásmico en la fracción de precipitado. Para preparar la lámina de SPR, primero coloque una lámina de vidrio plateada con una capa autoensamblada en el instrumento de SPR.

Activee la lámina sensora perfundiendo una solución de E-D-C-N-H-S sobre la lámina durante 10 minutos a un flujo de 41 microlitros por minuto. En todas las perfusiones subsiguientes, utilizamos el mismo flujo. Elimine el tampón de activación E-D-C-N-H-S lavando la placa durante cinco minutos con PBS que contiene 0.05%2020.

La placa ahora contiene anclas MI reactivas debido a la eliminación del bloqueo mediante la solución E-D-C-N-H-S. A continuación, pase un anticuerpo anti-CTA sobre la lámina sensora activada a una dilución de uno a 20.000 en acetato de sodio 20 milimolar durante 15 minutos. Se observará una caída inicial en la unidad de índice de refracción, abreviada RIU, debido al cambio de pH.

Esto será seguido por un aumento en la RIU a medida que el anticuerpo sea capturado por los enlazadores reactivos con amida. En la lámina sensora, elimine el anticuerpo no unido de la lámina sensora mediante un lavado con PBST durante cinco minutos. La señal de RIU producida por el anticuerpo capturado alcanzará una meseta y se estabilizará, proporcionando una nueva señal de línea base.

Como paso final en la preparación del portaobjetos, PASE una solución de etanolamina un molar sobre el portaobjetos sensor durante cinco minutos. Esto bloquea e inactiva cualquier anclaje no unido que quede en el portaobjetos sensor. La señal de RIU aumentará para establecer una lectura de línea base; pase PBST sobre el sensor recubierto con anticuerpo durante cinco minutos.

A continuación, pase una muestra experimental o un estándar de toxina sobre el sensor durante 300 segundos. Retire el ligando del tampón y pase PBST sobre el sensor durante otros 200 segundos. Cualquier toxina que permanezca unida al sensor se elimina mediante un lavado número 102 con PBST a pH 5,0.

Esto devolverá la señal a su lectura inicial de línea base, permitiendo así procesar otra muestra en el mismo sensor. Antes de cargar una nueva muestra, impulse una pequeña cantidad de aire a través del bucle de muestra para expulsar cualquier fluido residual de la muestra anterior. Tras la adquisición.

Los datos pueden analizarse con el software Scrubber Two, y el software Igor puede utilizarse para la preparación de las figuras. La toxina de la pertussis es una toxina AB que se traslada desde la superficie celular hasta el RE antes de que su cadena a. PTs uno ingresa al citosol.

El ensayo de translocación basado en SPR pudo detectar PTs en el citosol de células CHO intoxicadas. No se generó ninguna señal a partir del citosol de células no intoxicadas, lo que confirmó la especificidad del anticuerpo anti-PTs. Un anticuerpo no mostró reacción cruzada con ningún componente del citosol del hospedador.

La fracción de citosol de células intoxicadas en presencia de felden. A tampoco logró producir una señal positiva; el BFA impide el transporte de la toxina hacia el sitio de translocación en el RE, y por lo tanto, la entrega de la cadena H al citosol. La coleraína es otra toxina del tipo AB que se transloca al RE.

Se detectó CTA uno en la fracción citosólica de células helo tratadas con CT. Esto destacó que la metodología funciona con múltiples tipos de células y puede aplicarse a cualquier toxina para la cual esté disponible un anticuerpo contra la cadena A. No se detectó ninguna señal cuando la fracción citosólica de células tratadas con CT se perfundió sobre un sensor SPR recubierto con un anticuerpo anti-CTB, demostrando así que, a diferencia de la subunidad CTA uno, el pentámero CTB de unión celular no entra en el citosol.

Tras la profusión sobre un sensor SPR recubierto con un anticuerpo anti-CTA. La señal de la fracción de orgánulos está fuera de escala en comparación con la señal más débil de la fracción citosólica. Esto es consistente con la conocida ineficiencia del transporte de CT hacia el sitio de translocación del RE, lo que a su vez limita la cantidad de toxina que puede alcanzar el citosol.

La acumulación dependiente del tiempo de la toxina citosólica translocada también puede monitorizarse. Tras la exposición celular a la CT a cuatro grados Celsius, no se detectó toxina en el citosol 15 minutos después de aumentar la temperatura a 37 grados Celsius.

Se detectó un pequeño grupo de toxina citosólica tras 30 minutos a 37 grados Celsius y cantidades progresivamente mayores de toxina citosólica se detectaron tras los intervalos de caza de 45 y 60 minutos. Esto demuestra una entrega continua a largo plazo de toxina asociada a la célula hacia el citosol hospedado. El ensayo también puede detectar la inhibición de la translocación de la toxina al citosol; las células tratadas con DMSO al 10 % exhibieron niveles bajos de CT similar al citosol en comparación con las células de control intoxicadas no tratadas y el desdoblamiento de la toxina.

Una cadena es un requisito previo para la translocación al citosol, por lo que la estabilización inducida por DMSO de CT A uno previno en consecuencia su movimiento desde el RE hacia el citosol. Para cuantificar el bloqueo inducido por DMSO en la translocación de la toxina, se utilizó una curva patrón generada a partir de concentraciones conocidas de toxina para calcular una concentración citosólica de cta uno de 0,3 nanogramos por mililitro en células no tratadas y de 0,1 nanogramos por mililitro en células tratadas con DMSO. La inhibición del desenrollamiento de CT A uno por DMSO generó así una reducción tres veces mayor en la translocación desde el RE hacia el citosol de CTA uno.

Tras seguir este procedimiento, podremos utilizar otras técnicas, como ensayos de intoxicación, para establecer un vínculo directo entre la cantidad de toxina presente en el citosol y la actividad de la toxina.