Name: Preparación de un ratón para la grabación de Despierta respuestas neuronales y de inyección de trazadores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Aprende a registrar respuestas neuronales en ratones despiertos mediante electrofisiología y trazadores. Este método permite estudiar la función cerebral sin los efectos confusos de los anestésicos.

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Con el apoyo de la NSF 0920060 de subvención, la subvención del NIH DC004395, NHMRC subvención de 1.009.482, Madrid Oficina de Ciencia y la Investigación Médica, y el Passe Garnett y Rodney Williams Memorial Foundation.

1. Reposacabezas Información general <ol><li> Para montar una hecha a la medida de cabeza después, inserte un 1/16 &quot;de acero inoxidable roll-pin perpendicularmente en un agujero perforado en un 3/32&quot; barra de acero inoxidable en forma de cruz. La pieza vertical de la cabeza-mensaje debe ser de aproximadamente 20 mm y la pieza transversal horizontal de aproximadamente 15 mm. Toque un extremo de la varilla vertical para aceptar un tornillo # 1-72. (Fig. 1). </li><li> Durante la cirugía y la grabación, la cabeza posterior está fijado en un latón hecha a la medida o barra de montaje de aluminio con un 1-72 # tornillo (Fig. 2). La pieza larga de la barra de montaje debe ser de 90 mm de largo y 5.10 mm de ancho. La cabeza post encaja en un surco en una extensión de 15 mm de la barra de tiempo que tiene un ángulo de 45 grados. Para evitar la rotación de la cabeza, el travesaño de los puestos de cabeza está ubicado en una pequeña ranura en la parte inferior de la barra de montaje. </li><li> La barra de montaje en la continuación, unido a un bloque de aluminio a la medida de montajeK (Fig. 3). El bloque de montaje es de aproximadamente 30 mm x 30 mm x 25 mm. Este bloque de montaje está unido a un micromanipulador de modo que la posición de la cabeza post puede colocarse con precisión a lo largo de la línea media y en Bregma. El bloque de montaje está hecha de dos piezas encajadas con tornillos. Un recorte en el bloque permite la barra de montaje para deslizarse dentro y se asegura con los tornillos. La barra de montaje es paralelo a la superficie de la mesa. Durante la grabación, asegurar la barra en una costumbre marco estereotáxico (fig. 4). El stereotax está diseñado para montar la barra en la misma posición que en el bloque de montaje durante la cirugía. Esta disposición asegura que el ratón siempre estará alineado con el marco estereotáxico en las sesiones experimentales. </li><li> Cortar una varilla de tungsteno (diámetro .010 &quot;) a aproximadamente 5 mm de longitud, con aproximadamente 1 mm de doblado a 45 °. Esta varilla sirve como el conector de tierra (fig. 1). </li></ol> 2. Al estereotáxicaignment por una craneotomía Nota: Todos los procedimientos que se describen a continuación siguen las técnicas quirúrgicas asépticas y han sido aprobados por el Cuidado de los Animales de la Universidad del Estado de Washington y el empleo y el Comité de Ética Animal del Instituto Garvan. <ol><li> Se anestesia el ratón mediante la colocación de una cámara de inducción con isoflurano al 5%. La falta de una reacción a la cola y / o pizca dedo se asegura de que el animal esté totalmente anestesiado. </li><li> Coloque el ratón en un marco estereotáxico roedores equipado con un adaptador de ratón (Stoelting). Para orientar correctamente el ratón, coloca los dientes en el orificio de la barra de bocado y apriete la pinza de nariz, de manera que quede ajustado. Coloque el ratón lo más recta posible en la barra de bocado y la abrazadera de la nariz. Coloque una mascarilla hecha de un trozo de guante de látex sobre la nariz del ratón, y mantener el isoflurano, el 5% hasta que la velocidad del ratón la respiración es de aproximadamente 1 respiración / seg. Gire el isoflurano al 1,5 - 2,0%. Asegure el cabezal con tque los