Name: El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Aprende a generar y purificar células progenitoras neuronales a partir de células madre neurales mediante el ensayo neuroblasto y citometría de flujo. Este protocolo permite aislar poblaciones celulares inmaduras con alta pureza.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.

1. Configuración básica Antes de proceder a la cultura de la célula <ol><li> NeuroCult Medio Basal y NSC NeuroCult Suplementos NSC proliferación se mezclan en una proporción 9:1, respectivamente, para hacer medio completo NSC. </li><li> Un baño de agua 37 ° C se utiliza para calentar el medio. </li><li> Cantidad apropiada de calor inactiva suero fetal bovino (FCS) se descongela. </li><li> Cantidad apropiada de las soluciones madre de factor de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF a 10 g / ml), factor de crecimiento básico de fibroblastos (b-FGF en 10 g / ml) y 0,2% de solución de heparina en tampón fosfato salino (PBS) se descongelan. </li><li> Frascos de cultivo de tejidos (T25, T75 y T175 o) son necesarios para la expansión del Consejo de Seguridad Nacional y la diferenciación. </li><li> El cultivo de tejidos tratados 96 y placas de 24 pocillos y cubreobjetos de vidrio se necesitan para el revestimiento con células seleccionadas. </li></ol> 2. El aislamiento, y Expansión (pases) de NSCs <ol><li> Madre neuronales y progenitores se aislaron y expandieron a partir del ratón blluvia como se describe en protocolos separados 1, 2 3. </li><li> Cuando el neuroesferas (neuroesferas primarias o passaged) están listos para el subcultivo (150-200 micras de diámetro), las esferas medio que contiene se transfiere a un tamaño apropiado estéril tubo de cultivo de tejidos, y se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> El medio sobrenadante se retira y las esferas se re-suspendió en 1 ml de pre-calentado 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Después de la incubación en un baño de agua 37 ° C durante 2-3 min, un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se añade a la suspensión de células para detener la actividad de la tripsina. </li><li> Para garantizar que la tripsina ha sido completamente inactiva, la suspensión celular se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces. </li><li> Después de centrifugación a 800 rpm (110 g) durante 5 min, el sobrenadante se retira y las células se re-suspendió en 1 ml de medio completo NSC. </li><li> 10ul de la suspensión celular se mezcla con 90 l de trypan azul para realizar un recuento de células. Nota: Otros diluciones apropiadas de células también puede ser utilizado. </li><li> Las células se utilizan entonces para subcultivo 1, 2 o para la diferenciación como se describe a continuación. </li></ol> 3. Diferenciación de células madre neurales y células progenitoras, el ensayo de neuroblastos (NBA) <ol><li> Las células resultantes de neuroesferas disociadas se sembraron a una concentración de 2-3 x 10 5 células / ml en el medio completo NSC suplementado con 20 ng / ml de EGF, 10 ng / ml de bFGF, 1 l / ml de 0,2% y 5% de heparina inactivado por calor FCS en un frasco de cultivo de tejido del tamaño apropiado. 5 ml de medio se utiliza para T25, T75 20 ml y 40 ml de matraces T175. Nota: FCS hará que las células se adhieren firmemente al sustrato y no hay necesidad de recubrimiento de los matraces para el cultivo de la NBA. </li><li> Cultoure frascos se incuban en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2 durante 3-4 días. Este período se denomina etapa de proliferación, durante el cual progenie NSC adjuntar al sustrato y proliferar como una monocapa de células. </li><li> Cuando el cultivo se convierte en un 90-95% confluentes, el medio de cada matraz se cambia a la completa medio NSC suplementado con 5% de FCS sin factores de crecimiento. </li><li> Frascos de cultivo se incuba de nuevo en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2 durante otros 3-4 días. Este período se denomina etapa de diferenciación, durante el cual los progenitores neuronales aparecen en la parte superior de una monocapa de astrocitos y proliferan para hacer colonias de células inmaduras neuronales. En el día 4-5 de la etapa de diferenciación, la cultura está listo para el aislamiento de las células de neuroblastos que utilizan la tecnología de citometría de flujo. </li></ol> 4. De preparación de células para citometría de flujo Trypsinización <ol><li> El cultivo de diferenciar progenie NSC en días 4-5 de la etapa de diferenciación se lava una vez con una cantidad apropiada de PBS (2 ml para T25, 4 ml para T75 y 8 ml para T175 matraz) para eliminar FCS a partir del cultivo. Nota: FCS bloques de tripsina-EDTA actividad. </li><li> A continuación, una cantidad suficiente de pre-calentado 0,05% de tripsina-EDTA (2 ml para T25, T75 4 ml para y 8 ml para T175 matraz) se añadió a cada matraz para cubrir la monocapa de células y se incubaron durante 1-2 minutos en un 37 ° C humidificado incubadora. </li><li> El matraz se observa bajo el microscopio para evaluar el efecto de tripsina-EDTA en el cultivo. El matraz se mantiene entonces con una mano y golpeó firmemente con la otra mano para desalojar las células de la parte inferior del matraz. </li><li> Volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se añade al matraz para saciar actividad de la tripsina. La suspensión celular se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurar la inactivación de tripsina y para lograr una sola célula homogéneasuspensión. Nota: Como alternativa, el medio suplementado con 5% de FCS se podría utilizar para apagar la actividad de la tripsina. </li><li> Para quitar no disociadas grumos, la suspensión de células se hace pasar a través de un filtro de malla 40-micras de tamaño. </li><li> La suspensión de células se centrifuga a 800 rpm (110g) durante 5 min, el sobrenadante se retiró y las células se resuspenden en un volumen