Name: El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende a aislar células madre hematopoyéticas murinas mediante enriquecimiento magnético de células c-Kit+ y citometría de flujo. Este método permite obtener progenitores altamente purificados para estudios funcionales in vitro e in vivo.

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Damos las gracias a Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa y Manz Markus de preciosos consejos. Este trabajo fue financiado por la Swiss National Science Foundation, la Liga Suiza contra el Cáncer y la Fundación per la Ricerca Ticinese sul Cancro.

1. Preparación de la suspensión de la célula de la médula ósea <ol><li> Practicar la eutanasia con el ratón y colocar al animal en una sartén inoxidable y el etanol de pulverización 70% sobre su abdomen y la espalda. Recoger fémur y la tibia de las patas traseras, y la columna vertebral. </li><li> Con precisión todos los residuos de los tejidos blandos de la columna vertebral con unas tijeras de punta afilados y de los huesos de las piernas con una gasa. Huesos en tienda a un tubo Falcon de 50 ml con 30 ml de medio RPMI que contenía 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), suplementado con 50 mM β-mercaptoetanol, 100 uM MEM no aminoácidos esenciales, 1 mM de piruvato sódico MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina y penicilina 100 U / ml. </li><li> Cubrir el fondo de un mortero previamente esterilizado con filtros estériles. </li><li> Transferencia de los huesos en el mortero y los cubren con una capa de filtros con el fin de montar una superficie de fricción. </li><li> Preparar un tubo Falcon de 50 ml provisto de un filtro de Falcon. </li><li> Rompe los huesoscon la ayuda de una mano de mortero hasta obtener una suspensión celular homogénea. </li><li> Transferir la suspensión en el tubo. </li><li> Añadir al mortero 5 ml de medio RPMI completo fresco para lavar y recoger las células restantes. </li><li> Repita los dos últimos puntos hasta que los huesos homogeneizados parece clara. </li><li> Transferir y filtrar en un tubo nuevo la suspensión de células a fin de eliminar los restos de tejido restante. </li><li> Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento celular. </li></ol> 2. El análisis fenotípico <ol><li> Resuspender y lavar las células de ratones individuales en 15 ml de PBS y FBS al 2%. </li><li> Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento. </li><li> Suspender el precipitado en 5 ml de PBS y 2% de FBS y cuentan las células. </li><li> Transferencia de 1 × 10 6 células / pocillo en un fondo de 96 pozos de todo elplato. </li><li> Centrifugar la placa a 1.500 rpm durante 5 min. </li><li> Preparar una mezcla de mAbs dirigidos contra los siguientes marcadores de superficie. Diluir como se indica en PBS y 2% de FBS para teñir las células. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugados con PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit conjugado a APC 1:100 </li><li> Conjugado con biotina 1:50 Sca1 </li><li> Conjugado con FITC 1:50 CD34 </li><li> FcγR conjugado a PE 1:100 </li><li> La IL-7R conjugado con PE-Cy7 1:100 </li></ul></li><li> Se desecha el sobrenadante y se añaden 50 l de mezcla mAbs a cada pocillo. Se disocian en células individuales con la pipeta. </li><li> Se incuban las células durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar las células dos veces con 150 l de PBS y 2% de FBS. </li><li> Centrifugar la placa a 1.500 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante invirtiendo la placa. </li><li> Diluir estreptavidina en PBS y 2% de FBS, como se indica para teñir las células. <ul type="disc"><li> Estreptavidina conjugadacerrada a APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Añadir 50 l de la solución a cada pocillo. Se disocian en suspensión de células individuales con la pipeta. </li><li> Se incuban las células durante 10 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar las células dos veces con 150 l de PBS y 2% de FBS. </li><li> Centrifugar la placa a 1.500 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 100 l de PBS y FBS al 2%. </li><li> Adquirir muestras en FACS. </li></ol> 3. Enriquecimiento magnética de c-Kit + en las células <ol><li> Preparar una solución tampón que contenía PBS, pH 7,2, 0,5% albúmina de suero bovino (BSA), y 2 mM de EDTA. </li><li> Resuspender el sedimento celular del hueso médulas derivado de al menos 10 ratones en 1 ml de solución tampón que contiene c-Kit conjugado a APC AcMo diluido 1:50. </li><li> Se incuban las células durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar dos veces las células con 40 ml de solución tampón. </li><li> Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado tque sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento. </li><li> Resuspender pellet de células y se añaden 50 l de anti-APC MicroBeads para cada ratón sacrificados directamente a la pastilla. </li><li> Mezclar bien e incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 40 ml de solución tampón y se centrifuga a 1.500 rpm durante 5 min. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Resuspender el sedimento celular en múltiplo de 4 ml de solución tampón cada tres ratones sacrificados. </li><li> MACS Place columnas LS en el campo magnético de un separador MACS adecuado. Utilice una columna de cada tres ratones sacrificados. </li><li> Preparar las columnas de un enjuague con 4 ml de solución tampón. </li><li> Aplicar suspensión celular en las columnas. </li><li> Recoger las células no marcadas que pasan a través y lavar la columna con 4 ml de solución tampón. Realizar pasos de lavado mediante la adición de 4 ml de solución tampón de tres veces. Añadir nuevo buffer cuando el depósito se vacía en la columna. </li><li> Quitar columnas del separador y place cada uno en la parte superior de 15 mL tubos Falcon. </li><li> Pipetear 4 ml de solución tampón en cada columna. Inmediatamente enjuagar las células marcadas magnéticamente, empujando el émbolo en la columna. </li><li> Centrifugar los tubos a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. </li><li> Resuspender cada pellet con 1 ml de solución tampón y pellets de grupo en un solo tubo de 15 ml de halcón. </li></ol> 4. Clasificación de las células madre hematopoyéticas y Lineage Progenitores comprometidos <ol><li> Preparar una mezcla de mAbs dirigidos contra los siguientes marcadores de superficie. Diluir como se indica en 500 l de PBS y FBS al 2% para teñir las células. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugados con PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit conjugado a APC 1:100 </li><li> Sca-1 conjugado con biotina 1:50 </li><li> Conjugado con FITC 1:50 CD34 </li><li> FcγR conjugado a PE 1:100 </li></ul></li><li> Centrifugar el tubo de la previous la sección a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. </li><li> Añadir la mezcla de mAb a la pastilla. Se disocian en suspensión de células individuales con la pipeta. </li><li> Se incuban las células durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar dos veces las células con 14 ml de PBS y FBS al 2%. </li><li> Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Diluir estreptavidina como se indica en 500 l de PBS y 2% de FBS para teñir las células. <ul type="disc"><li> Estreptavidina conjugada con APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Añadir la solución al tubo. Se disocian en suspensión de células individuales con la pipeta. </li><li> Se incuban las células durante 10 minutos en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Lavar dos veces las células con 14 ml de PBS y 2% de FBS. </li><li> Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 500 l de PBS y FBS al 2%. </li><li> Transferir y filtrar la suspensión de células en un tubo nuevo ml 5 con el fin de Eliminate agregados celulares que pueden interferir con el proceso de selección. </li><li> Añadir 5 l de 7-AAD (utilizarlo diluido 1:100) a la suspensión celular con el fin de excluir 7-AAD + las células muertas de las poblaciones ordenados. </li><li> Clasificar las células con un FACSAria BD de acuerdo con los siguientes fenotipos: <ul type="disc"><li> LKS células: LIN - c-Kit + Sca-1 + </li><li> LT-HSC: LKS CD34 - </li><li> ST-HSC: LKS CD34 + </li><li> BPM: Lin - c-Kit + Sca-1 baja FcγR alta CD34 + </li><li> Diputados al Parlamento Europeo: Lin - c-Kit + Sca-1 baja FcγR baja CD34 - </li><li> CMP: Lin - c-Kit + Sca-1 baja FcγR baja CD34 + </li></ul></li></ol> 5. Los resultados representativos La figura 1 muestra y el ejemplo del procedimiento de puerta electrónica apuntuación progenitores linfoides comunes (CLPS) como Lin - / c-Kit altas / interleuquina (IL)-7R + en las células; Lin - / c-kit + / Sca-1 + (LKS) y Lin - / c-Kit + / Sca -1 LO (c-Kit +) las células, desde el c-Kit + puerta, comunes progenitores mieloides (CMPS) se identifican como FcγR lociones células CD34 +, progenitores de granulocitos / monocitos (BPF), FcγR hi células CD34 + y megacariocitos / progenitores de eritrocitos (los diputados) como FcγR he CD34-células, desde la puerta de LKS, LT y ST-HSC HSC-se identifican como CD34 - y CD34 + en las células, respectivamente. Esta suspensión celular de médula ósea puede ser enriquecido para c-Kit + en las células con perlas magnéticas (Fig. 2); LT-HSC y ST-HSC puede ser clasificado de acuerdo a la expresión CD34, así como otros progenitores de acuerdo con el fenotipo descrito anteriormente. HSC puede ser ana<html> lyzed en microscopía confocal de imágenes en vivo como se muestra en la Figura 4, donde CD34 - células se tiñeron con el compuesto de unión a nucleótidos quinacrina 11, así como nuclear rojo (DRAQ5). En CMH, pero no BPF, quinacrina-positivas vesículas son visibles en el citoplasma 12. Además, las CMH ordenados puede ser utilizado en los experimentos funcionales como se demuestra en la figura 5, que muestra el aumento de Ca 2 + citosólico en LT-HSC por la activación de los receptores purinérgicos P2 a la exposición a la adenosina-trifosfato (ATP) y ionomicina 12. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> Figura 1. Representante de análisis gráfico de puntos de Lin-BM células. Procedimiento de puerta electrónica en citómetro de flujo para identificar y anotar progenitores hematopoyéticos y HSCs de suspensión de células de médula ósea tiñeron como se describe en el texto del protocolo. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Un esquema de enriquecimiento selectivo de c-Kit + en las células de la médula ósea. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> Figura 3 Análisis del ciclo celular de la electrónica LKS cerradas CD34 -. CMH en los controles sanos y ratones con EII teñidas con anticuerpos Ki-67 y DAPI. Las células fueron fijadas y permeabilized con Lyse / Fijar y Perm tampones seguido de tinción con FITC conjugado con Ki-67 y DAPI a 1 mg / ml. Ciclo de las células apenas si es perceptible en el LKS CD34 - compartimiento de CMH de los controles sanos 12. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . Figura 4 en vivo de imágenes de microscopía confocal de la FACS ordenados CD34 - CMH y las BPF manchados con la quinacrina compuesto de nucleótidos vinculante y nucleares rojo (DRAQ5). Los cuadrantes pequeños muestran pos quinacrinavesículas itive detectado en el citoplasma de las CMH, pero BPM no. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> Figura 5. Citosólica de Ca 2 + elevaciones de la CMH ordenados cargados con Fura-2 y estimuladas con ATP y ionomicina. Trazas de células individuales se muestran. Todas las células fueron sensibles a ATP extracelular que muestran un aumento importante en Ca 2 + citosólico tras la adición de ATP.