oídos de los bares con cuidado para no romper la membrana del tímpano. Bares debe ser ajustado, pero no penetra muy profundamente en los canales auditivos. </li><li> Coloque una almohadilla de calefacción debajo del ratón. </li><li> Aplicar ungüento oftálmico para evitar que los ojos se sequen. </li><li> Afeitar el cuero cabelludo de entre las orejas hasta los ojos con una pequeña máquina de afeitar o tijeras de punta fina. </li><li> Limpiar y desinfectar el cuero cabelludo frotando con clorhexidina (o betadine) matorral seguido por el alcohol enjuague repetido 3 veces. </li><li> Para quitar la piel sobre la parte superior del cráneo hacer una incisión a lo largo de la línea media de la parte posterior de la cabeza a los ojos. </li><li> Raspe el periostio a los bordes de la incisión con un bisturí. Si es necesario (dependiendo de destino experimental), cuidadosamente retraer la musculatura en la parte posterior del cuello con fórceps, permitiendo que el músculo se rasga a lo largo fascículos para minimizar el sangrado. Aplicar espuma de gel debajo tejido del cuero cabelludo para reducir al mínimo la humedad y evitar que la piel se mueve sobre el cráneo. </li><li> Seque la superficie del cráneo con un aplicador con punta de algodón humedecido con alcohol isopropílico para mejorar la visualización de puntos de referencia del cráneo. </li><li> Alinear el cráneo a la norma estereotáxica coordenadas 13. Inserte una sonda de punta fina en el soporte del electrodo y colóquelo en el micromanipulador estereotáxica. Una barra de metal afilado funciona bien para este fin (fig. 5). </li><li> Utilizar el punto de identificar Bregma (fig. 5A) y Lambda (fig. 5B) en el cráneo. Mueva la sonda de ida y vuelta entre estos puntos, comprobando que la coordenada lateral-medial para cada ubicación difiere en no más de 50 m. Vuelva a colocar la cabeza, según sea necesario con cuidado aflojando los oídos-bar, cambio de la cabeza y los oídos de las barras laterales, y volviendo a apretar los oídos de las barras. </li><li> Verificar que la altura dorsal-ventral en cada ubicación difiere por no más de 50 micras. Ajuste la altura de la nariz-abrazadera, que se gire el cráneo alrededor del eje de las orejas bares,para nivelar el terreno de juego del cráneo si es necesario. La altura de la oreja-bar también puede ser necesario ajustar. </li><li> Utilizar un atlas 13 para identificar las coordenadas de la diana de interés (fig. 5C) relativa a Bregma. Marcar el cráneo por encima del objetivo (por ejemplo, una &quot;X&quot; o el uso de puntos de tinta china cuatro esquinas de un cuadrado), donde una craneotomía se hará (Fig. 5D). </li></ol> 3. Head-post y la instalación de tierra Pin <ol><li> El uso de gel de grabado para limpiar el cráneo. Use el aplicador para fregar y la propagación de gel de grabado sobre la superficie (10 seg). Lavar con agua y seque por completo. Aplicar la imprimación para cemento dental a la superficie del cráneo usando un aplicador. Extienda el adhesivo con el nuevo aplicador. Cure el adhesivo con una pistola de luz UV (1 ciclo). </li><li> Seleccione una ubicación para la terminal de tierra que es distal al sitio de destino. Cuidadosamente un agujero pequeño en el cráneo con la punta de un bisturí # 65 miniblade lo suficientemente ancha como para la parte corta de la tierra ppara entrar y descansar en las meninges. El conector de tierra debe ser orientado de modo que se está apuntando lejos del bregma y el futuro de cabeza posterior (fig. 6A). </li><li> Asegure la cabeza después de que la barra de montaje, bloquear y adjuntar a la micromanipulador. Al mover el micromanipulador en tres dimensiones, la posición de la cabeza-después de más de Bregma, acaba de tocar el cráneo (Fig. 6B). La base de la cabeza-post deben estar planos sobre el cráneo. </li><li> Uso de las sondas de disección, aplique una pequeña cantidad de cemento dental alrededor de