Name: Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprende a cuantificar mecanismos celulares en células inmunes primarias mediante tecnología ImageStream. Este método permite analizar muestras pequeñas de sangre humana para investigar respuestas inmunitarias específicas de linaje.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, y el Programa de la CNRR / GCRC M01-RR00125). Los autores declaran no tener conflictos de intereses financieros y gracias al doctor Mark Shlomchik, director del Fondo para la célula de Yale Core Clasificador.

1. El aislamiento y la estimulación de las células inmunes <ol><li> Obtener 10-50 ml de sangre heparinizada de voluntarios sanos después de consentimiento informado por escrito en virtud de las directrices de la Junta de Revisión Institucional local. Para los estudios de envejecimiento o la enfermedad de la patogénesis, la exclusión y los criterios de inclusión para cada voluntario o el paciente tiene que determinarán de forma expresa. </li><li> Aislar las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) con CPT o tubos de Ficoll Paque-Plus de acuerdo a las instrucciones del fabricante (GE Healthcare, NJ) y realizar experimentos en el día de aislamiento 7 (reactivos, tabla 1). </li><li> Incubar PBMC (3 x 10 6 / tubo) en tubos de 1,5 ml en medio 0,6 ml solos o estimulados con ligandos TLR u otros agentes activantes, por ejemplo, el ligando TLR7 / 8 R848 (0,6 ml de medio, más 0,6 l de 10 mM de TLR7 / 8 ligando R848, concentración final 10 mM) a 37 ° C durante 10-60 minutos (Invivogen, CA) 9. </li></ol> 2. LaboratorioEling de las células <ol><li> Etiqueta de linaje celular y otros marcadores de superficie en las suspensiones de células vivas con fluorescencia utilizando anticuerpos conjugados. Etiqueta 3 x 10 6 PBMC durante 20 min a 4 ° C en 100 l de PBS / 2% de FBS en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con un cóctel de anticuerpos específicos de superficie para los linajes de monocitos o DC (Tabla 2). Diluciones óptimas de anticuerpos se puede determinar en experimentos preliminares y las muestras deben ser procesados ​​en lotes para minimizar lote a lote variación. Para la acción vendedor anticuerpo de 0,1 mg / ml de usar 5 l de anticuerpo (1:20 dilución). Utilizar un tubo separado de las células marcadas con sólo un conjugado de un solo color para configurar los canales fluorescentes en el instrumento. </li><li> Después de etiquetado superficie, fijar las células en PFA 4% / PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Para el almacenamiento hasta el momento del análisis, las células centrifugar a 500 xg, y volver a suspender las células en tampón de congelación (90% de FBS que contiene 10% de DMSO) a -80 ° C hasta que el día de ensayo. </li><li> Para la evaluación, el proceso de lotes of células no tratadas y estimulado de un grupo de donantes a fin de minimizar la variabilidad. En el día de análisis, las células descongelación rápida en 37 ° C baño de agua, se centrifuga a 500x g para eliminar tampón de congelación. </li><li> Para permeabilizar las células para la detección de citoquinas intracelulares u otros marcadores, suspensiones volver a suspender las células en 100 l BD Perm / Wash buffer (BD Biosciences, NJ). Etiqueta para los componentes intracelulares de señalización con, por ejemplo, una dilución de 1:20 de conejo anti-NF-kB (p65), anticuerpo (concentración final de 10 mg / ml, Santacruz Biotechnology, CA) durante 20 min a temperatura ambiente, se centrifuga a 500 xg, sobrenadante aspirado y Resuspender las células en 100 Perm BD l / tampón de lavado que contiene 1:250 dilución de cabra anti-IgG de conejo-Alexa647 (Invitrogen, CA) y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Inmediatamente antes de la formación de imágenes, contratinción núcleos con DAPI (0,2 g / ml, Invitrogen, CA) o yoduro de propidio (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA). </li></ol> 3. Análisis IMAGESTREAM <ol><li>Llevar a cabo por la imagen IMAGESTREAM en muestras de lotes para reducir la variabilidad entre las muestras humanas. Ajuste del equipo para poder de los láseres fueron como sigue: 200 mW para 488 nm, 10 mW para 658 nm y 250 mW para 405 nm. </li><li> Para el análisis de archivos de datos (Fig. 1), en primer lugar, la puerta de eventos con la intensidad de PI normal y alta relación de aspecto de PI (ancho: relación altura) para distinguir células individuales (R1) de los desechos (de baja intensidad PI) o los eventos multi-celulares ( PI de alta intensidad y baja relación de aspecto). Los monocitos se encuentran dentro de una puerta para células CD14 positivas. mDCs se encuentran dentro de una puerta de las celdas que tienen un alto contenido de CD11c y bajo de CD4 (R2) y baja también por Lin-1 marcadores (R3). </li><li> Utilizar ideas de software (Amnis, WA) para proporcionar una medida eficaz cuantitativa del grado de activación de cada celda. Determinar la similitud (o co-localización) del factor de transcripción NF-kB citoplasmática con la energía nuclear tinte de PI para indicar la translocación en el núcleo (R4). Una alta correlación de NF-κB/PI localización se refleja en una puntuación de similitud elevada e indica el grado de activación 10. </li><li> Comparar los índices de similitud entre los diferentes grupos de tratamiento o poblaciones de pacientes para indicar la eficiencia relativa funcional de las células. Cuantificar los datos entre las muestras a través de la comparación estadística de los valores absolutos o las diferencias de plegado. Utilice el software de IDEAS para mostrar imágenes de las células de los principales segmentos de la población de histogramas (Fig. 2). </li></ol> 4. Los resultados representativos Hemos cuantificado vías de señalización en respuesta a un ligando modelo viral mediante la estimulación de PBMC con el ligando TLR7 / 8, R848 (fig. 1). Se recogieron las dos imágenes de localización de celulares y las estadísticas de población en los grupos de la muestra (Fig. 2). IMAGESTREAM nos permite subconjuntos de células de puerta directamente de CMSP y las respuestas de imágenes de células de las poblaciones de células cerradas, pero sin clasificar. Aquí hemos cuantificado el efecto de los TLR signaling en la localización nuclear de NF-kB (p65) en Lin1-, CD4 tenue, CD11c + DCs mieloides (mDCs). Al inicio del estudio, se observó un alto porcentaje de células no estimuladas con el factor de transcripción NF-kB (p65) en el citoplasma. Después de la estimulación, las células tratadas tienen una puntuación significativamente más alta similitud de NF-B (p65) con PI tinción nuclear, lo que indica que el NF-kB (p65) trasladadas en el núcleo después de la estimulación (mediana de las puntuaciones de similitud son 1,52 y 3,01, respectivamente, la figura. 2). Resultados similares se observan en TLR5 estimulados monocitos 9. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" /> Figura 1. Tinción y estrategia de apertura de puerta para cuantificar los efectos de la estimulación en mDCs humanos. El factor de transcripción NF-kB regula la expresión de numerosos genes del sistema inmunológico. Este estudio mide la localización nuclear de NF-kB (p65) en mDCs sujeto representativo de uno después de TLR7 / 8 liga<html> ª estimulación. En foco las células individuales fueron identificados por la compuerta de PI eventos positivos con altas proporciones de aspecto nucleares (R1). mDCs (Lin1, CD4dim, CD11c +) fueron cerrada en R3. Localización nuclear de NF-kB (p65) se representa en la R4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" /> Figura 2. . La translocación de NF-kB en mDCs después de la estimulación La translocación de NF-kB (p65) en el núcleo después de la estimulación (R4) se representa en las poblaciones de mDCs no tratados y estimulados, la puntuación de similitud promedio es de 1,52 en la muestra sin tratar y 3,01 en el la muestra estimulada (A). Las imágenes digitales recogidas de forma simultánea de las poblaciones de células no tratadas o R848 estimulados muestran células representativas y la intensidad de NF-B trasladadas en el núcleo de la célula (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande figura.

