El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Este video demuestra un protocolo para el aislamiento y la caracterización fenotípica de progenitores hematopoyéticos mediante separación basada en microperlas magnéticas y selección de células activada por fluorescencia. Primero, se disecan la pata trasera, el fémur, la tibia y la médula espinal de un ratón y se homogenizan para generar una suspensión de células de médula ósea. Luego, la población se enriquece para células que expresan C kit utilizando flujo de microperlas magnéticas.

El análisis citométrico de la población enriquecida demuestra que este método produce células sanguíneas altamente purificadas, progenitores y células madre hematopoyéticas, que luego pueden utilizarse para estudios funcionales in vitro e in vivo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el lavado óseo es que permite una recuperación más eficiente y rápida de las células de la médula ósea. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de inflamación, autoinmunidad, inmunodeficiencias, enfermedades degenerativas, trastornos metabólicos y modelos inmunes del cáncer, ya que permite la caracterización fenotípica y el análisis funcional ex vivo de los progenitores hematopoyéticos.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el monitoreo de la hematopoyesis en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. También puede utilizarse para estudiar la transacción de señales en biología celular y la expresión génica regulada durante el desarrollo en subpoblaciones distintas de progenitores. Comience colocando un ratón sacrificado en una bandeja de acero inoxidable.

Rocíe el abdomen y la espalda con etanol al 70 % para recoger los huesos que se utilizarán como fuente de células. Use tijeras para hacer dos pequeñas aberturas en la piel de las patas traseras; con ayuda de pinzas, desloque el fémur, luego gire al ratón boca abajo y corte la piel longitudinalmente. Para exponer la columna vertebral, retire la columna vertebral.

Luego, utilizando tijeras de punta fina, retire cuidadosamente todos los restos de tejido blando de la columna vertebral. Use gasa para eliminar los restos de tejido blando del fémur y la tibia.

Luego, coloque los huesos en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de medio RPMI suplementado. Coloque varios filtros estériles de cuatro quintos en un mortero estéril. Luego, utilizando pinzas, transfiera los huesos al mortero y cúbralos con otra capa de filtros para armar una superficie de fricción.

A continuación, coloque un filtro de malla de 40 micrones en un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, utilizando un pistilo, triture los huesos hasta obtener una suspensión celular homogénea. Y usando una pipeta, transfiera la suspensión al filtro celular.

A continuación, agregue cinco mililitros de RPMI suplementado fresco al mortero para lavar y recolectar las células restantes, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, añada el RPMI al tubo con el filtro. Repita los dos últimos pasos hasta que los huesos homogenizados aparezcan claros.

Una vez que la solución haya pasado a través del filtro, transfiérala a un nuevo tubo de 50 mililitros y filtre, repitiendo el proceso para eliminar los restos de tejido residuales. Centrifugue el tubo a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y retire cuidadosamente el sobrenadante mediante aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento celular.

El siguiente paso del procedimiento consiste en caracterizar los fenotipos de los progenitores hematopoyéticos. Comience por resuspender el paladar celular de cada ratón en 15 mililitros de PBS y FBS al 2%. Luego, centrifugue el tubo a 500 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.

No perturbe el pellet. Reese suspende el pellet en cinco mililitros de PBS y 2% FBS y cuenta las células utilizando un hemocitómetro. Una vez que se ha determinado la concentración celular, transfiera 1x10⁶ células a cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos.

Luego, centrifugue la placa a 500 veces G durante cinco minutos. Durante la centrifugación, prepare una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores de superficie enumerados aquí en PBS y 2% de FBS para teñir las células. Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante invirtiendo la placa y agregue 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos a cada pocillo.

Luego, utilizando un pipetador multicanal, pipetee hacia arriba y hacia abajo para disociar en suspensiones de células individuales. Incube las células durante 20 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius; tras la incubación, lave las células dos veces con 150 microlitros de PBS y 2% de FBS. A continuación, centrifugue la placa a 500 × g durante cinco minutos.

Luego, deseche la senna invirtiendo la placa. A continuación, agregue 50 microlitros de streptavidina AP tres tamaño siete diluida uno a 300 en PBS con 2% de FBS a cada pocillo y disocie en una suspensión de células individuales mediante pipeteo. Incube las células durante 10 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius tras la incubación.

Lave las células dos veces con 150 microlitros de PBS y FBS al 2 %. Después de centrifugar la placa para obtener el sobrenadante S, deseche este y re suspenda las células en 100 microlitros de PBS y FBS al 2 %. Analice las muestras mediante citometría. A continuación, para clasificar subpoblaciones seleccionadas de células hematopoyéticas, se realiza un enriquecimiento magnético en médula ósea para enriquecer las células positivas para secret. Re suspenda el pellet celular de médulas óseas derivadas de al menos 10 ratones en un mililitro de solución tampón que contiene anticuerpo monoclonal C kit conjugado con PC, diluido 1:50.