la cabeza-post y el pin de tierra (Fig. 6C). Presione el cemento hacia abajo para asegurar un buen contacto con el cráneo. Nota: No utilice cemento en exceso o que no se endurece de manera uniforme. Cura el cemento con una pistola de luz ultravioleta (3-4 ciclos desde múltiples ángulos). </li><li> Aplicar la segunda etapa de cemento y construir la base alrededor de la cabeza post y cubrir las ranuras de la cabeza-posterior (Fig. 6D). </li></ol> 4. Craneotomía <ol><li> Localizar craneotomía marca de referencia, que será parcialmente oscurecido por el cebador. Utilice un bisturí # 65 para marcar un 3 mm x 3 mm cuadrados en torno a este sitio y aplicar una gota de lidocaína para reducir la sensibilidad y reducir al mínimo la hemorragia. </li><li> Haga varias partituras a cada lado de la plaza (hasta 10), teniendo cuidado de no cortar el hueso y en el cerebro (Fig. 7A). </li><li> Una vez que el colgajo óseo se afloja, utilice la punta del bisturí para que levante, dejando intacta la duramadre (Fig. 7B). </li><li> Cubrir con cera de hueso. </li></ol> 5. Después de la cirugía <ol><li> Apague la anestesia con gas y quitar el ratón de marco estereotáxico. </li><li> Utilice un aplicador con punta de algodón para aplicar el ungüento de lidocaína en torno a la piel expuesta para amortiguar la sensación alrededor de la herida. Utilice otro aplicador con punta de algodón para aplicar Neosporin a la piel expuesta. Inyectar el ketoprofeno (5 mg / kg IM o IP basada en la preferencia de cada uno de los veterinarios del IACUC) comoun analgésico después de la cirugía. Ratón en general, estará listo y se desplazan dentro de minutos de interrupción de gas. </li><li> Coloque el ratón en una jaula caliente y el monitor hasta que esté listo para volver a albergar a los animales. </li><li> El animal se debe comprobar en al menos una vez por día después de que se ha recuperado de la cirugía. Esté atento a signos de falta de apetito y / o alcohol y el comportamiento apático. Si el dolor se sospecha, proporcionar ketoprofeno cada 24 horas (misma dosis que al final de post-cirugía) hasta aliviarse. La lidocaína puede ser aplicada localmente en la herida si el animal se rasca o muestra signos de incomodidad. Los animales se recuperan de una cirugía sin complicaciones ni dolor. </li></ol> 6. Grabación y tinte de inyección <ol><li> Espere por lo menos un día después de la cirugía de la cabeza-post antes de usar el ratón para las grabaciones. </li><li> Coloque el ratón en un dispositivo de espuma moldeada de restricción al cuerpo del ratón. El ratón ya se ha adaptado a este dispositivo, reduciendo así su ansiedad. La adaptación típica espara manejar el ratón cada día después del destete y durante aproximadamente una semana antes de la cirugía y experimentos, colocar el ratón en el dispositivo de espuma durante 1-5 minutos. Suspender dispositivo en el marco estereotáxico (fig. 4). </li><li> Segura de cabeza posterior a la barra de montaje, que ahora está fijado al bastidor estereotáxico (fig. 4). </li><li> Conecte el conector de tierra con un cable terminado con un objeto romo de calibre 22 punta de la aguja hipodérmica. </li><li> Retire la cera ósea a lo largo de la craneotomía. Retire dura si es necesario con la punta de un bisturí miniblade. </li><li> Drive electrodo a la localización estereotáxica adecuada y comenzar la grabación (fig. 8). Por sólo registros electrofisiológicos, una variedad de electrodos pueden ser utilizados. La elección del electrodo depende de la localización y el tipo de grabaciones requeridas. La elección del electrodo para las grabaciones de ratón despierto será el mismo que lo que un investigador utiliza en un ratón anestesiado. Por combinados con registros electrofisiológicoscolorante / trazador inyecciones, un electrodo micropipeta se utiliza 10. La micropipeta se llena con el colorante / trazador de elección para que pueda ser inyectado