<ol><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li>
<li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
<li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li>
<li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li>
<li>Kong, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+in+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li>
<li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los pasos críticos en el uso de IMAGESTREAM para los estudios de traducción son la selección de los grupos de comparación relevantes y la optimización y validación de la especificidad del anticuerpo. Las diferencias entre los grupos de sujetos en el objetivo marcado será fácilmente evidente a través de histogramas y las imágenes de células. En combinación con un análisis exhaustivo de los cambios en los receptores relevantes y vías de señalización, estos datos proporcionan información valiosa sobre los mecanismos que su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-R848 </td></tr><tr><td> El paraformaldehído (16%) </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> BD Perm / Wash </td><td> BD Biosciences </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> Cóctel de Lineage 1 (lin 1)-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> de conejo anti-NF-kB (p65) </td><td> SantaCruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (ab &#39;) 2 de cabra anti-IgG de conejo </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> IMAGESTREAM X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos y equipos. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de célula </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> Alexa 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> Monocitos </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-kB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> MDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> pDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Panel de anticuerpos para la tinción de estirpe de células de las vías de señalización Monocitos: CD14 + MDC: Lin1, CD4dim, CD11c + PDC: Lin1, CD4dim, CD123 + Lin1 (linaje) incluye el marcador CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 marcadores de monocitos, células NK, células T y B.

