La detección de la aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes con neoplasia hematológica maligna, mediante el uso de la tecnología de flujo lateral

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso de un dispositivo de flujo lateral para la detección rápida del antígeno diagnóstico de Aspergillus en suero humano y en muestras de lavado broncoalveolar (BAL). Esto se logra primero aplicando la muestra de suero o BAL en el puerto de liberación del dispositivo de flujo lateral. El segundo paso consiste en permitir que la solución migre a lo largo de la membrana.

El siguiente paso consiste en determinar si la prueba es válida mediante el examen de la línea de control interno. El paso final es interpretar el resultado de la prueba examinando la línea de prueba. En última instancia, el dispositivo de flujo lateral se utiliza para detectar la presencia del antígeno diagnóstico de Aspergillus en suero o en líquidos de lavado broncoalveolar (BAL).

La prueba de flujo lateral para aspergillus puede utilizarse como una prueba complementaria para el diagnóstico de aspergilosis pulmonar invasiva. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el inmunoensayo enzimático para galactomanano de aspergillus, la prueba de beta-glucano panfúngica, la prueba de fondo ocular y la prueba de PCR para aspergillus, es que se trata de una prueba diagnóstica rápida realizada en el lugar de atención que requiere instalaciones de laboratorio y capacitación mínimas. Aunque la prueba de flujo lateral ha sido desarrollada para la detección de especies de aspergillus, la tecnología de flujo lateral también puede aplicarse a la detección de otros patógenos infecciosos, como especies de cetosporium, fusarium y riser.

Al incorporar anticuerpos monoclonales específicos para estos organismos, la demostración visual de este método es fundamental. Dado que la interpretación de los resultados de la prueba de flujo lateral requiere familiaridad con el formato del ensayo, para obtener suero a partir de muestras de sangre no tratadas, permita que la sangre se coagule a cuatro grados Celsius. El suero y los lavados broncoalveolares, o fluidos BAL, deben almacenarse en alícuotas a menos veinte grados Celsius antes de su uso; el almacenamiento en alícuotas limita el potencial de degradación del antígeno diana debido a ciclos repetidos de congelación y descongelación durante pruebas repetidas. Para preparar las muestras de suero y BAL para su análisis, descongele las muestras a temperatura ambiente y luego manténgalas sobre hielo. Mezcle bien mediante vortex y luego centrifugue durante un minuto a 14.000 RPM. Para pruebas rutinarias de muestras humanas, diluya el suero uno a uno con medio de cultivo de tejidos; alternativamente, para disociar el antígeno diana de los complejos inmunes séricos, diluya el suero uno a dos con PBS que contenga 4% EDTA, caliente durante tres minutos en un baño de agua hirviendo y centrifugue durante cinco minutos a 14.000 RPM.

Los fluidos de lavado broncoalveolar humanos no requieren pretratamientos. Una muestra de lavado broncoalveolar ha sido descongelada, agitada mediante vortex y centrifugada, y es una muestra limpia que puede aplicarse directamente al dispositivo de flujo lateral. Para su uso, los dispositivos de fluo lateral, o LFD, se almacenan a temperatura ambiente o 23 grados Celsius, temperatura a la cual permanecen estables durante 12 meses.

Para comenzar el ensayo, retire los dispositivos de sus envoltorios y colóquelos sobre una superficie nivelada. Utilizando una punta de pipeta estéril, aplique 100 microlitros de suero pretratado en el puerto de liberación del dispositivo en cuestión de segundos. El líquido debe migrar por acción capilar a lo largo de la membrana de celulosa nítrica en la ventana de observación.

De la misma manera, aplique 100 microlitros de una muestra de BAL pura en el puerto de liberación del dispositivo. Permita que el ensayo se desarrolle durante 15 minutos a temperatura ambiente, momento en el cual se deben registrar los resultados de la prueba. La prueba no debe dejarse más de 15 minutos antes de registrar los resultados.

Dado que esto podría sesgar la interpretación de los resultados, una reacción débil no se verá potenciada al prolongar el período de incubación. La prueba de flujo lateral consta de una línea de control interno indicada con la letra C en la carcasa de plástico y una línea de prueba indicada con la letra T. La línea de control siempre debe aparecer independientemente de la presencia del antígeno de aspergillus en la muestra de suero o de lavado broncoalveolar (BAL). Esto indica que la prueba ha funcionado correctamente si el antígeno de aspergillus está presente en la muestra de suero o de BAL.

La línea de prueba también aparecerá dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de la muestra. Las intensidades de la prueba, las reacciones de Lyme, son proporcionales a las concentraciones del antígeno diana en las muestras de suero y VAL. El aspecto más complicado de este procedimiento es la interpretación de los resultados de la prueba.

Los resultados de la LFD deben leerse a los 15 minutos y compararse con el ejemplo representativo mostrado aquí. En esta figura se muestran ejemplos representativos de resultados LFD débil positivo, moderadamente positivo y fuertemente positivo con muestras de LBA y suero. Cualquier línea de prueba positiva en la muestra de suero, independientemente de su intensidad, indicaría aspergilosis pulmonar invasiva o enfermedad IPA debido a la presencia de antígeno de Aspergillus circulante en el torrente sanguíneo. Las reacciones positivas en LBA, independientemente de su intensidad, indicarían germinación de esporas y desarrollo de hifas potencialmente patógenas en los pulmones.

En ausencia del antígeno de aspergillus, no aparecerá ninguna línea de prueba y el resultado se registra como negativo. Esta tabla muestra los resultados de las pruebas de LFD utilizando líquidos de lavado broncoalveolar de pacientes con leucemia mieloide aguda o con leucemia ML diagnosticados según los criterios diagnósticos del Grupo de Estudio de la Organización Europea para la Investigación y el Tratamiento del Cáncer y del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. En esta tabla se incluyen los datos clínicos y psicológicos correspondientes, así como los resultados de una prueba de PCR específica para ASPERIA en cada paciente.

Según las directrices E-O-R-T-C-M-S-G de 2002, a los pacientes 12, 13 y 16 se les diagnosticó una IPA posible con base en factores del huésped y criterios clínicos o positividad para GM. De acuerdo con las directrices revisadas de E-O-R-T-C-M-S-G de 2008, los factores del huésped y la positividad para GM por sí solos, o los factores del huésped y los criterios clínicos por sí solos, no indicarían una infección fúngica invasora posible a menos que se acompañen de evidencia de apoyo proveniente de datos clínicos y micología, respectivamente. Al paciente seis se le diagnosticó una IPA probable según ambas directrices de 2002 y 2008 debido a factores del huésped, características clínicas mayores y menores, y positividad para GM.

Finalmente, tenga en cuenta que, si bien ni el ensayo LFD ni el ensayo PCR se incluyen actualmente en las guías E-O-R-T-C-M-S-G en las muestras de LBA de los pacientes seis y doce, existe un fuerte acuerdo entre ambos ensayos y la prueba comercial de gala manina que indica la presencia de antígeno y ácido nucleico de aspergillus tras seguir este procedimiento. Otros métodos como el ensayo enzimático de pella galactomanano, panf, la prueba de beta-glucano fúngico o las pruebas de PCR para aspergillus pueden realizarse en paralelo para confirmar la enfermedad fúngica invasiva. No olvide que trabajar con suero sanguíneo humano y líquidos de LBA puede ser extremadamente peligroso y que los operadores del dispositivo siempre deben estar vacunados contra enfermedades como la hepatitis B y la tuberculosis.I.