Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

El objetivo general del siguiente experimento es detectar anticuerpos contra agentes infecciosos adventicios en animales de laboratorio. Esto se logra mediante la incubación de suero de prueba con microesferas recubiertas de antígenos. A continuación, el suero se incuba con una inmunoglobulina específica de una especie biotinilada marcada, que detecta cualquier complejo inmunitario antígeno-anticuerpo.

A continuación, se añade una solución de fuerza fluorada FICO eryn marcada con estreptavidina para detectar cualquier resultado de inmunoglobulina biotinilada que muestre un estado de anticuerpos positivo o negativo para agentes comunes en roedores de laboratorio en función de la fluorescencia multiplex, la puntuación neta del inmunoensayo y los valores de muestra fluorescente. La principal ventaja de utilizar esta técnica sobre el método existente como Eliza, es que MFIA es un ensayo multiplex. Esto permite a un investigador examinar hasta cien ensayos diferentes en una sola prueba.

Bueno, esta técnica disminuye la cantidad de regiones de suero y desechables utilizados en los métodos existentes, al tiempo que aumenta la cantidad de información generada a partir de una sola prueba. Bueno, tuvimos la idea de usar este método por primera vez cuando estábamos probando una gran cantidad de muestras de sueros para múltiples agentes y queríamos reducir la mano de obra y el tiempo de prueba. La demostración del procedimiento estará a cargo de Donna Cohen, tecnóloga sénior de nuestro laboratorio. Para comenzar, tenga listos los dos tampones necesarios para el procedimiento multiplex, fluorescencia, inmunoensayo o MFIA.

El primero es un diluyente primario, que está disponible en Charles River y contiene agentes bloqueantes patentados para disminuir las interacciones inespecíficas para el tampón de lavado del ensayo. Prepare una solución de PBS con 1%BSA pH 7.4 para eliminar las partículas. Filtre el tampón a través de una unidad de tapa de botella de 0,2 micras en recipientes estériles etiquetados con tampón de lavado de ensayo.

Prepare dos concentraciones x de especies antis biotiniladas, IGG o BAG y estreptococo AVID y FICO erything o SPE, que se utilizarán para marcar los complejos de antígenos y anticuerpos formados durante la etapa de incubación del suero de prueba para preparar muestras de los siguientes materiales y desechables: micropipetas y puntas multicanal y monocanal ensambladas, y placas de microtitulación de 96 pocillos de baja unión a proteínas para la dilución de proteínas. Después de recolectar muestras de sangre y aislar el vórtice sérico, el suero brevemente antes de diluir las muestras en el diluyente primario en una placa de microtitulación de 96 pocillos para garantizar una evacuación adecuada y uniforme del pocillo antes de humedecer. Cada pocillo de la placa de prueba de 96 pocillos con tampón de lavado del ensayo aspira lentamente la solución a lo largo del ensayo.

La aspiración debe durar de cinco a 10 segundos para evitar la agregación de cordones y la compactación de los cordones en la membrana del filtro, lo que puede ralentizar los tiempos de lectura al final del ensayo. Verifique que el drenaje de líquido se haya detenido secando la parte inferior de la placa de prueba con toallas de papel. Es importante secar la placa de prueba después de cada paso de lavado para evitar que los pocillos se absorban durante la incubación.

Para preparar las cuentas, comience por vórtice la suspensión de cuentas acopladas a la culata. A continuación, sonicéalos brevemente en un baño. Es crucial volver a suspender los cordones correctamente para evitar que se agreguen grupos de cordones, lo que puede dar lugar a tiempos de lectura más largos.

A continuación, dispense la suspensión de 20 x stock a una solución de dos perlas de trabajo en el diluyente primario. A continuación, dispense 50 microlitros de la suspensión de dos cuentas en cada pocillo de ensayo de la placa de prueba prehumedecida. Pipetear 50 microlitros de cada dos x suero de prueba y control a la placa de prueba según un mapa de placa predefinido.