apropiado de medio completo NSC. </li><li> El volumen final de la suspensión celular se ajusta de modo que la densidad celular no exceda de 2-3x10 6 -cells/ml. Alta densidad celular puede causar un bloqueo en el flujo de la citometría de flujo de la máquina. </li><li> Si a usted le gustaría aislar a las células neuronales solo en base a sus propiedades físicas, ahora se puede proceder a la clasificación FACS como se describe en la parte 4. </li><li> Antes de su clasificación, yoduro de propidio (PI, Sigma, 500 ug / ml en PBS) se añade a una concentración de 1 l / ml de suspensión celular para excluir las células muertas. </li></ol> Vivo cell inmunomarcación Para lograr una mayor pureza de las células neuronales, cosechado sola célula de la cultura NBA se pueden teñir para PSA-NCAM (un marcador de principios de progenitores neuronales inmaduras) y después las células positivas de la población neuronal se puede aislar utilizando la máquina FACS. <ol><li> Después de realizar un recuento de células, la suspensión de células individuales a partir del cultivo NBA se divide en cuatro grupos: <ul><li> Las células solas de grupo, sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (0,5-1 x 10 6 células). </li><li> Las células más PI, sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (0,5-10 x 10 6 células). PI células negativas de este grupo también se pueden clasificar según las características físicas células. </li><li> Secundaria solo (control de isotipo) grupo que también sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (1-2 x 10 6 células). </li><li> Inmunomarcaje grupo (8-10 x 10 6 células) que se tiñe para PSA-NCAM para lograrpurificación adicional de las células neuronales inmaduras. Para excluir las células muertas sobre la clasificación, el PI se añade a este grupo también. </li></ul></li><li> Para iniciar inmunomarcaje, las células se centrifugan a 800 rpm (110 g) durante 5 min. Se elimina el sobrenadante y las células se re-suspendió en 100 l de medio completo NSC. </li><li> Ficoeritrina (PE) conjugado anti-PSA-NCAM anticuerpo se añade en una proporción de 10 l / 5-10 x 10 6 células de la suspensión de células que se tiñeron para PSA-NCAM. De la misma manera, un PE ratón conjugado anticuerpo IgG1 isotipo de control se añade a la suspensión de células de control isotipo. Siga las instrucciones sobre la hoja de especificaciones anticuerpo con respecto a la concentración de anticuerpo que se utiliza. La suspensión celular se mezcla entonces suavemente y se incubaron a temperatura ambiente durante 10-15 minutos en la oscuridad. </li><li> Las suspensiones de células (PSA-NCAM y tubos control de isotipo) A continuación se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min, el sobrenadante se retira y las células son re-suspended en 1 ml de medio completo Consejo de Seguridad Nacional. </li><li> Para eliminar el exceso de anticuerpos no-acotados de las muestras, de 4 pasos se repite 2-3 veces. </li><li> Después de volver a suspender las células en un volumen apropiado de medio, yoduro de propidio (PI, Sigma, 500 ug / ml en PBS) se añade a una concentración de 1 l / ml de las suspensiones de células (células más PI, el control de isotipo y PSA- NCAM-manchado muestras) para excluir las células muertas cuando se analizaron por citometría de flujo. </li><li> 15 ml estériles tubos Falcon que contienen 1 ml de medio completo se preparan para recoger las células ordenados de poblaciones de células diferentes. </li></ol> 5. Fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de las neuronas inmaduras <ol><li> La máquina FACS se establece en función de su manual de instrucciones del usuario a través de la citometría de flujo técnico de expertos instalación. </li><li> Tampón fosfato salino (PBS) o cualquier otra solución adecuada Depending en las instrucciones del fabricante, se podría utilizar como fluido de vaina a 28 PSI a través de una boquilla 90 micras. </li><li> La presión diferencial en el sistema se ajusta de tal manera que la tasa de gatillo tipo no exceda de 2500 eventos por segundo. </li><li> La suspensión de células a partir de las células solas grupo se ejecuta a través de la máquina FACS. </li><li> En primer lugar, las células (los acontecimientos) se trazan en función de su tamaño (dispersión frontal (FSC), la luz) frente a la complejidad interna (dispersión lateral (SSC) de la luz) para distinguir las diferentes poblaciones celulares. Para ello, los parámetros de tensión para el FSC y SSC debe ajustarse de modo que las células se puede ver en la trama citometría de flujo. </li><li> Para excluir grupos de células y jubones, las células se trazan primero basado en el área de dispersión frontal (FSC-A) en función del ancho de pulso de dispersión hacia adelante (FSC-W) y la población de células sola es cerrada ya que la población 1 (P1). Luego, las células P1 se trazan sobre la base de área de dispersión lateral (SSC-A) versus dispersión lateral ancho de pulso (FSC-W) y esta vez las células individuales son gated que la población 2 (P2). Después de haber establecido estos dos puertas consecutivas, grupos o dobletes (ancho de pulso de alta del FSC y de alta anchura de pulso de cooperación Sur-Sur) están siendo excluidos. </li><li> Para excluir las células muertas o dañadas, las células individuales (P2) se trazan sobre la base de la reactividad frente al PI FSC-A y la única población de células vivas es cerrada. </li><li> Soltero células vivas se trazan sobre la base de FSC frente a SSC para distinguir las diferentes poblaciones de células basadas en el tamaño celular y la granularidad interna. En esta etapa, dos poblaciones de células principales son activados con la certificación FSC bajo la CSE baja (P3) y FSC alta CSE alta (P4), las poblaciones de células. </li><li> Para ordenar PSA-NCAM inmuno-reactiva las células neuronales inmaduras de la población del FSC bajo la CSE baja, primera baja de la