Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar el uso de la tecnología de imagen de flujo para cuantificar los mecanismos celulares de células inmunitarias primarias procedentes de cohortes de pacientes bien definidas. Esto se logra primero aislado los glóbulos blancos mononucleares o pbmc a partir de muestras de sangre obtenidas de pacientes o voluntarios sanos. Tras el aislamiento, las células se activan y luego se marcan con fluorescencia.

A continuación, las células se enfocan hidrodinámicamente, se excitan con luz láser y se capturan mediante integración de retardo temporal en una cámara CCD. Finalmente, se obtienen imágenes utilizando el citómetro de flujo de imágenes y la cuantificación de NF kappa b.

La translocación en cada imagen celular se realiza utilizando el software ideas. En última instancia, las diferencias entre cada grupo de sujetos pueden determinarse mediante el análisis de diagramas de puntos, histogramas e imágenes celulares. La ventaja del flujo de imágenes es que combina datos e inmunofluorescencia.

Podemos analizar vías de señalización celular de manera específica según la linaje, ya sea a nivel de célula individual o de población, comenzando únicamente con una pequeña muestra de sangre. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el conocimiento al localizar y cuantificar intermediarios de la señalización. Por ejemplo, puede utilizarse para investigar la translocación nuclear mediada por acción de factores transparentes o para examinar los efectos del envejecimiento en la biología celular.

Un líder de mi laboratorio demostrará la técnica tras aislar las células mononucleares de la sangre periférica obtenidas de voluntarios humanos. Resuspender las células mononucleares recuperadas a una concentración de tres veces 10 a la sexta células por 0,6 mililitros de medio, y luego transferir la suspensión celular a tubos de 1,5 mililitros. A continuación, estimular algunas de las células con un agente activador, como el TLR8 ligando R848 mostrado aquí, e incubar todas las células a 37 grados Celsius durante 10 a 60 minutos en un incubador con 5 % de dióxido de carbono.

Después del período de incubación, centrifugar las células durante cinco minutos a 500 veces G a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante, etiquetar las células con una mezcla de anticuerpos de superficie específicos para linajes de monocitos o DC durante 20 minutos a cuatro grados Celsius, incluyendo tubos de células etiquetadas con conjugados de un solo color que se utilizarán como controles de compensación. Luego, fijar las células en PFA-PBS al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar las células durante 10 minutos a 500 veces G a temperatura ambiente, resuspender los PBMC en tampón de congelación y almacenar las células a 80 grados Celsius negativos hasta el día del ensayo, cuando serán analizadas.

Descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 grados Celsius y, tras centrifugar para eliminar el tampón de congelación, permeabilícelas con 100 microlitros de tampón BD Perm/Wash. A continuación, marque con anticuerpos contra componentes de señalización intracelular, como los anticuerpos anti NF-kB p65 mostrados aquí, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras la formación del sedimento, reconstituya las células en 100 microlitros de tampón BD Perm/Wash que contenga IgG de cabra anti conejo.

Alexa 647 e incubar los PBMC durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de la obtención de imágenes, contratiñir las células con un colorante nuclear; comenzar encendiendo el ImageStream y luego iniciando el software Inspire. A continuación, hacer clic en cargar plantilla predeterminada y luego seleccionar inicializar la fluídica.

Luego, haga clic en el menú de galería de imágenes y seleccione todo. Ahora presione ejecutar configuración para comenzar a obtener imágenes de las perlas y luego seleccione el canal de campo brillante. Una vez que las perlas de velocidad estén en funcionamiento, haga clic en iniciar todo en la pestaña de asistencia para calibrar y probar el instrumento.

Después de calibrar el sistema ImageStream, presione flush, lock and load para cargar la muestra más brillante en el equipo. Luego, ajuste la potencia del láser de modo que cada flora cromática tenga un valor máximo de píxel entre 104.000 cuentas, según se mide en los gráficos de puntos. A continuación, establezca los criterios de clasificación celular.

Ahora haga clic en ejecutar, adquirir para recopilar y guardar el archivo de datos del experimento. Para analizar primero los archivos de datos, abra ideas. El software analítico crea archivos de imágenes compensadas y luego realiza un gate sobre eventos con una intensidad normal del colorante nuclear y una relación de aspecto alta del colorante nuclear. Para distinguir células individuales en la compuerta R1 de restos celulares o eventos multicelulares, los monocitos se encuentran dentro de la compuerta para células positivas para CD14, mientras que las células dendríticas mieloides, que presentan niveles altos de CD11c y bajos de CD4 y marcadores lin1, están en la compuerta R3.

Finalmente, utilice el software Ideas para determinar la colocalización del factor de transcripción citoplasmático NF-kappa B con el colorante nuclear. Una alta correlación entre NF-kappa B y el colorante nuclear, que indica la colocalización de los dos marcadores, se refleja en una puntuación de similitud elevada e indica el grado de activación de la célula. El porcentaje de eventos con alta similitud entre diferentes grupos de tratamiento o poblaciones de pacientes puede compararse para evaluar la eficiencia funcional relativa de las células mediante Ideas.

Luego, se puede utilizar software para mostrar imágenes de células provenientes de segmentos clave de histogramas de población. ImageStream permite el aislamiento de subpoblaciones celulares directamente a partir de pbmc y la obtención de imágenes de respuestas celulares a partir de poblaciones celulares aisladas, pero no ordenadas. Aquí, se cuantificó el efecto de la señalización TLR sobre la localización nuclear de NF kappa BP 65 en dc mieloides lin uno, negativos para CD cuatro, CD 11 C positivos débiles, en condiciones basales.

Se observó un alto porcentaje de células no estimuladas con el factor de transcripción NF kappa B p65 en el citoplasma. Después de la estimulación, se determinó que las células tratadas tenían una puntuación de similitud significativamente mayor de NF kappa B p65 con la tinción nuclear de PI, lo que indica que NF kappa B p65 translocó al núcleo tras la estimulación. Las imágenes digitales recopiladas simultáneamente de las poblaciones celulares no tratadas o estimuladas con R 8 48 muestran células representativas y la intensidad de la translocación de NF kappa B al núcleo celular. Observe la mayor intensidad de la tinción de NF kappa B y PI en el grupo estimulado con R 8 48 en comparación con las células no tratadas.

Hemos utilizado esta técnica en células procedentes de donantes de diferentes edades y hemos mostrado diferencias en las vías de activación de NF-kappa B mediadas por TLR. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día, con tiempo adicional para el análisis de imágenes, lo que permite obtener tanto imágenes de localización como estadísticas de población. Además, podemos obtener imágenes de respuestas directamente de múltiples poblaciones celulares sin necesidad de separación física. El image stream puede aplicarse ampliamente a diversos mecanismos celulares y debería ser muy valioso en la investigación traslacional.