Incube las células durante 20 minutos en la oscuridad a cuatro grados Celsius tras la incubación. Lave las células dos veces con 40 mililitros de solución tampón. Tras la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.

Luego, agregue 50 microlitros de microesferas anti A PC por ratón directamente al precipitado. Mezcle bien e incube durante 20 minutos a oscuras a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, lave y centrifugue las células como antes. A continuación, re suspenda el precipitado celular en cuatro mililitros de solución tampón por cada tres ratones, coloque las columnas LS máximas en el campo magnético de un separador máximo adecuado.

Prepare las columnas lavando con cuatro litros de solución tampón. A continuación, aplique la suspensión celular y recoja las células no marcadas que pasan a través de la columna en un tubo de recolección. Lave la columna con cuatro litros de solución tampón tres veces.

Añada nuevo tampón cuando se vacíe el depósito de la columna. Una vez que toda la solución haya pasado, deseche el eluato y retire las columnas del separador, colocando cada una encima de un tubo cónico de 15 mililitros. Pipetee cuatro mililitros de solución tampón sobre cada columna e inmediatamente expulse las células marcadas magnéticamente empujando el émbolo dentro de la columna.

Centrifugar los tubos a 500 veces G durante cinco minutos. Eliminar cuidadosamente el SUP natum por aspiración. Re-suspender cada pellet con un mililitro de solución tampón y agrupar los pellets en un único tubo cónico de 15 mililitros.

Una vez que se ha enriquecido la población de células positivas para el kit marino, tiña y separe las células mediante citometría de flujo. Los precursores hematopoyéticos y las células madre hematopoyéticas procedentes de una suspensión de médula ósea enriquecida para células positivas al kit marino mediante el uso de microesferas magnéticas, y las células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT HSC) y las células madre hematopoyéticas totales (THSC) se separaron según la expresión de moléculas de superficie tal como se describe en este video. Esta figura muestra un ejemplo del procedimiento de selección electrónica para cuantificar los precursores linfoides comunes como linin.

Vea las células interleucina siete R positivas bajas. Lin negativo, células positivas para SEE kit y scar uno positivo, y lin negativo, células positivas para SEE kit y scar uno. Células bajas del gate SEE kit positivo.

Los precursores mieloides comunes se identifican como células positivas para FC gamma R.Low CD34. Asimismo, a partir de la población C-kit positiva, los precursores de granulocitos y monocitos se identifican como células positivas para FC gamma alto y CD34, mientras que los precursores megacariocitos-eritrocitos se identifican como células negativas para FC gamma bajo y CD34. Además, los LKS 8 L-T-H-S-C y S-T-H-S-C se identifican como células negativas y positivas para CD34, respectivamente. De este modo, se obtienen dos poblaciones enriquecidas y altamente purificadas que están fisiológicamente presentes en bajo número, con el fin de evaluar el impacto de la autoinmunidad sobre la hematopoyesis, utilizando CSH procedentes de ratones control y de ratones con enfermedad inflamatoria intestinal.

Se tiñeron con anticuerpo KI 67 y DPI, como se puede observar aquí. Las células en ciclo son apenas detectables, si es que lo son, en el compartimento de células madre hematopoyéticas LKS CD 34 negativas de los controles sanos. En contraste, el mismo subconjunto celular está significativamente aumentado durante la EII y se detecta un número sustancial de CSM en las fases S y G2/M del ciclo celular.

Lo que sugiere que la inflamación crónica mediada por linfocitos T determina la entrada de las CPH en el ciclo celular. Para evaluar la presencia de ATP almacenado en vesículas, las células CD34 negativas de ratones sanos se tiñeron con el compuesto unidor a nucleótidos quinina, y el análisis con rojo nuclear mediante microscopía confocal de células vivas reveló que en las CPH, pero no en las GMP, son visibles vesículas positivas para quinina en el citoplasma, para determinar si las CPH responden al ATP extracelular. Se analizó la respuesta de calcio en células madre hematopoyéticas purificadas cargadas con 4 0 2 y estimuladas con ATP e ionomicina, como se observa aquí. Los rastros individuales de elevación de calcio indican que hubo un aumento en el calcio citosólico en las CPH de larga duración mediante la activación de receptores P2 puramente anérgicos.

Tras la exposición a un TP, ya que los aumentos de calcio citosólico inducen la liberación de ATP vesicular. Este experimento sugiere que un TP puede regular su propia liberación desde las CSH y demuestra que este procedimiento puede utilizarse para estudios funcionales de las CSH. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre neurales topo y progenitores comprometidos con una línea celular para ensayos funcionales. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la reconstrucción de ratones receptores no irradiados, con el fin de responder preguntas adicionales, como el potencial de reconstrucción de células madre hematopoyéticas purificadas a partir de un estado C o de un entorno inflamatorio.