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<li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine%2Fparacrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts%3A+contribution+of+vesicular+ATP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li>
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<li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li>
<li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método aquí descrito permite el análisis rápido y preciso de la hematopoyesis en ratones individuales (Figura 1). Este análisis en diversos parámetros experimentales, incluidos los modelos murinos de inflamación, autoinmunidad, inmunodeficiencia, enfermedades degenerativas, trastornos metabólicos y el cáncer, permite abordar el impacto de las condiciones patológicas en la hematopoyesis. La Figura 3 muestra el análisis de la actividad de las células en el ciclo de LKS electrónicamente...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM AANE 100X </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Filtro de la célula 40 micras </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD Solución colorante </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / Fix tampón </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> Perm tampón III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBioscicia </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC MicroBeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> Columnas LS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

el análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos lineage

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

La médula ósea es el lugar principal donde las CMH y más maduras las células sanguíneas progenitoras de linaje residen y se diferencian en un organismo adulto. CMH constituyen una población de células minuto de células pluripotentes, capaces de generar todos los linajes de células sanguíneas para un tiempo de vida 1. La disección molecular de la homeostasis del CMH en la médula ósea tiene implicaciones importantes en la hematopoyesis, oncología y medicina regenerativa. Se describe el protocolo de etiquetado con anticuerpos fluorescentes y el procedimiento de puerta electrónica en citometría de flujo para anotar subconjuntos progenitoras hematopoyéticas y distribución HSCs en ratones individuales (Fig. 1). Además, se describe un método para enriquecer ampliamente progenitores hematopoyéticos, así como a largo plazo (LT) ya corto plazo (ST) la reconstitución de HSCs agrupados de suspensiones de células de médula ósea por enriquecimiento magnética de las células que expresan c-kit. La preparación de células resultante se puede utilizar para ordenar los subconjuntos seleccionados para in vitro een estudios in vivo funcionales (fig. 2). Tanto los osteoblastos trabeculares 2,3 y 4 endotelio sinusoidal constituyen nichos funcionales de apoyo CMH en la médula ósea. Hay varios mecanismos que en el nicho de los osteoblastos, como un subconjunto de N-cadherina + 3 osteoblastos y la interacción de la Tie2 tirosina quinasa del receptor se expresa en las CMH con su angiopoyetina-1 ligando 5 de acuerdo en la determinación de la quietud CMH. &quot;Hibernación&quot; en la médula ósea es crucial para proteger a las HSCs de replicación y eventual agotamiento en la actividad un ciclo excesivo 6. Estímulos exógenos que actúan sobre las células del sistema inmune innato como ligandos de los receptores Toll-like 7 y el interferón-alfa 6 también se puede inducir la proliferación y diferenciación de las CEH en el linaje de los progenitores comprometidos. Recientemente, una población de HSC de ratón latentes dentro de la lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - la población ha sido descrito 8. Clasificación de las células CD34 sobre la base de expresión de la suspensión de células hematopoyéticas progenitoras enriquecido como se ha descrito aquí permite el aislamiento de ambos quiescente autorrenovación LT-HSC y ST-CMH 9. Un procedimiento similar basado en el agotamiento de linaje de células positivas y la clasificación de LT-HSC con CD48 y Flk2 anticuerpos ha sido descrita previamente 10. En el presente informe se proporciona un protocolo para la caracterización fenotípica y ex vivo de células análisis del ciclo de progenitores hematopoyéticos, que pueden ser útiles para el seguimiento de la hematopoyesis en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Además, se describe un FACS sorting procedimiento para CMH, que pueden ser utilizados para definir los factores y mecanismos que regulan su auto-renovación, expansión y diferenciación en la biología celular y ensayos de transducción de señales, así como para el trasplante.

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

La médula ósea es el sitio principal donde las HSC y los progenitores de linajes de células sanguíneas más maduras residen y se diferencian en un organismo adulto. Las HSC...