Asegure la tapa a la placa. Cúbralo con papel de aluminio e incube la placa de prueba durante 60 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente para evitar la evaporación de las soluciones que pueden impedir el éxito del ensayo. Mantenga la placa de prueba cubierta con la tapa de la placa durante todos los pasos de incubación.

Además, la vibración de la velocidad debe ser superior a 400, pero inferior a 700 RPM para que las perlas permanezcan en suspensión y permitan que los anticuerpos séricos accedan a todas las superficies de los antígenos acoplados. Después de lavar la placa en incubaciones secuenciales de las perlas con BAG y SPE, vuelva a lavar las muestras. A continuación, vuelva a suspender las perlas añadiendo 125 microlitros de ensayo, lave, tampee y agite durante dos minutos para leer la placa.

Colóquelo en el lector de ensayos dentro de los 10 minutos posteriores a la suspensión de las perlas, las perlas pasan una a la vez a través de un detector donde se exponen a dos láseres. Un láser excita los tintes internos que identifican el conjunto de colores de las cuentas y el otro excita el tinte reportero FICO erything. La intensidad de la fluorescencia de FICO para un número predeterminado de perlas se informa a medida que FM FI lee el primer pocillo para verificar que el panel de perlas seleccionado coincida con el perfil de perlas en los pocillos de prueba.

Si hay cuentas que caen fuera de su región de cuentas designada en la pantalla del protocolo, se ha realizado una selección de perfil incorrecta. Las perlas que se hayan resuspendido correctamente se llenarán en sus regiones especificadas como se indica en el software del lector de ensayos. Si las cuentas se agregan, llenarán sus regiones a un ritmo lento.

Puede quitar la placa de prueba del lector y volver a suspender manualmente los pocillos para separar las cuentas. Retire la placa de prueba del lector y, con un pipeteo multicanal, tridimensione cada pocillo tres o cuatro veces. A continuación, devuelva la placa de prueba al lector y continúe examinando los resultados.

Informe sobre errores como recuentos inadecuados de perlas o disminución de las puntuaciones de perlas de IgG anti IgG, y repita el ensayo para estas muestras. Después de exportar los datos a Excel y calcular el MFI neto, determine si alguno de los controles del ensayo de juego de prueba excluye el suero inmune de alto rango. Cualquier control fallido es inaceptable y el ensayo debe repetirse.

Esta tabla representa los datos para el suero de prueba y los controles de ensayo de una placa de ensayo típica. Se aprobaron todos los controles de IgG. Los resultados de las pruebas para este juego indican que numerosas muestras de control reactivo a los tejidos y de IgG fallaron, como se vio en los pocillos de naranja.

A1C uno y F1 indican un fallo reactivo tisular de TC donde la puntuación de TC se representa entre paréntesis, Wells B uno y E uno ilustran los dos tipos de fallos de control interno de IgG, anticuerpo de prueba o reactivos de prueba insuficientes, BAG o SPE respectivamente. Los resultados de la placa de prueba se interpretan solo si el control de idoneidad del sistema y el control de suero cumplen con los criterios de aceptación que se muestran aquí. Las microesferas recubiertas con inmunoglobulina sérica antiprueba específica de la especie pueden mostrar puntuaciones fallidas debido a la adición de una muestra insuficiente demasiado alta, una dilución de la muestra, especies incorrectas o suero de prueba de un huésped inmunodeficiente.

Si los resultados del ensayo de control de juego de prueba son satisfactorios, las puntuaciones individuales del ensayo se clasifican de acuerdo con lo siguiente. Siguiendo este procedimiento, debemos utilizar métodos adicionales como Eliza, IFA y/o Western blot para confirmar los hallazgos iniciales inesperados o positivos. Es crucial verificar estos resultados antes de tomar cualquier decisión de manejo animal.

Esto se puede hacer mediante el uso de diferentes metodologías en la misma muestra o muestras adicionales de la misma colonia. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el inmunoensayo métrico y fluorescente múltiple y cómo interpretar los resultados obtenidos en su instalación. Esto le permitirá reducir la mano de obra mientras recopila más información de cada pozo de muestra de prueba.