imagen cuantitativa de linaje específico toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Las variaciones individuales en el estado inmunológico determinar las respuestas a la infección y contribuyen a la severidad de la enfermedad y los resultados. El envejecimiento se asocia con una mayor susceptibilidad a las infecciones virales y bacterianas y la disminución de la capacidad de respuesta a las vacunas con una disminución bien documentada en la humoral, así como mediada por células respuesta inmune 1,2. Recientemente, hemos evaluado los efectos del envejecimiento sobre los receptores tipo Toll (TLR), los componentes clave del sistema inmune innato que detectan la infección microbiana y de disparo antimicrobianos respuestas de defensa del huésped 3. En una gran cohorte de donantes humanos sanos, mostró que los monocitos de sangre periférica de la tercera edad han disminuido expresión y función de los TLR ciertos 4 y similares niveles de reducción de TLR y respuestas de señalización en las células dendríticas (DC), células presentadoras de antígenos que son fundamentales en el el vínculo entre la inmunidad innata y adaptativa 5. Hemos demostrado la desregulación de TLR3 en los macrófagos unad menor producción de IFN por países en desarrollo procedentes de donantes de edad avanzada en respuesta a la infección con el virus del Nilo Occidental 6,7. De suma importancia para nuestra comprensión de la inmunosenescencia y para la intervención terapéutica es una comprensión detallada de determinados tipos de células que responden y el mecanismo (s) de la transducción de señales. Los estudios tradicionales de la respuesta inmune a través de imágenes de células primarias y de topografía marcadores celulares por citometría de flujo o inmunoblot han avanzado de manera significativa nuestra comprensión, sin embargo, estos estudios se limitan generalmente técnicamente por el pequeño volumen de muestra a disposición de los pacientes y la incapacidad para llevar a cabo complejas técnicas de laboratorio en múltiples muestras humanas. IMAGESTREAM combina con la citometría de flujo cuantitativa simultánea de imágenes de alta resolución digital y por lo tanto facilita la investigación en poblaciones de células múltiples simultáneamente para una captura eficiente de la susceptibilidad del paciente. Aquí se demuestra el uso de IMAGESTREAM en países en desarrollo para evaluar TLR7 / 8mediada por la activación de los aumentos en la fosforilación y translocación nuclear del factor de transcripción clave, NF-kB, que inicia la transcripción de numerosos genes que son críticos para la respuesta inmune 8. Utilizando esta tecnología, también hemos demostrado recientemente una alteración previamente desconocida de TLR5 y la vía de señalización de NF-kB en los monocitos de donantes mayores que pueden contribuir a la capacidad de respuesta inmune alterada en el envejecimiento 9.

Se describe el uso de la tecnología IMAGESTREAM (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; Www.amnis.com</a&gt;), Que combina la citometría de flujo cuantitativa simultánea con imágenes de alta resolución digital, para cuantificar los mecanismos celulares de las células inmunes primarias de cohortes de pacientes bien definidas. Nuestros estudios proporcionan un modelo para las investigaciones traslacionales para cuantificar las respuestas específicas de linaje celular en pequeñas muestras de cohortes de sujetos.

Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

Las variaciones individuales en el estado inmunitario determinan las respuestas a la infección y contribuyen a la gravedad y al desenlace de la enfermedad. El envejecimiento se asocia con un ...

