Name: Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprende a visualizar la sinapsis virológica del VIH-1 mediante microscopía de fluorescencia TIRF en bicapas lipídicas sintéticas. Este método permite analizar la localización de moléculas de señalización como LCK durante la formación de la sinapsis.

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<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).</li>
<li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
<li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Estudios previos han VS visualizan en el sistema conjugado célula-célula, sin embargo estos estudios no proporcionan imágenes de alta resolución para visualizar las estructuras supramoleculares en la sinapsis. En nuestro laboratorio, se utilizó el vidrio apoyada sistema bicapa plana para representar la superficie de las células infectadas que expresan la gp120 envoltura del virus y la molécula de adhesión celular ICAM-1. En conjunción con microscopía TIRF, que detecta las señales de fluorescencia dentro de 100-200 nm desde la superficie del bicapa con una alta relación señal-ruido, hemos sido capaces de detectar la segregación supramolecular de la gp120 de la ICAM-1 en el VS. Además, el método estándar de inmunotinción puede aplicarse al sistema bicapa y se utiliza aquí para detectar y cuantificar la contratación específica de sesión Lck, pero no Fionia, a la zona de contacto en la gp120-SV 15. Por lo tanto, la bicapa plana ofrece un sistema experimental para imágenes de alta resolución de la interfaz de sinapsis en un plano 2D TIRF microscopia, así como los métodos de iluminación de campo amplio o confocal. Sin embargo, el sistema también tiene limitaciones como el ajuste de la movilidad ligando, fuera del plano de flexión, y las fluctuaciones de las membranas biológicas no se reproducen por bicapas planas. Además, este es un sistema in vitro y por lo tanto tiene otras limitaciones, tales como la falta de otras moléculas de la membrana que estarían presentes en una célula infectada y la maquinaria citoesqueleto que regula la movilidad molecular y la motilidad celular. Además, la dinámica y la distribución de las moléculas, tales como trímeros frente a monómeros de gp120, no podrán estar representados fisiológicamente en la bicapa. Sin embargo, aun con estas limitaciones, este sistema sigue siendo muy valiosa para el estudio del virus de las células o las interacciones célula-célula, y estos métodos pueden servir como una guía útil para los investigadores que están buscando imágenes de alta resolución para detectar la organización supramolecular que no es discernible en el sistema conjugado convencional célula-célula.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Su etiquetados gp120 del VIH </td><td> Regalo del Dr. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Su etiquetados gp120 del VIH </td><td> Tecnología Inmune </td><td></td><td> Varios X4 o R5 trópico </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> Albúmina sérica humana al 25% </td></tr><tr><td> Amicon centrífugas Filtros Ultra </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Conejo MAB </td><td> Señalización Celular </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck Rabbit pAb </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fionia Conejo MAB </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> De cabra anti-conejo IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> Una-20000 </td><td> carboxílico succinimidil éster </td></tr><tr><td> FCS2 Cámara </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm Redonda w / agujeros </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 mm de espesor </td></tr><tr><td> Rectángulo Junta </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 0,25 mm de espesor 14x24 </td></tr><tr><td> Tubo Tygon </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25 pies) </td></tr><tr><td> Llave de tres vías </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Llave de paso de dos vías </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Slide Sticky E 0.2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> Jeringa 1ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> PERROS-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> TIRF microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> Los Institutos Nacionales de Salud </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imagen del vih-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) la infección se produce más eficientemente a través de célula a célula de transmisión 2,10,11. Esta célula a célula de transferencia entre células T CD4 + implica la formación de una sinapsis virológica (VS), que es un F-actina dependiente de célula-célula unión formada sobre el compromiso de VIH-1 sobre la gp120 en la célula infectada con CD4 y el receptor de quimioquinas (CKR) CCR5 o CXCR4 en la célula diana 8. Además de la gp120 y sus receptores, otras proteínas de membrana, en particular la molécula de adhesión de LFA-1 y sus ligandos, la familia ICAM, juegan un papel importante en la formación de VS y la transmisión del virus, ya que están presentes en la superficie de las células del donante infectadas por virus y las células diana, así como sobre la envoltura de VIH-1 viriones 1,4,5,6,7,13. VS formación también es acompañada por eventos de señalización intracelulares que se transducen como resultado de la gp120-compromiso de sus receptores. De hecho, recientemente hemos mostraron que las células CD4 &lt;sup&gt; + la interacción de las células T con gp120 induce el reclutamiento y la fosforilación de moléculas de señalización asociadas a la signalosome TCR como Lck, CD3, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, y 15 PLCγ. En este artículo se presenta un método para visualizar acuerdo supramolecular y proximal a la membrana señalización de eventos que tienen lugar durante la formación de VS. Tomamos ventaja del vidrio-apoyado plana bi-capa del sistema como un modelo reduccionista para representar la superficie de células infectadas por VIH que lleven la envoltura viral gp120 y la molécula de adhesión celular ICAM-1. El protocolo describe los procedimientos generales para el seguimiento de la gp120 del VIH-1 inducida por VS montaje y eventos de la señal de activación que incluyen i) bi-capa de preparación y montaje en una celda de flujo, ii) la inyección de las células y la tinción de inmunofluorescencia para la detección de moléculas de señalización intracelular en las células que interactúan con el VIH-1 de adquisición de imágenes gp120 y la ICAM-1 en bi-capas, iii) por microscopía TIRF, unnd iv) el análisis de datos. Este sistema genera imágenes de alta resolución de la interfaz de VS más allá de lo logrado con el convencional de células-células del sistema ya que permite la detección de distintos grupos de los distintos componentes moleculares de VS, junto con las moléculas de señalización específicos de contratación de estos sub-dominios.