Este video demuestra un protocolo para el aislamiento y la caracterización fenotípica de progenitores hematopoyéticos mediante separación basada en microperlas magnéticas y selección de células activada por fluorescencia. Primero, se disecan la pata trasera, el fémur, la tibia y la médula espinal de un ratón y se homogenizan para generar una suspensión de células de médula ósea. Luego, la población se enriquece para células que expresan C kit utilizando flujo de microperlas magnéticas.El análisis citométrico de la población enriquecida demuestra que este método produce células sanguíneas altamente purificadas, progenitores y células madre hematopoyéticas, que luego pueden utilizarse para estudios funcionales in vitro e in vivo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el lavado óseo es que permite una recuperación más eficiente y rápida de las células de la médula ósea. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de inflamación, autoinmunidad, inmunodeficiencias, enfermedades degenerativas, trastornos metabólicos y modelos inmunes del cáncer, ya que permite la caracterización fenotípica y el análisis funcional ex vivo de los progenitores hematopoyéticos.Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el monitoreo de la hematopoyesis en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. También puede utilizarse para estudiar la transacción de señales en biología celular y la expresión génica regulada durante el desarrollo en subpoblaciones distintas de progenitores. Comience colocando un ratón sacrificado en una bandeja de acero inoxidable.Rocíe el abdomen y la espalda con etanol al 70 % para recoger los huesos que se utilizarán como fuente de células. Use tijeras para hacer dos pequeñas aberturas en la piel de las patas traseras; con ayuda de pinzas, desloque el fémur, luego gire al ratón boca abajo y corte la piel longitudinalmente. Para exponer la columna vertebral, retire la columna vertebral.Luego, utilizando tijeras de punta fina, retire cuidadosamente todos los restos de tejido blando de la columna vertebral. Use gasa para eliminar los restos de tejido blando del fémur y la tibia.Luego, coloque los huesos en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de medio RPMI suplementado. Coloque varios filtros estériles de cuatro quintos en un mortero estéril. Luego, utilizando pinzas, transfiera los huesos al mortero y cúbralos con otra capa de filtros para armar una superficie de fricción.A continuación, coloque un filtro de malla de 40 micrones en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, utilizando un pistilo, triture los huesos hasta obtener una suspensión celular homogénea. Y usando una pipeta, transfiera la suspensión al filtro celular.A continuación, agregue cinco mililitros de RPMI suplementado fresco al mortero para lavar y recolectar las células restantes, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, añada el RPMI al tubo con el filtro. Repita los dos últimos pasos hasta que los huesos homogenizados aparezcan claros.Una vez que la solución haya pasado a través del filtro, transfiérala a un nuevo tubo de 50 mililitros y filtre, repitiendo el proceso para eliminar los restos de tejido residuales. Centrifugue el tubo a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y retire cuidadosamente el sobrenadante mediante aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento celular.El siguiente paso del procedimiento consiste en caracterizar los fenotipos de los progenitores hematopoyéticos. Comience por resuspender el paladar celular de cada ratón en 15 mililitros de PBS y FBS al 2%. Luego, centrifugue el tubo a 500 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.No perturbe el pellet. Reese suspende el pellet en cinco mililitros de PBS y 2% FBS y cuenta las células utilizando un hemocitómetro. Una vez que se ha determinado la concentración celular, transfiera 1x10⁶ células a cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos.Luego, centrifugue la placa a 500 veces G durante cinco minutos. Durante la centrifugación, prepare una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores de superficie enumerados aquí en PBS y 2% de FBS para teñir las células. Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante invirtiendo la placa y agregue 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos a cada pocillo.Luego, utilizando un pipetador multicanal, pipetee hacia arriba y hacia abajo para disociar en suspensiones de células individuales. Incube las células durante 20 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius; tras la incubación, lave las células dos veces con 150 microlitros de PBS y 2% de FBS. A continuación, centrifugue la placa a 500 × g durante cinco minutos.Luego, deseche la senna invirtiendo la placa. A continuación, agregue 50 microlitros de streptavidina AP tres tamaño siete diluida uno a 300 en PBS con 2% de FBS a cada pocillo y disocie en una suspensión de células individuales mediante pipeteo. Incube las células durante 10 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius tras la incubación.Lave las células dos veces con 150 microlitros de PBS y FBS al 2 %. Después de centrifugar la placa para obtener el sobrenadante S, deseche este y re suspenda las células en 100 microlitros de PBS y FBS al 2 %. Analice las muestras mediante citometría. A continuación, para clasificar subpoblaciones seleccionadas de células hematopoyéticas, se realiza un enriquecimiento magnético en médula ósea para enriquecer las células positivas para secret. Re suspenda el pellet celular de médulas óseas derivadas de al menos 10 ratones