iontoforéticamente al final de los experimentos electrofisiológicos. Electrodos Multibarrel también se puede utilizar de modo que las manipulaciones farmacológicas puede ser hecho. El electrodo multibarrel se monta sobre una micropipeta sola grabación (fig. 8). Estas técnicas son estándar en la literatura y no son diferentes para las grabaciones anestesiados frente despierto. </li><li> Las grabaciones se pueden realizar durante 4-5 horas en el transcurso de 3-4 días consecutivos. </li><li> Al final de la sesión de grabación, el colorante / trazador puede ser inyectado. Porque no hay receptores del dolor en el cerebro, la inyección iontoforético del colorante o trazador en el cerebro es poco probable que cause molestias. Sin embargo, una vez que las propiedades de respuesta electrofisiológicos de la región donde la inyección debe ser hecho se caracterizan, el animal puede ser anestesiados con isoflurano fo la inyección. Esto eliminaría las sensaciones no deseados potenciales. Debido a que el colorante / trazador está ya en la micropipeta, los conductores activos y tierra se puede cambiar desde el registro electrofisiológico puesta a punto para el generador de corriente para inyectar el colorante iontoforéticamente / trazador. Utilizar protocolo adecuado para el tinte / trazador en el electrodo. Retire el animal de la moderación y la contención headpost cuerpo y volver a su jaula. </li><li> Al final del experimento, seguir el protocolo apropiado para la eutanasia y el procesamiento del tejido para recuperar sitio de la inyección y el etiquetado. </li></ol> 7. Los resultados representativos La instalación correcta de la cabeza-puesto permite al experimentador para registrar las respuestas individuales y de unidades múltiples de un ratón anestesiado, despierto durante varios días. El sistema de sujeción permite la estabilidad de los registros electrofisiológicos de las neuronas individuales en el cerebro. Excelente aislamiento de las unidades individuales y las respuestas fuertes testímulos o puede ser grabado desde la estructura del cerebro mismo durante varios días, por ejemplo en el ratón colículo inferior (Fig. 9A días, un; Figura 9B, dos días). Con una buena cabeza posterior a la instalación, cada ratón será siempre alineado con el aparato estereotáxico y el ratón estereotáxica atlas, 13 que resulta en la localización fiable de los núcleos del cerebro en particular. Esta localización fiable permite la inyección de colorantes y trazadores en las estructuras específicas después de varios días de grabación. Por ejemplo, para evaluar descendiendo proyecciones del mesencéfalo auditivo en el tronco cerebral auditivo, biotinilado dextrano amina (diaminobencidina visualizaron utilizando como cromógeno) puede ser inyectado en el ratón colículo inferior (fig. 10A) después electrofisiológicamente identificar propiedades neuronales de respuesta en el sitio de inyección (en la fig. 10A, una neurona se registró con un mejor frecuencia de 51 kHz), y después de la elaboración de tejidos, unetiquetado nterograde en el núcleo coclear dorsal contralateral se ha visualizado y se traza (Fig. 10B). Fotomicrografías de mayor resolución también puede obtenerse a ver los axones anterógradamente etiquetados y terminales (Fig. 10C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> Figura 1. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> Figura 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> Figura 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> Figura 4. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> Figura 5. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <strong&gt; Figura 6. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> Figura 7. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> Figura 8. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> Figura 9. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> Figura 10.