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

La infección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) ocurre de manera más eficiente a través de la transmisión de célula a célula2,10,11. Esta transferencia de célula a célula entre...

Este método crea bicapas lipídicas que imitan una superficie celular infectada. Con el fin de estudiar la sinapsis virológica del VIH formada con linfocitos T CD4 primarios humanos, primero marque las proteínas de interés con colorantes fluorescentes, luego cree bicapas lipídicas y permita que las células formen sinapsis, fije y tiña las células con anticuerpos fluorescentes para la visualización de moléculas de señalización. A continuación, utilizando microscopía de fluorescencia por reflexión interna total o microscopía TIRF, obtenga imágenes de las moléculas de señalización dentro de las células que forman la sinapsis.Analice las imágenes del montaje para delimitar la localización de las moléculas señalizadoras activas con respecto a la estructura de la sinapsis virológica. Este enfoque experimental puede indicar si proteínas celulares como la quinasa específica de linfocitos LCK son reclutadas a la sinapsis virológica del VIH. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en virología e inmunología del VIH, como qué componentes celulares participan en la sinapsis virológica.¿Cuál es el papel en la formación de la sinapsis y cómo podría afectar la transferencia de VIH de célula a célula? Este sistema bier proporciona una vista de fase final de la sinapsis con la ventaja de visualizar la sinapsis con alta resolución espacial en un solo plano. Los resultados muestran claramente la estructura sináptica, formando el bier y ensamblando la celda de flujo es un kinter, una forma de arte.Aquí demostramos la preparación de bilar en la celda de flujo bioóptica para estudios que utilizan virus infecciosos o células infectadas, o cuando es necesario usar volúmenes pequeños debido a la limitación de reactivos. Las celdas de flujo OB desechables pueden utilizarse con el mismo procedimiento de preparación de bilar. Michael Kramer y yo demostraremos un procedimiento para marcar proteínas.Seleccione tintes fluorescentes como LOR 4 88 que sean eficaces para unirse a proteínas, sean suficientemente fotostables para la imagen por microscopía y coincidan con las longitudes de onda de excitación de los láseres disponibles en el equipo microscópico. Comience con la proteína purificada GP one 20 DH 12 con etiqueta his. Intercambie el tampón de la proteína a PBS estéril utilizando una unidad de filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 50 kilodaltons.A continuación, verifique el pH y agregue bicarbonato de sodio pH 9,0 para obtener una concentración final de 50 milimolares de bicarbonato de sodio con un pH de aproximadamente 8,5. Luego, agregue un colorante fluorescente LOR 4 88 reactivo medio en exceso molar diez veces. Incube esta mezcla a oscuras durante 45 minutos a una hora.Proceda a eliminar el exceso de colorante mediante una unidad de filtro centrífugo. Añada PBS estéril fresco a la columna y continúe lavando la proteína del colorante libre. Luego, concentre la proteína GP one 20 hasta aproximadamente un miligramo por mililitro.Mida la concentración del colorante fluorescente a 488 nanómetros. Asimismo, determine la concentración de proteína con un espectrofotómetro NanoDrop, utilizando la configuración para proteínas y etiquetas.Divida los dos números para determinar la intensidad de fluorescencia por molécula de proteína. Prepare una solución de piraña con 45 mililitros de ácido sulfúrico y 15 mililitros de peróxido de hidrógeno al 30 % utilizando pinzas de plástico. Sumerja las laminillas durante 15 minutos.Transfiera las laminillas a un vaso de precipitados lleno con agua purificada PIKA. Lave cada laminilla bajo agua corriente durante dos minutos, un minuto por cada lado, y colóquelas sobre una rejilla para que sequen. Proceda a armar dos cámaras por óptica F CS según se describió previamente por Varona et al. 2008. A continuación, capture y presente su GP uno 20 sobre la superficie del bicapa sin tocar la punta con el vidrio.Pipetee cinco gotas de un microlitro de la mezcla de liposomas sobre un portaobjetos con microacueducto para preparar cinco bicapas por celda de flujo. Ahora coloque un cubreobjetos encima de los lípidos. A continuación, cubra el anillo blanco de retención con una unidad base de abrazadera de acero inoxidable.Dar la vuelta a todo el aparato y sellarlo. Luego marcar la ubicación de las bicapas y incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, conectar un tubo con una llave de paso de dos vías al tubo de perfusión izquierdo.Llene el tubo conectado a una llave de paso de tres vías con albúmina sérica humana al 1 % en solución salina tamponada con hepes y verifique que el montaje esté libre de burbujas. A continuación, conecte este tubo al tubo de perfusión derecho y genere un menisco positivo. Empuje suavemente el tampón a través de la celda de flujo para bloquear la bicapa.Conecte una jeringa de un mililitro que contenga 300 microlitros de caseína de cloruro de níquel 100 micromolar ENC a la llave de paso de tres vías; empuje suavemente el tampón a través de ella. Cierre ambas llaves de paso antes de desconectar la jeringa. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.Ahora cargue 250 moléculas de GP120 marcado con LOR 4 88 etiquetado con hiss por micrón para imitar la densidad local de los grupos encontrados en la superficie de V del VIH 1. Incube durante 30 minutos a oscuras a temperatura ambiente, lave por capas con cinco mililitros de tampón H-B-S-H-S-A. Equilibre la celda de flujo a 37 grados Celsius.Utilizando una jeringa de un mililitro, agregue las células T positivas para CD4 activadas en 400 microlitros de solución al 1% de albúmina sérica humana e incube durante 45 minutos en un incubador a 37 grados Celsius para permitir la adhesión celular mediante la capa lipídica. A continuación, para fijar las células, inyecte paraformaldehído al 2% y luego incube durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Lave tres veces con un mililitro.Permeabilice las células con PBS mediante la inyección de Triton X-100 al 0,1 % durante cinco minutos a temperatura ambiente, tras tres lavados con un mililitro de PBS. Bloquee con caseína que contiene suero de cabra al 5 % durante 25 minutos a temperatura ambiente. Lave tres veces con PBS. A continuación, añada el anticuerpo primario y 300 microlitros de tampón por celda de flujo durante 20 minutos a una hora.A temperatura ambiente, tras tres lavados con PBS, añada el anticuerpo secundario marcado con fluoróforo adecuado en tampón. En el experimento, la muestra de control por capa se trata únicamente con el anticuerpo secundario para determinar el nivel de señal no específica proveniente de este reactivo. Incube durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego lave tres veces con un mililitro.Adquirir imágenes de todas las muestras mediante reflexión interna total en tampón fosfato salino. Microscopía de fluorescencia. Realizar análisis cuantitativo de las imágenes con un paquete de aplicaciones de análisis de imágenes, como ImageJ en la pestaña analizar conjunto de mediciones.Marque las casillas de área y valor medio de gris. Seleccione una región de interés en la imagen que sea un polígono o una forma cerrada trazada a mano alzada. Luego, seleccione la pestaña analizar medida para que el software registre los datos de esta medición.En una tabla de resultados, configure las mediciones en media y área, luego abra las imágenes de una condición experimental para cada traza celular y mida la región de interés y la traza, y también mida una región de fondo para cada condición experimental. Copie las mediciones y péguelas en Excel. Cuando se hayan recopilado todos los datos, calcule la intensidad promedio en unidades arbitrarias.Reste la intensidad de fondo de la media, luego multiplique por el área para obtener la intensidad integrada de la proteína en unidades arbitrarias, con el fin de medir la activación y reclutamiento de las moléculas iniciales de señalización proximales a la membrana. Como resultado de la interacción con GP uno 20 en la sinapsis VIROLÓGICA, se introdujeron linfocitos T primarios humanos CD cuatro positivos sobre bicapas que contenían G uno 20 y ICAM uno; las células introducidas sobre bicapas con solo ICAM uno sirvieron como control para definir los niveles basales de señalización. Después de que las células interactuaron con bicapas que contenían GP uno 20 y ICAM uno, la proteína LCK fue reclutada a la interfaz de la sinapsis virológica y colocalizó con GP uno 20.La intensidad promedio de LCK total fue mayor en la bicapa que contenía tanto GP uno 20 como ICAM uno en comparación con ICAM uno solo. Curiosamente, los niveles de intensidad integrada fueron similares. En conjunto.Estos datos sugieren que LCK se redistribuye en un cúmulo central. Tras la unión de células T CD4 positivas a GP120. Aquí, las intensidades promedio e integradas de la tirosina 394 fosforilada de LCK detectadas mediante microscopía TURF fueron registradas y cuantificadas.Los resultados indican que la unión de GP120 incrementó la fosforilación del residuo tirosina 394 en el bucle de activación de LCK. En contraste, había más Finn presente en el área de contacto de las células sobre bicapas de ICAM-1 sola que sobre bicapas que contenían tanto GP120 como ICAM-1. Por lo tanto, Finn no fue reclutado a la sinapsis virológica.Por consiguiente, concluimos que LCK y no Finn es la quinasa activa en la sinapsis virológica inducida por la GP120 del VIH-1. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión sobre cómo preparar bilares cargadas con proteínas específicas, realizar tinción inmunofluorescente en células de flujo para imaginar interacciones bilares mediante microscopía de reflexión interna total y realizar análisis básicos. Este sistema bilar también es útil para imágenes en células vivas, donde puedes monitorear la dinámica de la formación de las sinapsis virológicas.Además, las células pueden ser transfectadas con proteínas marcadas con fluorescencia, como las GFP Z 70. Esto permite realizar un seguimiento de los cambios en la distribución y reclutamiento de moléculas de señalización hacia la sinapsis en tiempo real.