población FSC cooperación Sur-Sur bajo el control de las células (además de IP y control de isotipo) los grupos se ha trazado sobre la base de inmunoreactividad PE frente a FSC-A y el negativo Las células son cerrada (P5), y luego las células positivas de PSA-NCAMgrupo de manchas son cerrada ya que la población 6 (P6). </li><li> Después de ajustar todas las puertas necesarias, las células de los intereses se clasifican en 15 ml en tubos estériles de cultivo de tejidos que contienen 1 ml de medio de NSC. </li><li> Ordenar las células se centrifugan a 1200 rpm (240 g) durante 5 min. </li><li> El sobrenadante se desecha y el sedimento se resuspendió en un volumen apropiado de medio (dependiendo del tamaño de pellets) y un recuento de células se lleva a cabo. </li><li> Las células se cultivaron entonces en poli-L-ornitina revestidos placas de 96 pocillos a una densidad de 20-30 x 10 3 células / pocillo en 200-250 l de medio completo NSC con 5% de FCS y 20 ng / ml humana recombinante BMP4 5 . </li></ol> Nota: para recubrir 96 pocillos, 100 l de poli-L-ornitina solución de trabajo (1,5 ml de poli-O y 8,5 ml de PBS estéril) se añade a cada pocillo y la placa se incubó en un incubador a 37 ° C durante al menos un hora. A continuación, el poli-O se elimina y cada pocillo se lavó tres veces con PBS estéril(Dejar que el PBS permanecen en el pozo durante 10 minutos cada vez). Utilizar 500 l de poli-L-ornitina solución de trabajo / bien si placas de 24 pocillos se utilizan. <ol start="14"><li> Las células se fijan en diferentes puntos temporales después de la orden usando paraformaldehído al 4% y immunostained de adecuados marcadores de células neuronales y gliales para evaluar el fenotipo de las células seleccionadas de diferentes poblaciones de células. </li></ol> 6. Los resultados representativos En el cultivo de ensayo neuroblasto diferenciación (NBA), células cultivadas en placas adjuntar al sustrato de cultivo de tejidos y crecer como una monocapa. Dependiendo de la densidad inicial de siembra de células, la cultura se convierta en una cultura del 90-95% confluentes después de 3-4 días. En esta etapa, una monocapa de células, principalmente los astrocitos pueden ser visualizados por debajo con células pequeñas y redondas progenitoras neuronales en la parte superior 4,5 (Figura 1). Después de cambiar el medio a un medio de factor de crecimiento libre, las células progenitoras neuronales empezardividiendo rápidamente y generar grupos de células inmaduras neuroblast en la parte superior de la monocapa astrocítico en 4-5 días (Figura 2). Análisis de citometría de flujo de disociar la cultura de la NBA en 4-5 días de la etapa de diferenciación, se muestran dos poblaciones de células principales, bajo el FSC y FSC CSE baja alta alta SSC basado en el tamaño celular (FSC) y granularidad interna (SSC) (Figura 3). Inmuno-fluorescencia análisis de las células ordenados demuestra que las células neuronales se encuentran principalmente en las poblaciones de bajo FSC CSE baja (con más del 75% de ellos expresan β-tubulina III), mientras que las células ordenados de la población de alto FSC cooperación Sur-Sur son en su mayoría de alta GFAP astrocitos inmunorreactivas (Figura 4). Purificación adicional de las células neuronales inmaduras hasta cerca de la homogeneidad (97%) se podría lograr con la selección positiva de PSA-NCAM células de infrarrojos de la población del FSC bajo la CSE baja (Figura3, 4). Enriquecidos células neuronales generados a partir de los aislados de NSCs E14 eminencias ratón ganglionares adquirir un fenotipo GABAérgica y expresa DARPP-32, un marcador de neuronas espinosas medias, la diferenciación (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Neuroblasto cultivo de ensayo a partir de células madre de ratón E14 neuronales en el día 4 de la etapa de proliferación. Este cultivo en monocapa se compone de células planas astrocíticos (puntas de flecha) y debajo de todo el las células progenitoras neuronales (flechas) en la parte superior. Original amplificación; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="Figura 2"/> . Figura 2 neuroblasto cultivo de ensayo a partir de células madre de ratón E14 neuronales en el día 4 de la etapa de diferenciación: un contraste de fase), B) la tinción de inmunofluorescencia. Tenga en cuenta el cúmulo de células neuronales inmaduras (flechas en A </strong&gt; y β tinción tubulina III en B) en la parte superior de la monocapa astrocítico (cabezas de flecha en una tinción, GFAP en B). Original amplificación; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="Figura 3"/> . Figura 3 parcelas representativas de clasificación: A). FSC frente a SSC plan de ordenación antes de la exclusión de dobletes y las células muertas. B, C). Ordenar las parcelas de exclusión de dobletes sobre la base de FSC y SSC ancho de pulso. D). La exclusión de las células muertas y dañadas basado en inmunoreactividad yoduro de propidio. E). FSC frente a SSC terreno después de la exclusión de dobletes y las células muertas, mostrando las dos principales poblaciones de la etiqueta como el FSC, SSC baja baja y las altas poblaciones del FSC SSC alta. F, G). Ordenar las parcelas para aislar PSA-NCAM células inmaduras de infrarrojos de la población de bajos FSC CSE baja. Micrografías de la figura 4. Representante de las células ordenadas de distintas poblaciones un día después de placas. A) FSC baja población de la CSE baja (más del 75% de estas células son las neuronas). B) FSC alta población de cooperación Sur-Sur de alto (la mayoría de estas células son los astrocitos ). C) PSA-NCAM + células ordenados de FSC baja población de la CSE baja (casi todas las células seleccionadas son las neuronas). Aumento original, de 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Clasificar las neuronas inmaduras se diferencien en neuronas GABAérgicas (A) y expresa DARPP-32 (B), un marcador de neuronas espinosas medias.

