Medición de la presión del ventrículo izquierdo a finales de embriones de ratones y Neonatal

El objetivo general de este procedimiento es medir la presión del ventrículo izquierdo o VI en ratones embrionarios tardíos y neonatos. Primero, se prepara el equipo. Una aguja conectada a un transductor de presión debe alinearse con una sonda de ultrasonido.

Luego se prepara un ratón y se obtiene una imagen de su Ventrículo Izquierdo (VI) mediante ultrasonido. A continuación, se avanza la aguja hacia la luz del VI y se registran mediciones de presión pulsátil. Finalmente, los resultados muestran las presiones sistólicas en ratones embrionarios tardíos y neonatos tempranos utilizando esta cateterización guiada por ultrasonido con catéter lleno de líquido.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el servo, los catéteres sin medición de presión o los catéteres de estado sólido, es que permite medir la presión en ratones embrionarios tardíos y neonatos de manera robusta y repetible. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque resulta complicado mantener la orientación del embrión dentro de la cavidad embrionaria, ya que el embrión puede rotar. Tras aplicar la sonda de ultrasonido, seleccione y llene una sonda con agua destilada según la etapa del ratón que se vaya a estudiar.

Coloque la sonda en el soporte ajustable del sistema de ultrasonido. Ajuste el soporte para obtener una vista del eje largo del VI de un ratón montado en la plataforma, con el ápice del VI orientado hacia el brazo de inyección. El sistema de presión consta de un sistema de adquisición de datos con amplificador de puente de transductor de presión lleno de líquido y un gráfico de laboratorio.

Se utiliza un paquete de software y una jeringa de 20 mililitros llena con solución salina heparinizada al 10 % para lavar el tubo. Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas en el tubo ni sobre el transductor. El tubo hacia el transductor se conecta mediante llaves de paso de tres vías, conectores tipo bayoneta y puntas de manguera.

Calibre el sistema del transductor de presión con un manómetro montando el tubo de la aguja y el alojamiento en el brazo de inyección. Sustituya el manómetro por un alojamiento para sujetar el tubo al brazo de inyección. El alojamiento es simplemente un cuerpo de jeringa modificado de tres mililitros.

Sujete el transductor de presión en un anillo. Colóquese aproximadamente a la altura de la plataforma de imagen para evitar obstrucciones. Coloque la aguja de mayor tamaño posible en el tubo de la aguja e inyecte más solución salina heparinizada hasta que salgan unas gotas.

Retire la aguja nuevamente. Asegúrese de que no se hayan atrapado burbujas en el tubo o sobre el transductor. Ahora, coloque un montículo de gel de ultrasonido sobre la plataforma de imagen.

Gire la aguja desde el cuerpo de la jeringa de tres mililitros de manera que el borde biselado de la aguja quede orientado hacia arriba. Luego, utilizando el soporte ajustable, alinee cuidadosamente la sonda para que la aguja pueda avanzarse directamente hacia el gel. Debajo del centro de la sonda de imagen, la aguja debe estar lo suficientemente por debajo de la sonda como para no perforar la cubierta de la sonda, pero lo suficientemente cerca como para permanecer dentro de la profundidad focal de la sonda.

Si es necesario, la aguja puede doblarse manualmente para que permanezca en el plano correcto durante todo su recorrido. Manteniendo la alineación, retire la aguja y eleve la sonda de imagen para colocar un ratón sobre la plataforma de imagen. Reemplace la aguja antes de continuar con la anestesia del ratón.

A una madre gestante sincronizada o a un ratón neonato se puede administrar inhalación continua de 1,5 % de isoflurano mediante un tubo que se inserta en un cono nasal estándar, el cual puede adaptarse para acomodar la pequeña cabeza de un ratón neonato temprano. Para los ratones neonatos, sujete al animal en la plataforma de imagen del sistema de ultrasonido en posición decúbito dorsal, con el ápice del VI orientado hacia el brazo de inyección. Para los ratones neonatos, mantenga su temperatura corporal con una lámpara de calor externa.

