Name: Células endoteliales Co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a diferenciar células madre embrionarias humanas en células productoras de insulina mediante co-cultivo con células endoteliales. Este protocolo mejora la maduración y el rendimiento para investigación en diabetes.

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Reconocemos el apoyo de los NIH Premio Innovador Nueva DP2 116520 y ORAU Ralph Powe Premio Junior Faculty mejora.

1. Mantenimiento de la célula <ol><li> HESC H1 (WiCell) se mantuvieron en hESC calificados matrigel pozos revestidos con mTeSR1 los medios de comunicación, con los medios de comunicación cambian todos los días. Los pocillos se recubre por una solución diluida de Matrigel, preparado mediante la adición de 300 l de Matrigel hCME en 25 ml de DMEM: F12. 1 ml de esta solución Matrigel se añadió a cada pocillo de una placa bien seis, o 400 l añadió a cada pocillo de una placa de 12 pocillos y se dejó capa durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se pasaron mecánicamente en una relación de separación de 1:4 por raspado colonias una vez que se alcanzó entre 1 y 1,5 mm de diámetro. </li><li> RHMVEC (tecnologías de la VEC) se mantuvo en MCDB-131 medios de comunicación con los medios de comunicación cambian cada dos días. Las células se dividieron por tripsinización una vez 80% de confluencia se alcanzó en una relación de separación de 1:3. Las células endoteliales entre pasajes 3 y 7 se utilizaron para este estudio. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones de archivo <ol><li> Activina A se reconstituyó a 50 mg / ml de P estérilesBS que contenía 0,1% de suero de albúmina bovina. La solución se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C. </li><li> EGF se reconstituyó a 500 mg / ml en el estéril de 10 mM de ácido acético. La solución se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C. </li><li> La insulina se reconstituyó en 10 mg / ml mediante la adición de H 2 O acidificada (pH ≤ 2), preparado por adición de 0,1 ml de ácido acético glacial a 10 ml de agua. </li><li> DAPT se reconstituyó en DMSO a 18 mg / ml. Se diluyó adicionalmente a la concentración mM 300 en DMEM: F12, alícuotas y se almacenó a -20 ° C. </li><li> KAAD-ciclopamina se reconstituyó en DMSO a 5mg/ml. Se diluyó adicionalmente a la concentración mM 2 en DMEM: F12, alícuotas y se almacenó a -20 ° C. </li><li> Ácido trans-retinoico se reconstituyó en 2,7 mg / ml en 95% de etanol. Se diluyó adicionalmente a la concentración de 2 mM en DMEM: F12, alícuotas y se almacenó a -80 ° C. </li></ol> 3. Endodermo definitivo (DE) y la inducción pancreáticas progenitoras (PP) <ol><li> Una vez que hColonias CES alcanzado entre 1 y 1,5 mm de diámetro, la inducción DE se realizó mediante la adición de DMEM: F12 suplementado con B27, 0,2% de BSA, 100 ng / ml de activina A y 1 Wortmannin mM durante 4 días (día 0-día 4) con los medios cambian todos los días. </li><li> Después de la inducción DE fue completa, la inducción de páncreas progenitora fue inducida por el cambio de soporte a DMEM: F12 suplementado con B27, 0,2% de BSA y KAAD ciclopamina-a una concentración de 0,2 mM durante 24 horas (Día 4-Día 5). </li><li> Después de 24 horas medio se cambió a DMEM: F12 suplementado con B27, 0,2% de BSA, KAAD-ciclopamina a una concentración de 0,2 mM y ácido trans-retinoico en una concentración mM 2 durante 3 días con los medios de cambiar cada día (Día 5-Día 8) . </li></ol> 4. La maduración de páncreas <ol><li> Después de la inducción del PP, todos los grupos se cambió a los medios de maduración compuestas de DMEM: F12 suplementado con B27, 0,2% de BSA, 10 mM de nicotinamida, 25 mg / ml de insulina, 30 nM de Na 2 g Seo 3 y 50 / ml para la transferrina 2 days con los medios de comunicación cambian todos los días (día 8-Día 10). </li><li> Después de 2 días en los medios de maduración, la etapa de maduración final se lleva a cabo en paralelo usando diversas condiciones para la comparación. La diferenciación fue inducida en las siguientes condiciones: i) con la muesca inhibidor DAPT (ii) el uso de co-cultivo único medio de comunicación, sin que las células endoteliales como el control y (iii) mediante el contacto co-cultivo con células RHMVEC. Las células se mantuvieron en los medios de dApt o compañero de la cultura durante una semana (Día 10 Día 17) con los medios de comunicación cambian todos los días. <ol><li> Los medios de comunicación dApt fue preparado por complementar los medios de maduración con 30 mM DAPT. Las células de estos grupos fueron expuestos primero en completar MCDB131 durante 24 horas y luego se expusieron a los medios de comunicación dApt durante 6 días (Día 11 Día 17). </li><li> Medios de co-cultivo se preparó completándolo MCDB-131 con medios B27, 0,2% de BSA, 10 mM de nicotinamida, 10 ng / ml de EGF, 1 mg / ml de hidrocortisona, 10 mg EndoGro, 90 ug / ml de heparina. Para la condición de control de los medios de comunicación células diferenciadas fueron expuestosa MCDB-131 medio completo durante 24 horas (día 10-Día 11) después de lo cual se cambió el medio a los medios de co-cultivo durante 6 días (día 11-Día 17) (sin células endoteliales). </li><li> En caso de contacto condición de co-cultivo, un millón RHMVEC