<ol><li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li>
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<li>Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+properties+of+neurons+in+two+parts+of+the+primary+motor+cortex+of+the+awake+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat.</a> Brain Res. , 333-3173 (1985).</li>
<li>Westby, G. W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+floating+microwire+technique+for+multichannel+chronic+neural+recording+and+stimulation+in+the+awake+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).</li>
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<li>O'Neill, W. E., Suga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+range-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 69-73 (1979).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li>
<li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA%2FCaJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li>
<li>Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory%2C+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li>
<li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

La ventaja del sistema de sujeción de cabeza después de experimentos electrofisiológicos y neuroanatómicos en el ratón es que los experimentos pueden llevarse a cabo con ratones anestesiados, despierta, la eliminación de la contaminación potencial de respuesta debido a las drogas anestésicas. Además, la puesta en marcha se puede utilizar en varios días para permitir el uso de animales más eficiente. La mayoría de los componentes de la cabeza-post están disponibles fuera de la plataforma. Sól...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Gel de Etch para la limpieza de cráneo antes de cemento dental </td><td> Henry Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 12/pk con 1,2 ml jeringas </td></tr><tr><td> Manual para cemento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25881 </td><td> 8 ml botella </td></tr><tr><td> Adhesivo para el cemento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25882 </td><td> 8 ml botella </td></tr><tr><td> Aplicadores para cemento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 24680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> Cemento dental </td><td> Carisma, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> Vuelva a llenar la jeringa 4gm </td></tr><tr><td> Tungsteno Rod (perno de tierra) </td><td> Los sistemas AM </td&gt; <td> 717200 </td><td> 0,010 &quot;de diámetro </td></tr><tr><td> Economía UV curado de luz </td><td> Henry Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> Jefe post </td><td> Construido en la casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Barra de montaje </td><td> Construido en la casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bloque de montaje </td><td> Construido en la casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Marco estereotáxico </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse y el adaptador de ratas recién nacidas </td><td> Stoelting </td><td> 51625 </td><td></td></tr><tr><td> Deltaphase Pad isotérmico </td><td> Braintree Scientific, Inc. </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de un ratón para la grabación de despierta respuestas neuronales y de inyección de trazadores

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Es bien conocido que la anestesia altera las propiedades neuronales de respuesta en diversas regiones del cerebro. 13. En el sistema auditivo, las propiedades fundamentales de respuesta de las neuronas del tronco cerebral como el umbral, la especificidad de frecuencia, y las bandas laterales inhibidoras se alteran de manera significativa bajo anestesia 1-2. Estas observaciones se le solicite fisiólogos a buscar formas de grabar a partir de las neuronas individuales, sin los efectos contaminantes de la anestesia. Un resultado fue una preparación descerebración, donde se secciona el tronco cerebral completamente en el nivel del mesencéfalo 4. Los inconvenientes de esta preparación es una cirugía formidable, la eliminación de bajar las proyecciones del cerebro anterior, y una incapacidad para utilizar la estimulación sensorial para examinar las estructuras por encima del cerebro medio. Una estrategia diferente ha sido la implantación de conjuntos de electrodos crónicamente a grabar a partir de neuronas individuales y grupos de múltiples unidades, mientras el animal está despierto y / o se comporta de 5,6 </sup&gt;. Estas técnicas sin embargo, no son compatibles con la inyección de colorantes trazadores después primera electrofisiológicamente caracterizar una estructura del cerebro. Para evitar la alteración de las propiedades neuronales de respuesta con los anestésicos durante la grabación de las propiedades electrofisiológicas de respuesta de las neuronas individuales, hemos adaptado una técnica reposacabezas utilizado durante mucho tiempo en los murciélagos 7-9 al ratón 10-12. Usando este método, somos capaces de llevar a cabo registros electrofisiológicos durante varios días en el ratón anestesiado. Al final de las sesiones de grabación, podemos inyectar un colorante de reconstruir posiciones de los electrodos y los sitios de grabación o se inyecta un trazador de manera que las rutas hacia y desde los lugares de grabación se puede determinar. Este método permite también grabaciones aisladas de neuronas individuales durante varios días sin que los anestésicos de uso.

Caracterización electrofisiológica de las respuestas neuronales es importante para entender la función del cerebro y para guiar la colocación de los tintes para el rastreo vía. Sin embargo, muchos estudios se realizan en animales anestesiados. Para entender la función del cerebro sin anestesia, hemos desarrollado un método para registrar las propiedades neuronales de respuesta e inyectar tintes en el ratón despierto.