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar el uso de la tecnología de imagen por flujo para cuantificar los mecanismos celulares de células inmunitarias primarias provenientes de cohortes de pacientes bien definidas. Esto se logra primero aislado los glóbulos blancos mononucleares o pbmc a partir de muestras de sangre obtenidas de pacientes o voluntarios sanos. Tras el aislamiento, las células se activan y luego se marcan con fluorescencia.A continuación, las células se enfocan hidrodinámicamente, se excitan con luz láser y se capturan mediante una cámara CCD de integración con retardo temporal. Finalmente, se obtienen imágenes utilizando el citómetro de flujo de imágenes y la cuantificación de NF kappa b.La translocación en cada imagen celular se realiza mediante el software Ideas. En última instancia, las diferencias entre cada grupo de sujetos pueden determinarse mediante el análisis de diagramas de puntos, histogramas e imágenes celulares. La ventaja del flujo de imágenes es que combina datos e inmunofluorescencia.Nos es posible analizar las vías de señalización celular de manera específica según la línea celular, ya sea a nivel de célula individual o de población, y partiendo únicamente de una pequeña muestra de sangre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el conocimiento al localizar y cuantificar los intermediarios de la señalización. Por ejemplo, puede utilizarse para investigar la translocación nuclear mediada por factores transparentes o para examinar los efectos del envejecimiento en la biología celular.Un líder de mi laboratorio demostrará la técnica tras aislarse células mononucleares de sangre periférica obtenidas de voluntarios humanos. Resuspenda las CPM recuperadas a una concentración de tres veces 10 a la sexta células por 0,6 mililitros de medio, y luego transfiera la suspensión celular a tubos de 1,5 mililitros. A continuación, estimule algunas de las células con un agente activador, como el TLR8 LAR848 mostrado aquí, e incube todas las células a 37 grados Celsius durante 10 a 60 minutos en una incubadora con 5 % de dióxido de carbono.Después del período de incubación, centrifugar las células durante cinco minutos a 500 veces G a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante, etiquetar las células con una mezcla de anticuerpos de superficie específicos para linajes de monocitos o de células dendríticas durante 20 minutos a cuatro grados Celsius, incluyendo tubos de células marcadas con conjugados de un solo color que se utilizarán como controles de compensación. Luego, fijar las células en PFA-PBS al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar las células durante 10 minutos a 500 veces G a temperatura ambiente, resuspender las PBMC en tampón de congelación y almacenar las células a 80 grados Celsius negativos hasta el día del ensayo, cuando se analizarán.Deshiele las células rápidamente en un baño de agua a 37 grados Celsius y, tras centrifugar para eliminar el tampón de congelación, permeabilícelas con 100 microlitros de tampón BD Perm Wash. A continuación, marque con anticuerpos contra componentes de señalización intracelular, como los anticuerpos anti NF kappa BP 65 mostrados aquí, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de formar el botón celular, resuspenda las células en 100 microlitros de tampón BD Perm Wash que contiene IgG de cabra anti-rabbit.Alexa 6 47 e incubar los PBMC durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de la adquisición de imágenes, contratiñir las células con un colorante nuclear; comenzar encendiendo el Image Stream y luego lanzar el software Inspire. A continuación, hacer clic en Cargar plantilla predeterminada y luego seleccionar Inicializar fluidos.Luego, haga clic en el menú de la galería de imágenes y seleccione todo. Ahora presione ejecutar configuración para comenzar a obtener imágenes de las perlas y luego seleccione el canal de campo brillante. Una vez que las perlas de velocidad estén en funcionamiento, haga clic en iniciar todo en la pestaña de asistencia para calibrar y probar el instrumento.Después de que el sistema ImageStream haya sido calibrado, presione flush, lock y load para introducir la muestra más brillante en el equipo. Luego, ajuste la potencia del láser de modo que cada flora cromática tenga un valor máximo de píxel entre 104.000 cuentas, según se mide en los gráficos de dispersión. A continuación, establezca los criterios de clasificación celular.Ahora haga clic en ejecutar, adquirir para recopilar y guardar el archivo de datos del experimento. Para analizar primero los archivos de datos, abra ideas. El software analítico crea archivos de imágenes compensadas y luego realiza la selección de eventos con una intensidad normal del colorante nuclear y una relación de aspecto alta del colorante nuclear. Para distinguir células individuales en la compuerta R1 de restos celulares o eventos multicelulares, los monocitos se encuentran dentro de la compuerta para células positivas para CD14, y las células dendríticas mieloides, que presentan niveles altos de CD11C y bajos de CD4 y marcadores lin1, están en la compuerta R3.Finalmente, utilice el software ideas para determinar la colocalización del factor de transcripción citoplasmático NF kappa B con la tinción nuclear. Una alta correlación entre NF kappa B y la tinción nuclear, que indica la colocalización de los dos marcadores, se refleja en una puntuación de similitud elevada y muestra el grado de activación de la célula. El porcentaje de eventos con alta similitud entre diferentes grupos de tratamiento o poblaciones de pacientes puede compararse para evaluar la eficiencia funcional relativa de las células mediante la idea.Luego se puede utilizar software para mostrar imágenes de células provenientes de segmentos clave de histogramas poblacionales. ImageStream permite el aislamiento de subpoblaciones celulares directamente a partir de pbmc y la obtención de imágenes de respuestas celulares a partir de poblaciones celulares aisladas pero no ordenadas. Aquí se cuantificó el efecto de la señalización TLR sobre la localización nuclear de NF kappa BP 65 en dc mieloides lin uno negativas, CD cuatro débilmente positivas y CD 11 C positivas en condiciones basales.Se observó un alto porcentaje de células no estimuladas con el factor de transcripción NF kappa B p65 en el citoplasma. Después de la estimulación, se determinó que las células tratadas tenían una puntuación de similitud significativamente mayor de NF kappa B p65 con la tinción nuclear de PI, lo que indica que NF kappa B p65 translocó al núcleo tras la estimulación. Las imágenes digitales recopiladas simultáneamente de las poblaciones celulares no tratadas o estimuladas con R 8 48 muestran células representativas y la intensidad de la translocación de NF kappa B al núcleo celular. Obsérvese la mayor intensidad de la tinción de NF kappa B y PI en el grupo estimulado con R 8 48 en comparación con las células no tratadas.Hemos utilizado esta técnica en células procedentes de donantes de diferentes edades y hemos demostrado diferencias en las vías de activación de NF-kappa B mediadas por TLR. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día, con tiempo adicional para el análisis de imágenes, lo que permite obtener tanto imágenes de localización como estadísticas poblacionales. Además, podemos visualizar las respuestas directamente en múltiples poblaciones celulares sin necesidad de separación física. El análisis mediante flujo de imágenes puede aplicarse ampliamente a diversos mecanismos celulares y debería ser muy valioso en la investigación traslacional.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Dendríticas las células de captación de antígenos y migran hacia los órganos inmunes para presentar antígenos procesados ​​a los linfocitos T. Qdot nanocristales etiquetado proporciona una señal fluorescente de larga duración y estables. Esto permite el seguimiento de las células dendríticas a los diferentes órganos por microscopía de fluorescencia.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