<ol><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457(2011).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li>
<li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Medicine%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La capacidad de aislar las poblaciones definidas de células neuronales (neuronas, es decir, astrocitos y oligodendrocitos) podría resolver algunos de los impedimentos asociados con la aplicación clínica de células madre neurales (NSC). En primer lugar, nos permite caracterizar completamente la población a partir de las células del donante. En segundo lugar, nos permite utilizar un tipo de célula particular, o una combinación de diferentes tipos de células con una proporción específica, dependiendo de la naturaleza o la ...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Medio Basal </td><td> Medio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC proliferación Suplementos </td><td> Suplemento Medio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina de soja </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * Los HEPES </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * Agua destilada </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Cell colador </td><td> Tamiz </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 frasco </td><td> Cultura de la cerámica </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 frasco </td><td> Cultura de la cerámica </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos </td><td> Cultura de la cerámica </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubos </td><td> Cultura de la cerámica </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Factor de crecimiento </td><td> I + D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Factor de crecimiento </td><td> I + D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Factor de crecimiento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituido en PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Anticuerpo </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-IgG1 de ratón conjugado </td><td> Isotipo del anticuerpo de control </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Factor de crecimiento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituido en PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Factor de crecimiento </td><td> I + D </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-OrnitHine </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Suplemento Media </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Anticuerpo </td><td> Dako </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III tubulina </td><td> Anticuerpo </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Para hacer el dobladillo, mezcle 1 x paquete de 10 l de MEM y 160 ml de HEPES 1M y obtener un volumen de 8,75 L con agua destilada. Ajuste el pH final de 7,4 y almacenar a 4 ° C.

el ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales usando citometría de flujo

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Las células madre neurales (NSC) puede aislarse y ampliado en gran escala, utilizando el ensayo neuroesfera y diferenciado en los tres tipos principales de células del sistema nervioso central (SNC), a saber, los astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. Estas características hacen de madre neurales y las células progenitoras de una valiosa fuente renovable de células para estudios in vitro, tales como la detección de drogas, neurotoxicología y electrofisiología y también para la terapia de reemplazo celular en muchas enfermedades neurológicas. En la práctica, sin embargo, la heterogeneidad de la progenie Consejo de Seguridad Nacional, la baja producción de neuronas y oligodendrocitos, y el predominio de los astrocitos después de la diferenciación limitan sus aplicaciones clínicas. Aquí se describe una nueva metodología para la purificación de la generación y posterior de las neuronas inmaduras de la progenie NSC murino utilizando fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de tecnología. Utilizando esta metodología, una población neuronal altamente enriquecido de células progenitoras se puede lograr el ingenioHout cualquier astrocito y la contaminación notable de buena fe Consejo de Seguridad Nacional. El procedimiento incluye la diferenciación de la progenie NSC aislaron y expandieron desde E14 eminencias ratón ganglionares utilizando el ensayo neuroesfera, seguido por aislamiento y enriquecimiento de las células neuronales inmaduras en base a sus propiedades físicas (tamaño y complejidad interna) y fluorescente utilizando la tecnología de citometría de flujo. En general, se tarda 5-7 días para generar neuroesferas y los días 6-8 de diferenciar la progenie Consejo de Seguridad Nacional y aislar altamente purificado las células neuronales inmaduras.

Este protocolo de vídeo demuestra un método novedoso para la generación y la posterior purificación de las células progenitoras neuronales de una fuente renovable de células madre neurales (NSC) en base a su físico (granularidad tamaño e interna) y las propiedades fluorescentes utilizando la tecnología de citometría de flujo.

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Las células madre neurales (NSCs) pueden aislarse y expandirse a gran escala mediante el ensayo de neuroesferas y diferenciarse en los tres tipos celulares principales de...

