Name: Parásito inducido genéticamente Impulsado enfermedad autoinmune de Chagas en el modelo de Pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Descubre cómo la integración del ADN k de Trypanosoma cruzi en el genoma del pollo genera una enfermedad cardíaca similar al Chagas. Este modelo aviar permite estudiar la patogénesis genética de la enfermedad de Chagas en vivo.

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Estamos en deuda con Nancy R. Sturm, Departamento de Inmunología, Microbiología y Biología Molecular, Escuela David Geffen de Medicina de la Universidad de California en Los Ángeles, para la lectura crítica del manuscrito. El Consejo Nacional de Investigaciones-CNPq y la Fundación para el Desarrollo de la Investigación-FAPDF, Brasil, con el apoyo del estudio. Damos las gracias a la ayuda técnica de Alejandro O. Souza, María C. Guimaro, Ciro Cordeiro, Ana Rosa de Cassia, Alves Roseneide, y Andrade Rafael, de la Universidad de Brasilia, Brasil.

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No hay conflictos de interés declarado.

En contraste con los mamíferos susceptibles a la vida a lo largo T. cruzi, los pollos son refractarios a la T. cruzi. La ventaja principal del sistema de modelo de pollo es la eliminación de la infección temprana en el desarrollo del sistema inmune embrionario. Así, el ADN del parásito único que queda dentro del cuerpo que el pollo esté integrado en varios loci. El uso de la cantidad óptima de virulenta T. cruzi tripomastigotes para inocular huevo fértil es el paso crucial hacia la obtención de la integración de la minicircles KDNA en el genoma del embrión de pollo. La tasa de incubar pollitos en vivo a partir de huevos inoculados con 100 tripomastigotes es cuatro veces mayor que la obtenida con 500 parásitos. Se debe tener cuidado para inocular la suspensión parásitos en 10 l de medio de cultivo en la cámara de aire del huevo. No debe haber ninguna fuga de clara de huevo. Bajo condiciones óptimas, la infección parasitaria intracelular se lleva a cabo widelgada unas pocas horas después de la multiplicación de incubación y el parásito dentro de las células huésped producto durante una semana; posteriormente la infección se elimina por la inmunidad innata. La integración KDNA requiere una infección de estar, y la inoculación de minicircles desnudas en los primeros huevos de embrión de pollo no da lugar a la integración. Los embriones KDNA-positivos y los controles deben ser alojados bajo condiciones controladas a 37,5 ° C y 65% ​​de humedad. Los pollos se mantienen en jaulas de dos semanas a 33 ° C de temperatura ambiente. Posteriormente, los pollos se mantienen en jaulas suspendidas en bastidores separados por pasillos de 1,5 metros de anchura en una habitación a 22 ° C con aire filtrado y presión positiva en el agotamiento constante para asegurar condiciones de bienestar animal. Los adultos se alimentan de pollo-chow y beber agua potable corriente para lograr un crecimiento y madurez, poniendo los huevos a los cinco meses de edad. Mantenimiento de los procedimientos de higiene son esenciales para la reproducibilidad de los resultados cuando se trabaja con T. cruzi inoculadosen huevos de gallina fértiles. En el modelo de sistema de pollo de la T. cruzi son erradicadas tras el desarrollo del sistema inmune en el período inicial de crecimiento del embrión. Además de ser libre de infección, los polluelos que salen de T. cruzi inocularon huevos, en la falta de anticuerpos específicos, son tolerantes a los antígenos del parásito. El rechazo de las células diana del corazón por linfocitos citotóxicos (unidad mínima rechazo, Figura 3) se ve en los pollos KDNA-mutados que muestran modificaciones genotipo y de la descomposición de la vigilancia inmunológica 3. Los genotípicamente células T modificadas presentan rechazo acelerado de los tejidos auto en el cuerpo. El sitio de la lesión principal es el corazón, que es un sello distintivo de la enfermedad de Chagas. El paso de una fisiológica (vigilancia) a un estado fisiopatológico se ve en el pollo KDNA-mutado mostrando clonalmente proliferación de los linfocitos citotóxicos 3. Tsu sistema modelo transkingdom muestra un parásito inducida, genéticamente impulsada enfermedad autoinmune (Figura 6), derivado de modificaciones del genoma de la T. cruzi KDNA minicircle integraciones. Estas modificaciones no se ven en pollitos salidos de huevos inoculados Lb. Este fenómeno sugiere que el tratamiento experimental de la miocardiopatía inflamatoria autoinmune en perfiles de bandas de pollos mutantes pueden exigir la supresión de la droga de las células progenitoras de médula ósea de células T específicas fenotipo infiltrarse en el miocardio, y el trasplante de médula ósea sana histocompatible para prevenir el rechazo de uno mismo-tejido.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Taq polimerasa de ADN recombinante </td><td> Invitrogen </td><td> 11615-010 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq DNA Polimerasa </td><td> Invitrogen </td><td> 10966-030 </td><td></td></tr><tr><td> Los cebadores de ADN al azar un sistema de etiquetado </td><td> Invitrogen </td><td> 18187-013 </td><td></td></tr><tr><td> Eco RI </td><td> Invitrogen </td><td> 15202-021 </td><td></td></tr><tr><td> Mbo I </td><td> Invitrogen </td><td> 15248-016 </td><td></td></tr><tr><td> Juego de dNTP, Soluciones de 100mm </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 28-4065-51 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham Hybond - N + - Cat. n. </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN303B </td><td></td></tr><tr><td> PlasmidPrep mini kit de Giro </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9042-70 </td><td></td></tr><tr><td> NsiI </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R5884 1Ku </td><td></td></tr><tr><td> ADN, sal sódica esperma de peces </td><td> AMRESCO </td><td> 0644-10G </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-pollo de Bu-1b </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8370-02 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse anti-CD45 de pollo </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8270-08 </td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-pollo TCRγδ </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8230-08 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-pollo CD8α </td><td> SouthernBiotech </td><td> 9220-02 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-pollo de monocitos / macrófagos </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8420-02 </td><td></td></tr><tr><td> MyCycle termociclador </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 580BR 5501 </td><td></td></tr></tbody></table>