En este informe, demuestran los pasos de tinción y análisis de un ensayo de fenotipo realiza en la sangre entera fresca para enumerar las principales poblaciones de leucocitos innatos y adaptativos. Hacemos hincapié en las consideraciones para llevar a cabo estos procedimientos en el contexto de un ensayo clínico multicéntrico.

La enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera Fenotipado

Este protocolo describe el uso de la espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras en células eucariotas. Aquí, ilustramos la precisión de esta técnica mediante el análisis de los múltiples estados de activación de los macrófagos en respuesta a su microentorno.

La espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa es un método preciso y rápido para analizar diferentes modos de activación de macrófagos

Este estudio compara dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para obtener células dendríticas (CD) in vitro. Los monocitos se seleccionan por adherencia o se enriquecen negativamente por separación magnética. Se comparará el rendimiento y la viabilidad de los monocitos junto con la viabilidad, la proliferación y la expresión de marcadores de superficie CD11c/CD14 entre ambos métodos.

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Aquí, demostramos cómo se aíslan los monocitos mediante la separación magnética de perlas de las células mononucleares de sangre periférica después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana anticoagulada. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos se diferencian en células dendríticas inmaduras y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Se describe un protocolo para medir la transmigración por monocitos a través de monocapas endoteliales humanas y su posterior maduración en células espumosas. Esto proporciona un método versátil para evaluar las propiedades aterogénicas de monocitos aislados de personas con diferentes enfermedades y evaluar factores en sangre que puede aumentar esta propensión.

Cuantificación de transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas

Aquí describimos un enfoque proteómico unicelular para evaluar inmunológico fenotípico y funcional (inducción de citocinas intracelulares) alteraciones en las muestras de sangre periférica, analizadas mediante citometría de masas.

Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas

Aquí presentamos un protocolo para la caracterización de subconjuntos de monocitos por citometría de flujo de sangre. Esto incluye delineando cómo los subconjuntos de la puerta y evaluar su expresión de marcadores de superficie y dando un ejemplo de la evaluación de la expresión de marcadores de M2 (antiinflamatorio) y M1 (inflamatoria).

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.

Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

Aprende a cuantificar mecanismos celulares en células inmunes primarias mediante tecnología ImageStream. Este método permite analizar muestras pequeñas de sangre humana para investigar respuestas inmunitarias específicas de linaje.

Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana (Video) | JoVE Journal

Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

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