Los ratones preñados requieren más preparación. Aplique gel de ultrasonido en las extremidades para proporcionar acoplamiento al detector de ECG adjunto y monitorear la frecuencia cardíaca. Inserte el termómetro rectal para obtener retroalimentación.

Control de la temperatura corporal. Retire el vello del abdomen con crema depilatoria y enjuague con agua. Abra el abdomen utilizando tijeras de disección y pinzas curvas.

Exteriorice un cuerno uterino y colóquelo sobre una gasa humedecida con solución salina tibia. Durante todo el procedimiento, mantenga húmedos a todos los embriones y el abdomen de su madre. Con adiciones periódicas de solución salina tibia, manipule cuidadosamente un embrión hasta la posición adecuada para obtener una vista paraesternal de eje largo del VI. Utilizando la sonda de ultrasonido, se puede usar un rollo de gasa para ayudar a mantener la orientación del embrión.

Proceda a medir la presión en todos los embriones de un cuerno uterino antes de repetir el proceso con el otro cuerno uterino. Comience colocando gel de ultrasonido Degas precalentado sobre un ratón embrionario o neonatal. Baje la sonda de imagen y ajuste el ángulo de la plataforma de imagen para obtener una vista óptima del eje largo del VI paraesternal.

No ajuste el ángulo de la sonda porque se perderá la alineación de la aguja. Mientras observa la imagen del VI en la pantalla del ultrasonido, avance lentamente la aguja hasta que esté cerca de la parte inferior de la sonda. Ajuste la posición de la aguja y de la sonda si es necesario para corregir los desplazamientos de alineación.

La imagen del ratón neonato muestra una orientación ideal para el ventrículo izquierdo, que es difícil de lograr con un embrión. Comience a registrar los datos de presión. Lave suavemente la aguja con solución salina y cierre la llave de paso hacia la jeringa de 20 mililitros y hacia la atmósfera.

Observe la presión. Aumente en el programa para asegurar que se aplique una presión mínima sobre la aguja. Avance lentamente la aguja hasta que pueda verse en el borde de la imagen de ultrasonido, pero aún no en el VI.

Si es necesario, ajuste la posición de la aguja para que ingrese al VI en el ápice. Ajuste la posición de la sonda si es necesario para mantener una imagen clara de la aguja. Introduzca la aguja en la luz del VI mientras registra los datos de presión y monitorea la ubicación de la aguja en la imagen ecográfica.

El inicio de las grabaciones pulsátiles del transductor de presión confirma la ubicación dentro de la luz del VI. Si la aguja parece estar en la luz del VI, pero las grabaciones de presión no son pulsátiles, lave la aguja con un ligero golpe sobre el émbolo de la jeringa hasta que se detecte un aumento de presión. El lavado con líquido debe ser mínimo para evitar alterar el comportamiento del corazón durante las mediciones de presión.

Si las mediciones de presión aún no son pulsátiles, es posible que la aguja esté por encima o por debajo del plano correcto y no se haya insertado en la luz del ventrículo izquierdo. Retraiga la aguja, enjuáguela con solución salina y vuélvala a avanzar. Una vez más.

Si aún no se obtienen lecturas pulsátiles, pase al siguiente ratón y siempre use una aguja nueva para cada ratón diferente. Todo el procedimiento debe realizarse lo más rápidamente posible para minimizar el malestar de los embriones y neonatos durante la duración del experimento. La presión ventricular de ratones C 57 Black six J se midió en un ratón E 18.

Como era de esperar, la presión fue cercana a cero cuando la aguja estaba fuera del VI y mostró una lectura pulsátil cuando estaba dentro del VI en un ratón P14 mayor. La lectura de presión se amortiguó porque la magnitud de la presión era mayor y la frecuencia cardíaca era más alta. Las frecuencias cardíacas se determinaron a partir de la frecuencia de las lecturas de presión pulsátil para diversas edades entre E18 y P14.

Se midieron las frecuencias cardíacas y se calcularon las presiones sistólicas del VI. Durante la realización de este procedimiento, es importante recordar humedecer periódicamente los embriones y verificar el estado de la madre. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en fisiología cardiovascular exploren los cambios de presión arterial en ratones en desarrollo.