parásito inducido genéticamente impulsado enfermedad autoinmune de chagas en el modelo de pollo

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Las infecciones por Trypanosoma cruzi agudas adquiridas en la infancia y la niñez parecen asintomática, pero aproximadamente un tercio de los casos con infección crónica muestran la enfermedad de Chagas hasta tres décadas o más tarde. Autoinmunidad y la persistencia del parásito son las teorías que compiten para explicar la patogenia de la enfermedad de Chagas 1, 2. Para los roles desempeñados por separado la persistencia del parásito y la autoinmunidad en la enfermedad de Chagas que inocular a la T. cruzi en la cámara de aire de los huevos fertilizados. El sistema de pollo inmune madura es una barrera fuerte biológica contra T. cruzi y la infección está erradicada en el desarrollo de su sistema inmunológico por el final de la primera semana de crecimiento del 3. Los polluelos son libres de parásitos en la trama, pero conservan integrada del parásito mitocondrial ADN del cinetoplasto (kDNA) minicircle dentro de su genoma que se transmiten a su progenie. La documentación de la integración KDNA minicircle en el genoma de la gallina se obtuvo por un TargETED primer TAIL-PCR, hibridaciones Southern, la clonación y secuenciación de 3, 4. El KDNA minicircle integraciones rotura marcos de lectura abierta para la transcripción y factores del sistema inmunológico, la fosfatasa (GTPasa), adenilatociclasa y fosforilasas (PKC, el NF-kappa B activador, PI-3K) asociado con la fisiología celular, el crecimiento y la diferenciación 3, 5 - 7, y otras funciones de genes. Miocarditis grave debido al rechazo de las fibras del corazón diana por los linfocitos citotóxicos efectores se ve en los pollos kDNA mutados, mostrando una miocardiopatía inflamatoria similar a la observada en la enfermedad de Chagas humana. En particular, la insuficiencia cardíaca y la debilidad del músculo esquelético están presentes en los pollos adultos con rotura KDNA del gen de la distrofina en el cromosoma 1 8. Similares alteraciones genotípico están asociados con la destrucción del tejido realizado por efectores CD45 + y + y CD8γδ CD8α linfocitos. Así, esta infección protozoaria puede inducir la enfermedad autoinmune genéticamente accionado.

La inoculación de<em&gt; Trypanosoma cruzi</em&gt; En los huevos fértiles antes de la incubación hace que el parásito de KDNA minicircle la integración en el genoma de las células del embrión. Cruzamiento revela la transferencia vertical de las mutaciones a la descendencia. El KDNA se integra en las regiones de codificación en varios cromosomas, y los pollos mueren de una enfermedad inflamatoria autoinmune del corazón.

Parásito inducido genéticamente Impulsado enfermedad autoinmune de Chagas en el modelo de Pollo

Las infecciones agudas por Trypanosoma cruzi adquiridas en la infancia y la niñez parecen ser asintomáticas, pero aproximadamente un tercio de los casos infectados crónicamente ...