en un mililitro de solución tampón que contiene anticuerpo monoclonal C kit conjugado con PC, diluido 1:50.Incube las células durante 20 minutos en la oscuridad a cuatro grados Celsius tras la incubación. Lave las células dos veces con 40 mililitros de solución tampón. Tras la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.Luego, agregue 50 microlitros de microesferas anti A PC por ratón directamente al precipitado. Mezcle bien e incube durante 20 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, lave y centrifugue las células como antes. A continuación, re suspenda el precipitado celular en cuatro mililitros de solución tampón por cada tres ratones, coloque las columnas LS máximas en el campo magnético de un separador máximo adecuado.Prepare las columnas lavando con cuatro litros de solución tampón. A continuación, aplique la suspensión celular y recoja las células no marcadas que pasan a través de la columna en un tubo de recolección. Lave la columna con cuatro litros de solución tampón tres veces.Añada nuevo tampón cuando se vacíe el depósito de la columna. Una vez que toda la solución haya pasado, deseche el eluato y retire las columnas del separador, colocando cada una encima de un tubo cónico de 15 mililitros. Pipetee cuatro mililitros de solución tampón sobre cada columna e inmediatamente expulse las células marcadas magnéticamente empujando el émbolo dentro de la columna.Centrifugar los tubos a 500 veces G durante cinco minutos. Eliminar cuidadosamente el SUP natum por aspiración. Re-suspender cada pellet con un mililitro de solución tampón y agrupar los pellets en un único tubo cónico de 15 mililitros.Una vez que se ha enriquecido la población de células positivas para el kit marino, tiña y separe las células mediante citometría de flujo. Los precursores hematopoyéticos y las células madre hematopoyéticas procedentes de una suspensión de médula ósea enriquecida para células positivas al kit marino mediante el uso de microesferas magnéticas, y las células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT HSC) y las células madre hematopoyéticas totales (THSC) se separaron según la expresión de moléculas de superficie tal como se describe en este video. Esta figura muestra un ejemplo del procedimiento de selección electrónica para cuantificar los precursores linfoides comunes como linin.Vea las células interleucina siete R positivas bajas. Lin negativo, células positivas para SEE kit y scar uno positivo, y lin negativo, células positivas para SEE kit y scar uno. Células bajas del gate SEE kit positivo.Los precursores mieloides comunes se identifican como células positivas para FC gamma R.Low CD34. Asimismo, a partir de la población C-kit positiva, los precursores de granulocitos y monocitos se identifican como células positivas para FC gamma alto y CD34, mientras que los precursores megacariocitos-eritrocitos se identifican como células negativas para FC gamma bajo y CD34. Además, los LKS 8 L-T-H-S-C y S-T-H-S-C se identifican como células negativas y positivas para CD34, respectivamente. De este modo, se obtienen dos poblaciones enriquecidas y altamente purificadas que están fisiológicamente presentes en bajo número, con el fin de evaluar el impacto de la autoinmunidad sobre la hematopoyesis, utilizando CSH procedentes de ratones control y de ratones con enfermedad inflamatoria intestinal.Se tiñeron con anticuerpo KI 67 y DPI, como se puede observar aquí. Las células en ciclo son apenas detectables, si es que lo son, en el compartimento de células madre hematopoyéticas LKS CD 34 negativas de los controles sanos. En contraste, el mismo subconjunto celular está significativamente aumentado durante la EII y se detecta un número sustancial de CSM en las fases S y G2/M del ciclo celular.Lo que sugiere que la inflamación crónica mediada por linfocitos T determina la entrada de las CPH en el ciclo celular. Para evaluar la presencia de ATP almacenado en vesículas, las células CD34 negativas de ratones sanos se tiñeron con el compuesto unidor a nucleótidos quinina, y el análisis con rojo nuclear mediante microscopía confocal de células vivas reveló que en las CPH, pero no en las GMP, son visibles vesículas positivas para quinina en el citoplasma, para determinar si las CPH responden al ATP extracelular. Se analizó la respuesta de calcio en células madre hematopoyéticas purificadas cargadas con 4 0 2 y estimuladas con ATP e ionomicina, como se observa aquí. Los rastros individuales de elevación de calcio indican que hubo un aumento en el calcio citosólico en las CPH de larga duración mediante la activación de receptores P2 puramente anérgicos.Tras la exposición a un TP, ya que los aumentos de calcio citosólico inducen la liberación de ATP vesicular. Este experimento sugiere que un TP puede regular su propia liberación desde las CSH y demuestra que este procedimiento puede utilizarse para estudios funcionales de las CSH. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre neurales topo y progenitores comprometidos con una línea celular para ensayos funcionales. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la reconstrucción de ratones receptores no irradiados, con el fin de responder preguntas adicionales, como el potencial de reconstrucción de células madre hematopoyéticas purificadas a partir de un estado C o de un entorno inflamatorio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Este video muestra la forma de micro-disección del saco vitelino y la aorta-gonadal-mesonefros región a partir de embriones y el uso de la citometría de flujo para clasificar las células madre hematopoyéticas.