Preparación de un ratón para la grabación de Despierta respuestas neuronales y de inyección de trazadores

Es bien sabido que la anestesia altera las propiedades de la respuesta neuronal en diversas regiones del cerebro.13. En el sistema auditivo, la respuesta fundamental ...

El objetivo general de este procedimiento es registrar las respuestas de neuronas individuales en un ratón despierto. Esto se logra primero anestesiando al ratón mediante inhalación de isoflurano, colocando al ratón en un marco estereotáxico para roedores y exponiendo el cráneo. El segundo paso consiste en localizar la región cerebral de interés utilizando coordenadas estereotáxicas y marcar esta región para una craneotomía posterior.A continuación, se monta una cánula craneal personalizada sobre el cráneo y se coloca en una barra de sujeción que está unida a un micromanipulador del aparato estereotáxico. El paso final consiste en realizar una craneotomía para permitir la inserción de un electrodo en el cerebro. Una vez que el ratón se recupera de la cirugía, se inmoviliza en un bloque de espuma.El poste craneal se coloca nuevamente en la barra de montaje y se fija a un aparato estereotáxico personalizado, y se puede insertar un electrodo de micropipeta en el cerebro. Este procedimiento permite el aislamiento de unidades individuales. Se pueden registrar respuestas intensas a estímulos desde la misma estructura cerebral durante varios días, y los rastros pueden utilizarse para examinar proyecciones ascendentes o descendentes hacia regiones identificadas fisiológicamente o sin afectar las respuestas con anestésicos.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que las propiedades de respuesta de las neuronas no se ven influenciadas por anestésicos. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Zachary Mako, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para preparar el sistema de sujeción de la cabeza, primero ensamble un soporte craneal personalizado perforando un orificio en una varilla de acero inoxidable de 15 milímetros, tres sobre 32 pulgadas. Luego, inserte perpendicularmente un pasador de acero inoxidable de 20 milímetros en el orificio.Para formar una derivación en cruz, filetee un extremo de la varilla vertical para aceptar un tornillo número 1 72 como se muestra aquí. A continuación, prepare la barra de montaje. Esta pieza de equipo consta de una barra más larga de latón o aluminio de aproximadamente 90 milímetros de longitud y de cinco a 10 milímetros de ancho, y una barra más corta de 15 milímetros de longitud que se une al extremo de la barra larga en un ángulo de 45 grados.La barra más corta tiene una ranura cortada en la parte inferior y una ranura más corta a lo ancho; coloque el poste de sujeción en estas ranuras con la pieza transversal encajada en la ranura más corta. El bloque de montaje está formado por dos piezas de aluminio unidas con tornillos para formar un bloque de aproximadamente 30 milímetros por 30 milímetros por 25 milímetros, con una muesca para sujetar la barra de montaje; inserte la barra de montaje en la muesca del bloque de montaje en posición paralela a la superficie de la mesa. Fije el bloque de montaje a un micromanipulador de modo que la posición del poste de sujeción pueda colocarse con precisión a lo largo de la línea media y una brima.Finalmente, corte una varilla de tungsteno de 0,01 pulgadas de diámetro a aproximadamente cinco milímetros de longitud, con aproximadamente un milímetro doblado a 45 grados. Esta varilla sirve como pin de tierra. Después de colocar al animal en una cámara de inducción con 5% de fluorina, asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado realizando una compresión del dedo del pie y verificando la ausencia de reacción.Una vez completamente anestesiado, coloque el ratón en el marco estereotáctico para roedores equipado con un adaptador para ratón, colocando primero los dientes dentro del orificio de la barra de mordida y ajustando suavemente la pinza nasal hasta que quede firme. Para asegurar que el animal permanezca anestesiado, coloque una máscara facial hecha de un trozo de guante de látex sobre la nariz del ratón y mantenga el isoflurano al 5 % hasta que la frecuencia respiratoria sea aproximadamente una respiración