La enfermedad de Cha es la afección clínica que resulta de infecciones crónicas por el ate prot y el tno mausi. La enfermedad afecta el corazón de las personas infectadas crónicas varias décadas después de la adquisición de las infecciones. Un modelo sistémico multisistémico muestra que los huevos de gallina son permisivos para las infecciones por Taz macro cruise.Durante la primera semana de crecimiento del embrión, los experimentos muestran que los pollos libres de infección que retienen el parásito KA en sus genomas mueren de enfermedad cardíaca de Chagas; un alojamiento excelente y un suministro adecuado de alimento y agua garantizan el bienestar animal. Se obtienen masas triples y buenas formas natatorias a partir del cultivo de tejidos. Se transilumina para tio y huevos para mostrar su control de burbujas.Los huevos no reciben inoculación para. Los huevos de control simulado se inoculan con 10 microlitros de medio de cultivo. El orificio se sella con cinta adhesiva essive tape 100 viral FL mania.Los brasileños son maestros profesionales. Las cabras están inoculando la cámara de aire de huevos de gallina fertilizados con 100 unidades virales y atrapando cabras macro triple maestra en 10 microlitros de medio de calcio, que se inoculan en la cámara de aire o en huevos de gallina virtualizados. Los huevos se incuban a 37 °C y 65 % de humedad durante uno a dos días con rotación suave cada 30 minutos. Los controles se siembran por igual a partir de huevos inoculados con macro renoso y a partir de controles marcados.Las mejillas crecen hasta la vida adulta. Se toman muestras de sangre de las venas alares. La sangre se transfiere a tubos cónicos de 15 ml.Las células mononucleares se separan mediante centrifugación tras el lavado con gradiente de FICO para eliminar la capa de células blancas y desechar la separación. El ADN genómico de tamaño medio se extrae de las células mononucleares sanguíneas. Coloque tubos cónicos de 1,5 ml en tampón según el diseño de la PCR. Se realiza la PCR para amplificar G-N-A-N-G-N-A nuclear y pls GNA kg NA. Utilizando conjuntos específicos de cebadores, prepare los tubos de reacción y colóquelos en el termociclador tras la corrida.Retire los tubos del termociclador. Analice los productos de PCR. Los productos de PCR se separan mediante electroforesis en gel de agarosa.Las bandas de ADN en el gel se transfieren a una membrana de nailon con carga positiva. La hibridación se realiza con sondas específicas marcadas radiactivamente para separar los roles que desempeñan de forma independiente la persistencia del parásito y la inmunidad. En la patogénesis de la enfermedad de Chagas, utilizamos un modelo de pollo refractario a la infección por TNO cruise, excepto durante el crecimiento embrionario temprano, antes del desarrollo del sistema inmunitario; los pollitos procedentes de huevos inoculados con TNO cruise están libres de infección, pero el ADN mitocondrial del parásito A KG A se mantiene en el organismo.Solo los pollos que eclosionan de huevos inoculados con tzo macro muestran bandas de kg, ya que ningún ADN está presente en el genoma del pollo. Los pollitos que eclosionan de ex inoculados con cabras maestras de Leia brasileña no conservan las secuencias mitocondriales en círculo en sus genomas. Carril uno: carril en blanco; carril dos: control de ADN; carriles tres y cuatro: controles simulados; carriles cinco a catorce: GS de pollos eclosionados de huevos infectados de Las manías brasileñas.Carril 15: el formato del amplicón de manía de Brasil muestra una banda de 750 pares de bases obtenida con los cebadores específicos LB tres y LB cinco para conjuntos de ADNk. El análisis tipo cuadrícula de L-P-C-R-A muestra los cebadores gallus guns que se utilizaron tras tres ciclos de amplificación con aumento de temperatura en nido progresivo. La PCR se realiza con diferentes conjuntos de cebadores de ADNk.El ciclo de alta restricción de Louis crea sitios para cebado y hibridación y ciclo de alta restricción. Aumenta la especificidad de los productos de amplificación. Los productos de PCR con menor amplificación que se hibridaron con la sonda KA fueron clonados y secuenciados comercialmente.La secuencia muestra el kg NA en el círculo azul, la microhomología intermedia, el punto de recombinación amarillo y la galactosidasa GNA verde. La ubicación del kg NA integrado en el genoma del pollo se determinó mediante una técnica de PCR con cebador dirigido, conocida como PCR-RTP. Las gallinas adultas mutadas desarrollaron enfermedad cardíaca de Chagas.Cuanto más controles crecen hasta una vida saludable. Los pollos con mutación KDNA muestran un siluete cardíaco aumentado en las radiografías. La necropsia muestra que los pollos control tienen tamaño cardíaco pequeño.El Cajún, un pollo mutante, presenta hidropericardio, hidrotox y un corazón grande. La cardiomegalia es similar a la enfermedad cardíaca de Chagas. El corazón de pollo controlado por Moog muestra histología normal.El kg de un pollo mutado muestra un túnel formado en el miocardio por los linfocitos citotóxicos que destruyen las fibras cardíacas. Las secuencias de círculos aianos que se integran en regiones codificantes de varios cromosomas se revelan mediante una PCR anidada modificada que combina cebadores kg NA con conjuntos de cebadores específicos de ADN del huésped durante décadas. Los pollos mutados en el ADN mueren de insuficiencia cardíaca y presentan cardiomegalia.La patología de microscopía muestra miocarditis, una miocarditis similar a la de Chagas, que traduce el corazón. En el pollo con mutación en el gen NA, se trata de una enfermedad genéticamente determinada. Esta es la primera vez que se reproducen las manifestaciones clínicas y patológicas de la enfermedad de Chagas en un modelo limpio que cruza reinos.Gracias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el procedimiento de inyectar células cancerosas por vía intravenosa en la vasculatura de la membrana corioalantoidea del pollo para generar un modelo de metástasis de cáncer CAM. Las células inyectadas eventualmente forman colonias dispersas de células cancerosas individuales, lo que permite el estudio de la invasión del cáncer y la metástasis.