El aislamiento de las primeras células madre hematopoyéticas murinas saco vitelino y AGM

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

Aquí presentamos la metodología para el análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario de ratón. Combinación de índice de clasificación de las células de la región aorta-gónada-mesonefros embrionaria con cocultivo de células endoteliales y trasplante para caracterizar las propiedades fenotípicas y el potencial de engraftment de precursores hematopoyéticos individuales.

Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Describimos el uso de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para evaluar el potencial maligno de las células hematopoyéticas genéticamente. TCMH es útil para evaluar varias células hematopoyéticas malignas en vivo así como generar una cohorte grande de ratones con síndromes mielodisplásicos (MDS) o leucemia para evaluar nuevas terapias.

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.

Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

Presentamos un protocolo paso a paso para el aislamiento de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs) y HSCs a corto plazo (ST-HSCs) utilizando el sistema reportero Hoxb5.

Método de aislamiento para células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo

Aquí se presenta una técnica basada en citometría de flujo que permite medir simultáneamente el número de divisiones celulares, el fenotipo celular superficial y el parentesco celular. Esas propiedades se pueden probar estadísticamente utilizando un marco basado en permutaciones.

Evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas

Aprende a aislar células madre hematopoyéticas murinas mediante enriquecimiento magnético de células c-Kit+ y citometría de flujo. Este método permite obtener progenitores altamente purificados para estudios funcionales in vitro e in vivo.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

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