El objetivo de este protocolo en video es demostrar la generación y el enriquecimiento de células progenitoras neuronales a partir de progenie de células madre neurales en diferenciación, utilizando citometría de flujo. Esto se logra primero mediante el aislamiento y la expansión de células madre neurales utilizando el ensayo de neuroesferas. Las células resultantes se diferencian luego mediante un método de dos pasos denominado ensayo de neuroblastos.Finalmente, mediante citometría de flujo, se pueden identificar y separar poblaciones distintas de células basándose en sus propiedades físicas y fluorescentes. En este protocolo, presentaremos métodos novedosos tanto para la diferenciación de células madre neurales, lo que se denomina un ensayo de neuroblastos, como para la purificación de la progenie neural inmadura resultante mediante citometría de flujo. El ensayo de neuroblastos incluye una fase de proliferación, que dura aproximadamente de tres a cuatro días, y una fase de diferenciación que dura alrededor de cuatro a cinco días.En la fase de diferenciación, se forma una monocapa de células compuesta por astrocitos en la parte inferior y agrupaciones de neuronas inmaduras en la

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Este protocolo de vídeo se muestra cómo se discrimina y enumerar bona fide las células madre neurales en una población mixta de células precursoras neurales con el neuronales formadoras de colonias de células de ensayo.

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

Este video muestra el ensayo de migración de la neurosfera de células precursoras neurales, un ensayo in vitro para estudiar la respuesta migratoria de las células precursoras neurales de la neurosfera, a través de un análisis microscópico.

Ensayo de la neurosfera NPC: un ensayo in vitro para evaluar la respuesta migratoria de las células precursoras neurales de la neurosfera

Proporcionamos una descripción detallada de un protocolo para el análisis de citometría de flujo de antígenos de superficie y/o antígenos intracelulares en tipos de células neuronales. Se explican los aspectos críticos de la planificación experimental, los procedimientos metodológicos paso a paso y los principios fundamentales de la citometría de flujo para permitir a los neurobiólogos explotar esta poderosa tecnología.

Citometría de Flujo Protocolos de superficie y intracelular de antígenos Los análisis de los tipos de células neuronales

Las células madre neurales (NSC) se refieren a células que pueden auto-renovarse y diferenciarse en los tres linajes neuronales. A continuación, se describe un protocolo para determinar la frecuencia NSC en una población celular dada usando neurosphere formación y diferenciación en condiciones clonales.

Enumeración de células madre neurales Usando ensayos clonales

Se presenta un protocolo de investigación eficiente para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación astroglial en células de glioblastoma (GSCs). El ensayo se basa en un reportero de la diferenciación de células madre por el que la expresión de la GFP mejorada (eGFP) es conducida por el promotor humano de GFAP.

Detección sistema para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación celular de células de Glioblastoma de drogas basados en citometría flujo

Desarrollo neurológico procesos como proliferación, migración y consecuencia del neurite son a menudo perturbados en enfermedades neuropsiquiátricas. Así, presentamos protocolos evaluar rápida y reproducible estos procesos del neurodesarrollo en NPCs humanos derivado de iPSC. Estos protocolos permiten la evaluación de los efectos relevantes factores de crecimiento y terapias en desarrollo de NPC.

Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)

Aquí, demostramos el funcionamiento de un modelo de lesión mínima de la médula espinal de un ratón adulto que repuestos el nicho central canal vivienda endógeno las células madre neurales (NSC). Mostramos cómo se puede utilizar el ensayo desarrolló para cuantificar la activación y migración de NSCs definitivos y primitivo después de lesión.

Un ensayo desarrolló para evaluar la activación de células neuronales endógenos en un modelo murino de lesión medular mínima

Presentamos un método de citometría de flujo para identificar simultáneamente diferentes tipos de células recuperadas del cerebro del ratón o de la médula espinal. Este método podría ser explotado para aislar o caracterizar las poblaciones de células puras en enfermedades neurodegenerativas o para cuantificar el alcance de la orientación celular a la administración in vivo de vectores virales o nanopartículas.

Caracterización citométrica de flujo simultáneo de múltiples tipos de células recuperadas del cerebro del ratón/cordón espinal a través de diferentes métodos de homogeneización

El protocolo presentado describe un método para un ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad de compuestos de moléculas pequeñas.

Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos

Describimos el procedimiento para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en células neuronales utilizando el método de la gota colgante. Además, realizamos un análisis fenotípico exhaustivo a través de RT-qPCR, inmunofluorescencia, ARN-seq y citometría de flujo.

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Aprende a generar y purificar células progenitoras neuronales a partir de células madre neurales mediante el ensayo neuroblasto y citometría de flujo. Este protocolo permite aislar poblaciones celulares inmaduras con alta pureza.

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo (Video) | JoVE Journal

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

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