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Research

Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Aquí, se muestra los métodos para el anclaje de las proteínas de adhesión celular sabe que modulan la formación de sinapsis en el folleto superior de la bilyer lípidos y visualizar la formación de sinapsis mediante microscopía TIRF.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

El protocolo describe un método de alto rendimiento para la determinación de estructuras de proteínas de membrana con la crio-tomografía electrónica y procesamiento de imágenes 3D. Que cubre los detalles de la preparación de muestras, la recopilación de datos, procesamiento e interpretación de datos, y concluye con la producción de un objetivo representante para la aproximación, la pandemia del VIH-1 glicoproteína de la envoltura. Estos procedimientos de cálculo han sido diseñados de una manera...

Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Este video muestra una técnica para visualizar la formación de la sinapsis inmunológica en células asesinas naturales (NK) en una bicapa lipídica (SLB) soportada. El SLB se marca primero con un ligando del receptor activador de células NK marcado con fluoróforos, seguido de la incubación con células NK. Posteriormente, las células se tiñen para obtener actina polimerizada y gránulos líticos perforin-positivos. Este enfoque permite la visualización de la formación de sinapsis mediante...

Imágenes de superresolución de la formación de sinapsis inmunológica de células NK en una bicapa lipídica soportada

Este video muestra una técnica in vitro para estudiar la formación de sinapsis inmune entre las células T humanas primarias y las bicapas lipídicas soportadas (SLB). Las proteínas de la superficie de las células T interactúan con los respectivos ligandos inmovilizados en SLB para formar una sinapsis inmunitaria, seguida del movimiento de los gránulos líticos hacia la sinapsis, que se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.

Una técnica in vitro para estudiar la interacción de las células T con bicapas lipídicas planas soportadas

Este video muestra imágenes de células vivas de la topología inmunológica de la sinapsis, investigando las interacciones entre los linfocitos T y las células epiteliales portadoras de antígenos fluorescentes. La microscopía de fluorescencia revela un desplazamiento rojo del citoplasma y anillos amarillos en la membrana de las células endoteliales, lo que indica la formación de sinapsis inmunológicas.

Evaluación de la topología de la sinapsis inmunológica a través de imágenes de células vivas

Comprender las conformaciones de los antígenos de superficie viral es necesario para evaluar la neutralización de anticuerpos y guiar el diseño de inmunógenos de vacunas efectivos. En este trabajo describimos un ensayo ELISA basado en células que permite estudiar el reconocimiento de la trimérica VIH-1 Env expresada en la superficie de las células transfectadas por anticuerpos anti-Env específicos.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

Describimos aquí una combinación de la técnica de bicapa lipídica soportada por vidrio para formar sinapsis inmunológicas con la técnica de imagen de superresolución de la microscopía de depleción por emisión estimulada (STED). El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios las instrucciones necesarias para llevar a cabo con éxito estas dos técnicas.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Ilustramos aquí un ensayo de unión a membranas in vitro en el que las interacciones entre el Gag del VIH-1 y las membranas lipídicas se analizan visualmente utilizando Gag marcado con YFP sintetizado en un sistema de traducción in vitro basado en germen de trigo y GUVs preparados por una técnica de electroformación.

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

Este protocolo analiza tanto la formación de la sinapsis inmunológica como el posterior tráfico secretor polarizado posterior hacia la sinapsis inmunológica. Se formaron conjugados celulares entre una célula Raji con pulso de superantígenos (que actúa como una célula que presenta antígenos) y un clon de Jurkat (actuando como un linfocito T auxiliar del efector).

Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

Aprende a visualizar la sinapsis virológica del VIH-1 mediante microscopía de fluorescencia TIRF en bicapas lipídicas sintéticas. Este método permite analizar la localización de moléculas de señalización como LCK durante la formación de la sinapsis.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

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