por segundo.Después de este tiempo, reduzca el isóflurano a 1,5 a 2 %. Ahora asegure la cabeza colocando suavemente las barras oticas en cada canal auditivo. Teniendo cuidado de no perforar el tímpano, fije las barras oticas de modo que queden ajustadas, pero sin penetrar demasiado profundamente en los canales auditivos. Coloque una almohadilla térmica de gel debajo del ratón.Luego, aplique suavemente una pomada oftálmica para prevenir que los ojos se sequen. Utilice una maquinilla pequeña o tijeras de punta fina. Retire el vello desde entre las orejas hasta los ojos.Ahora limpie y esterilice el cuero cabelludo con una solución de clorhexidina o Betadine, seguida de un enjuague con alcohol repetido tres veces. Realice una incisión a lo largo de la línea media desde la parte posterior de la cabeza hasta los ojos. Raspe el periostio hasta los bordes de la incisión con un bisturí si es necesario.Retraiga cuidadosamente la musculatura de la parte posterior del cuello con pinzas, permitiendo que el músculo se desgarre a lo largo de las líneas de inserción para minimizar el sangrado. Aplique espuma de gel debajo del tejido del cuero cabelludo para reducir la humedad y evitar que la piel se mueva sobre el cráneo. Luego, humedezca un aplicador de algodón con alcohol isopropílico y seque la superficie del cráneo para mejorar la visualización de los puntos de referencia craneales.Una vez que el animal esté preparado, inserte una punta fina. Introduzca una sonda, como una varilla metálica afilada, en el porta-electrodos y fíjela al micromanipulador estereotáxico. Mueva la sonda hacia adelante y hacia atrás entre bgma y Lambda, asegurándose de que la coordenada lateral-medial para cada ubicación no difiera en más de 50 micrones.Reposicione suavemente la cabeza utilizando las barras auriculares según sea necesario. Verifique que la altura dorsal-ventral en Bgma y Lambda no difiera en más de 50 micrones. Ajuste la altura del sujetador nasal para nivelar la inclinación del cráneo si es necesario; es posible que también deba ajustar la altura de la barra auricular.Utilice un atlas del cerebro del ratón para identificar las coordenadas del objetivo de interés en relación con bgma. Utilice tinta china para marcar el cráneo por encima del objetivo donde se realizará una craneotomía. Primero, limpie el cráneo extendiendo gel de grabado dental sobre la superficie y cepillando durante aproximadamente 10 segundos.Luego lave con agua y seque completamente. A continuación, aplique el cebador adhesivo para el cemento dental sobre la superficie del cráneo. Utilizando el aplicador, luego use un aplicador nuevo para extender el adhesivo y cure el adhesivo con un ciclo de una pistola de luz UV.Identifique un lugar distal al sitio objetivo. Para la instalación del pin de tierra, utilice la punta de un escalpelo mini hoja número 65 para perforar cuidadosamente un pequeño orificio en el cráneo. En este punto, el orificio debe ser lo suficientemente amplio para el extremo corto del pin de tierra.Inserte el pin de tierra para que descanse sobre las meninges. Asegúrese de que el pin esté orientado de manera que apunte lejos del bgma y del sitio de fijación del soporte de la cabeza. Ahora, mueva el micromanipulador para que el soporte de la cabeza se coloque sobre el bgma, tocando ligeramente el cráneo.La base del poste craneal debe quedar plana sobre el cráneo. Luego, utilice sondas de disección para aplicar una pequeña cantidad de cemento dental alrededor del poste craneal y del pin de tierra. Presione el cemento para asegurar un buen contacto con el cráneo.Luego, cure con tres o cuatro ciclos de una pistola de luz UV. Finalmente, aplique una segunda capa de cemento para reforzar la base alrededor del poste del cabezal y cubrir las ranuras del poste del cabezal, y cure. Antes que nada, localice la marca de referencia de la craneotomía, que estará parcialmente oculta por el imprimador.Luego, utilice un escalpelo miniatura número 65 para marcar un cuadrado de tres milímetros por tres milímetros alrededor de este sitio. Aplique una gota de solución de lidocaína para reducir la sensibilidad. Ahora realice múltiples incisiones en cada lado del cuadrado, teniendo cuidado de no cortar el hueso ni penetrar en el cerebro.Una vez