Células endoteliales Co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida

Este protocolo presenta la diferenciación en múltiples etapas de células madre embrionarias humanas como un enfoque eficaz para las células productoras de insulina con un mejor rendimiento que los protocolos desarrollados anteriormente: primero inducir endodermo definitivo con inhibidor activo en a y PI tres K. Luego, para promover la inducción de progenitores pancreáticos, exponga las células de topamina A y ácido retinoico. A continuación, cocultivo con células endoteliales para mediar la maduración de los progenitores pancreáticos en células que expresan insulina.

Proceder a análisis funcionales por microscopía de inmunofluorescencia y QPCR para demostrar la expresión del péptido C y la regulación positiva de la insulina. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, es que este método da como resultado una mayor regulación positiva de la insulina, así como un mayor rendimiento de cpep que las células que expresan el cultivo. H una colonia de células madre embrionarias humanas de un tamaño de entre uno y 1,5 milímetros de diámetro para las células CO a 12.

Placa de pocillo con un mililitro por pocillo de material HESC diluido en D-M-E-M-F 12 medios mientras tanto, aspire los medios de los HSC y reemplace los mts son uno. A continuación, recoja las células mediante raspado. Agréguelos a un tubo de crónica de 15 mililitros y agregue un MTR fresco y luego una placa en una proporción dividida de uno a cuatro en los pocillos previamente recubiertos de matrigel de una placa de 12 pocillos.

Una vez que se propagan, las células alcanzan de uno a 1,5 milímetros de diámetro. La diferenciación se inicia mediante la adición de un medio de inducción definitivo del endodermo que contiene un inhibidor activo en a y el inhibidor de PI tres K. Verruga de cultivo de manin durante cuatro días.

Reponer los medios de comunicación a diario. Proceder a la inducción del progenitor pancreático mediante el primer cultivo en D-M-E-M-F 12 completo que contenga 0,2 micromolares de KAAD, cíclico dopamina durante 24 horas. A continuación, intercambie los medios para completar D-M-E-M-F 12 que contengan 0,2 micromolares de dopamina KAAD Cycl y dos micromolares de todo el ácido transretinoico incubar durante tres días reponiendo los medios de cultivo diario.

Las células en medios de maduración durante dos días antes de realizar el paso final de maduración como control positivo para la maduración in vivo de las células progenitoras pancreáticas derivadas de ESC en el inhibidor de muesca DAPT antes de la división. Inspeccione las células endoteliales bajo el microscopio, luego los ensayos analicen y cuenten las células para la condición de cocultivo de contacto. Agregue 1 millón de células endoteliales microvasculares de corazón de rata a las células diferenciadoras en medios MCDB 1 31 completos.

Preparar también un cultivo de control de medios de cocultivo solo con nuestras células endoteliales. Coloque todas las condiciones de tratamiento en una incubadora durante seis días con cambio de medio. Recolectar diariamente células de muestra al final de cada etapa del proceso de diferenciación.

Endo dam, progenitor pancreático y ARN de extracto de ojales maduros utilizando nucleus spin E-R-R-N-A para el kit de extracción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con un espectrofotómetro Smart Spec Plus y un veterinario de cuarzo, determine la calidad del ARN por relación de absorbancia de 260 nanómetros frente a 280 nanómetros. Y también calcular las concentraciones de la muestra con 100 nanogramos de molde de ARN por muestra.

Realice reacciones RT utilizando el kit de transcripción inversa improvisado. Proceda a configurar QPCR usando los cebadores que se muestran en las reacciones de carga en el termociclador y ejecute el programa QPCR. A continuación, utilizando los valores de CT, calcule el cambio de pliegue de la expresión de ARNm objetivo en células indiferenciadas al final de cada etapa de diferenciación.

Celdas fijas en formaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, permear con 0,25%Triton X 100 durante 10 minutos para bloquear la tinción inespecífica. Añadir 10%donkey serum en 0.05%TX durante 30 minutos.

A continuación, agregue el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave las muestras con 0.05%Triton X durante cinco minutos. A continuación, añadir el anticuerpo secundario diluido en el bloqueo, tamponar e incubar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.

Realice tres lavados de cinco minutos de 0.05%x para mantener los núcleos en la mancha de caballo de uno a 1000. Dilución en PBS incubar durante cinco minutos, seguidos de tres lavados con PBS. Adquiera imágenes de las células fijas y de tinción utilizando microscopio invertido y software de imágenes.

La adición de activos en una manina y verruga a células madre embrionarias humanas indiferenciadas durante cuatro días induce el endodermo definitivo. El análisis Q-R-T-P-C-R confirmó la presencia de los marcadores endodérmicos definitivos esperados. SOX 17, CXCR cuatro y Fox A dos.

La tinción inmunológica para SOX 17 en verde muestra aquí la colocalización con el núcleo teñido con DPI azul. La diferenciación a células progenitoras pancreáticas después de la adición de ciclo, amina y ácido rettino se confirmó mediante Q-R-T-P-C-R de marcadores progenitores pancreáticos y también inmunotinción para PDX one. En la etapa final de la diferenciación, el cocultivo de contacto con células endoteliales microvasculares de corazón de rata indujo fuertemente la regulación positiva de la expresión de insulina en las células progenitoras pancreáticas derivadas de HESC.

Los cocultivos L con LDL AC etiquetados como RHM VEC muestran regiones donde el ECS se adhirió a la placa. Si hay espacios vacíos, se pueden encontrar otros RHM VEC en contacto directo con el ESC diferenciador, como se esperaba. La inmunotinción de RHM VEC no muestra expresión de insulina detectable.

La tinción de éptidos también es un marcador útil para las células diferenciadas mediante el método de cocultivo después de su desarrollo. Esta técnica permitió investigar las interacciones de las células en el proceso de diferenciación de las células madre, lo que evidentemente aumenta la funcionalidad del fenotipo maduro.