Inyección intravenosa de células cancerosas en la vasculatura de la membrana corioalantoidea de pollo: un procedimiento para establecer un modelo de cáncer de membrana corioalantoidea para estudiar la invasión y metástasis del cáncer

En este protocolo, fluorescencia etiquetada T. cruzi fueron inyectadas en larvas de pez cebra transparente y motilidad del parásito fue observada en vivo usando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

El agente Trypanosoma cruzi enfermedad de Chagas produce infecciones asintomáticas de larga duración que convertirse abruptamente en patología clínicamente reconocida. El siguiente protocolo de investigación describe un estudio epidemiológico de corto plazo basado en la familia para desentrañar la infección de T. cruzi transmitida sexual de los padres a la progenie.

Transmisión sexual de tripanosomas americanos de machos y hembras a compañeros de ingenua

El carcinoma metastásico de células renales de células claras es una enfermedad sin un modelo animal completo para una investigación preclínica exhaustiva. Este protocolo ilustra dos nuevos modelos animales para la enfermedad: el modelo de ratón implantado ortopédicamente y el modelo de membrana corioalantoica de pollo, que demuestran metástasis pulmonar similar a los casos clínicos.

Comparación de metastática célula sin fin renal Modelo establecido en el riñón del ratón y en la membrana chorioalantoica del pollo

Aquí, proporcionamos un método para lograr la transfección estable de parásitos de pollo Eimeria mediante la nucleofectación de esporozoitos o merozoites de segunda generación. Los parásitos eimerianos modificados genéticamente que expresen genes antigénicos hetrólogos podrían utilizarse como vehículos de administración de vacunas.

Nucleofección y Propagación In Vivo de Parásitos de La Eimeria de Pollo

Presentamos el modelo de membrana corioalantoica de pollo como un modelo alternativo, trasplantable, in vivo para el injerto de líneas celulares de cáncer ginecológico y urológico y tumores derivados del paciente.

Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

Los embriones de pollo, como modelo de desarrollo clásico, se utilizan en nuestro laboratorio para evaluar las cardiotoxicidades del desarrollo después de la exposición a diversos contaminantes ambientales. Los métodos de exposición y los métodos de evaluación morfológica/funcional establecidos se describen en este manuscrito.

Uso del embrión de pollo como una herramienta poderosa en la evaluación de cardiotoxicidades del desarrollo

Describimos un ensayo colorimétrico de alto rendimiento que mide la actividad de la β-galactosidasa en tres etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas. Este ensayo se puede utilizar para identificar compuestos tripanocidas de una manera fácil, rápida y reproducible.

In vitro Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa

El protocolo proporcionado aquí describe los pasos detallados para realizar estudios de eficacia de fármacos en un modelo bioluminiscente de infección por Trypanosoma cruzi , con un enfoque en la adquisición, análisis e interpretación de datos. También se proporcionan procedimientos de solución de problemas y control de calidad para minimizar los problemas técnicos.

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Este video muestra la forma de inducir hipofisitis autoinmune en ratones SJL y la forma de evaluar su gravedad por la histopatología.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Descubre cómo la integración del ADN k de Trypanosoma cruzi en el genoma del pollo genera una enfermedad cardíaca similar al Chagas. Este modelo aviar permite estudiar la patogénesis genética de la enfermedad de Chagas en vivo.

Parásito inducido genéticamente Impulsado enfermedad autoinmune de Chagas en el modelo de Pollo

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