que la escotadura ósea esté suelta, utilice la punta del escalpelo para levantarla, dejando intacta la duramadre. Luego cubra el área con cera ósea. Una vez finalizada la cirugía, apague el isoflurano y libere al ratón del marco estereotáxico.Aplique lidocaína sobre la piel expuesta, seguido de la aplicación de neo spora, administre analgesia postquirúrgica según lo indicado por el veterinario y devuelva el ratón a su jaula de alojamiento. Después de 24 horas, el ratón puede utilizarse para grabaciones electrofisiológicas. Esta figura demuestra que la instalación exitosa del soporte craneal permite al investigador registrar respuestas de unidades simples y múltiples de un ratón despierto durante varios días.El sistema de sujeción permite realizar grabaciones electrofisiológicas estables de neuronas individuales en el cerebro. Pueden registrarse una excelente aislamiento de unidades individuales y respuestas robustas a estímulos procedentes de la misma estructura cerebral durante varios días. Por ejemplo, en el colículo inferior del ratón durante un período de dos días, el panel izquierdo muestra grabaciones obtenidas del primer día y el panel derecho del segundo día para evaluar las proyecciones descendentes desde el mesencéfalo auditivo hasta el tronco encefálico auditivo; la dextrana biotinilada y la amina visualizadas usando Dino Benadine como cromógeno pueden inyectarse en el colículo inferior del ratón, como se observa aquí tras la identificación electrofisiológica de las propiedades de respuesta neuronal en el sitio de inyección y tras el procesamiento del tejido.La marcación anterógrada en el núcleo coclear dorsal contralateral puede visualizarse y trazarse como se muestra aquí. También se pueden obtener microfotografías a mayor resolución para observar axones y terminales marcados anterógradamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar las propiedades de respuesta de neuronas individuales e inyectar colorantes o trazadores para estudios neuroanatómicos en un ratón despierto.Esta preparación elimina la influencia de los anestésicos sobre las propiedades de respuesta neural y permite realizar experimentos durante varios días con el mismo animal. La clave del procedimiento consiste en asegurar que el soporte craneal esté firmemente fijado al cráneo y que el ratón esté bien inmovilizado. Aunque este video ha ilustrado cómo utilizar este procedimiento para registrar la actividad de neuronas individuales en el sistema auditivo, otras áreas del cerebro pueden estudiarse mediante esta técnica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video demuestra el estudio de la actividad neuronal en una región específica del cerebro del ratón que procesa los estímulos auditivos. La técnica consiste en aplicar un bloqueador inhibidor de la neurotransmisión y comparar las respuestas neuronales a los estímulos auditivos antes y después de que el fármaco se aplique en la región cerebral localizada.

Investigación de las respuestas neuronales auditivas en un ratón despierto en presencia de un bloqueador de neurotransmisores inhibidores

Este video muestra una técnica para implantar un conjunto de electrodos en el cerebro de un ratón. El conjunto contiene electrodos bipolares para registrar la actividad del hipocampo y un electrodo de referencia para obtener la actividad basal del cerebelo. Un ratón anestesiado se coloca en un marco estereotáxico y el conjunto de electrodos se implanta en la región del cerebro objetivo. A continuación, se permite que el animal se recupere antes de realizar el registro electrofisiológico.

Implantación de un conjunto de electrodos en el cerebro de un ratón para su registro electrofisiológico

Fuente: Moore, J. D., et al. Monitoreo yuxtacelular y localización de neuronas individuales dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de ratas alertas, con la cabeza restringida. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra el método de registro y tinción yuxtacelular en una rata despierta y restringida. El procedimiento consiste en registrar las señales de las neuronas e inyectar un tinte para localizar con precisión el sitio de grabación. Esta técnica permite un mapeo preciso de la...

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