se añadió a las células que se diferencian en completos MCDB-131 medios (tecnologías de la VEC) para 24 horas (día 10-Día 11) para permitir la conexión. Después de los medios de comunicación las 24 horas fue cambiado a los medios de co-cultivo durante 6 días (Día 11 Día 17) con los medios de comunicación cambian todos los días. </li></ol></li></ol> 5. QRT-PCR Análisis <ol><li> Al final de cada etapa de la diferenciación (endodermo; progenitora pancreático; islote madura) se lisaron y el ARN se extrajo utilizando NucleoSpin kit de extracción de ARN II de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> ARN de calidad se analizó mediante la comprobación absorbancia ARN a 260 nm y 280 nm, seguido por la cuantificación de ARN utilizando un espectrofotómetro SmartSpec Plus. </li><li> La transcripción inversa se realizó a través ImProm k II transcripción inversade acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las reacciones se llevaron a cabo con 100 ng de RNA. </li><li> QRT-PCR se realizó utilizando el sistema de Mx3005P QPCR (Agilent) y Brilliant II SYBR Green mezcla maestra QPCR de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados se muestran en la tabla 1. El paso de inicialización se realizó a 50 ° C durante 2 minutos, seguido por 95 ° C durante 10 minutos. 50 ciclos de amplificación se realizaron como sigue: 95 ° C durante 30 segundos, 54 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 1 minuto. </li><li> Veces el cambio de expresión mRNA blanco sobre las células indiferenciadas se calcula a partir de valores de CT con las siguientes fórmulas: Ct (marcador i) = CT (marcador i) - CT (GAPDH) Δ Ct (marcador i) = Ct (marcador i) (Muestra) - Ct (marcador i) (células indiferenciadas) La expresión relativa (marcador i) = 2-ΔΔCT(Marcador i) </li></ol> 6. La inmunocitoquímica <ol><li> Al final de cada etapa de la diferenciación (endodermo; progenitora pancreático; islote madura) las células fueron fijadas en formaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Las células fijadas se permeabilizaron con 0,25% de Triton X-100 (TX) durante 15 minutos. </li><li> Tinción no específica se bloquearon por incubación en suero burro 10% en 0,05% TX durante 30 minutos. </li><li> Incubación del anticuerpo primario se realizó la noche a 4 ° C en tampón de bloqueo a la dilución de anticuerpos recomendado (ver tabla 1). </li><li> Las células fueron lavadas con TX 0,05% tres veces durante 5 minutos. </li><li> Incubación del anticuerpo secundario se realizó durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad con anticuerpos apropiados diluidos en tampón de bloqueo. </li><li> Las células fueron lavadas con TX 0,05% tres veces durante 5 minutos. </li><li> La tinción nuclear se realizó por incubación con Hoescht mancha en la dilución 1:1000 en PBSdurante 5 minutos, seguido de 3 lavados con PBS. </li><li> Las células fijadas y teñidas fueron imágenes utilizando Olympus IX81 microscopio invertido y el software Metamorph imágenes. </li></ol> 7. Los resultados representativos La adición de activina A y Wortmannin de hESC indiferenciada durante 4 días induce endodermo definitivo según lo confirmado por QRT-PCR en el análisis de marcadores DE Sox17, CXCR4, y FOXA2 y la inmunotinción para Sox17 como se ilustra en la Figura 2. La diferenciación de células progenitoras pancreáticas después de la adición de ácido retinoico y ciclopamina fue confirmada por QRT-PCR de marcadores progenitoras pancreáticas y inmunotinción para Pdx1 como se ilustra en la Figura 3. En la etapa final de la diferenciación, póngase en contacto con el co-cultivo con células RHMVEC fuertemente inducida por la regulación positiva de la expresión de insulina en las células pancreáticas hESC derivados progenitoras. La eficiencia de la diferenciación mediada por co-cultivo se analizó por comparing con la condición de control utilizando DAPT. DAPT se utilizó como control positivo, ya que es actualmente uno de los métodos más comúnmente utilizados para lograr la maduración de páncreas. Dado que el co-cultivo se realizó en un medio suplementado modificados por factores de apoyo de las células endoteliales, el control adicional se realizó con los medios de comunicación en ausencia de células endoteliales para verificar el efecto de los medios en la diferenciación. Los detalles de este análisis se presentan en la Figura 4. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> Figura 1. Multi-etapa de protocolo para la diferenciación de hESC en células productoras de insulina que expresan. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> Figura 2. Inducción de endodermo definitivo de células madre embrionarias humanas. A) QRT-PCR análisis de marcadores DE representativas en las células expuestas a hESC activina A y Wortmannin durante 4 días. Resultados ar<html> e normalizada con respecto a hESC indiferenciado. B) Sox17 coloración (verde) y DAPI (azul) muestran la expresión nuclear de Sox17. Barra de escala: 50 m. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> Figura 3. Páncreas inducción de células progenitoras de las células madre embrionarias derivan las células del endodermo. A) QRT-PCR análisis de los marcadores en las células pancreáticas primeros hESC endodermo derivados expuestos al ácido retinoico ciclopamina y durante 4 días después de la inducción DE. Los resultados normalizados con respecto a hESC indiferenciado. B) Pdx1 tinción (violeta) y DAPI (azul) muestran la expresión nuclear de Pdx1. Barra de escala: 50 m. &quot;&gt; <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> Figura 4. De páncreas en estadio de maduración A) QRT-PCR análisis de las hormonas pancreáticas en hESC después de la maduración de páncreas con DAPT, póngase en contacto con los medios de co-cultivo o co-la cultura (de control). Los resultados normalizados con respecto a hESC indiferenciado. valores de p obtenido por t de Student. B) Co-cultivo con Dil-Ac-LDL marcados RHMVEC (rojo) muestran las regiones donde EC se adhieren a la placa si hay espacios vacíos (arriba), RHMVEC otros se encuentran en contacto directo con la diferenciación de ESC (abajo). C) del péptido C (verde) para la tinción de las células diferenciadas con el co-cultivo método. Barra de escala: 12,5 m (Arriba) y 50 micras (abajo) D) La inmunotinción de RHMVEC no demuestra la expresión de insulina en el RHMVEC. <table border="1"><tbody><tr><td> Marcador </td><td> Primer1 (5 &#39;a 3&#39;) &lt;/ Td&gt; <td> Primer2 (5 &#39;a 3&#39;) </td><td> Árbitro </td></tr><tr><td> SOX17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td> GLUCAGÓN </td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INSULINA </td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> Primers Tabla 1. Usado para reacciones de qPCR.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
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<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Durante el desarrollo del páncreas, que diferencian las células pancreáticas están en estrecha proximidad con las células endoteliales de la aorta y, además, los islotes pancreáticos son densamente vascularizado para promover el intercambio rápido de glucosa en la sangre y las hormonas de los islotes. Teniendo en cuenta estos hechos, no es sorprendente que las células endoteliales juegan un papel importante en el proceso de organogénesis pancreática. Si bien la importancia de las células endoteliales durante el desarrol...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Las concentraciones </td></tr><tr><td> mTeSR1 (con suplemento) </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC cualificado matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (Completo) </td><td> VEC Tecnologías </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Activina A </td><td> I + D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-CA</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1um </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0.2μM </td></tr><tr><td> El ácido trans-retinoico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30μM </td></tr><tr><td> La nicotinamida </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Selenita de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 g / ml </td></tr><tr><td> La transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 g / ml </td></tr><tr><td> EGF </td><td> I + D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC Tecnologías </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> La hidrocortisona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm inversa II de la transcripción del sistema </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant II SYBR Green QPCR maestro de la mezcla </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 policlonal de cabra IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-17355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> PDX1 policlonal de cabra IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-14662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> C-péptido de conejo policlonal </td><td> Señalización Celular </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 burro anti-IgG de conejo </td><td> Invitrogen </td><td> A-21206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 burro anti-IgG de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> A-21447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Los reactivos y kits.

células endoteliales co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Las células madre embrionarias (ESC) tienen dos características principales: pueden ser propagadas in vitro indefinidamente en un estado indiferenciado y que son pluripotentes, lo que tiene el potencial de diferenciarse en múltiples linajes. Estas propiedades hacen que CES sumamente atractiva para la terapia celular regenerativa y aplicaciones basadas en el tratamiento 1. Sin embargo, para todo su potencial para llevarse a cabo las células que se diferencian en fenotipos maduros y funcionales, que es una tarea de enormes proporciones. Un enfoque prometedor en la inducción de diferenciación celular es para imitar el camino de la organogénesis en el en el establecimiento in vitro. El desarrollo del páncreas se sabe que se producen en etapas específicas 2, a partir del endodermo, que pueden desarrollarse en varios órganos, incluyendo el hígado y el páncreas. Endodermo inducción se puede lograr por la modulación de la vía nodal mediante la adición de activina A 3 en combinación con varios factores de crecimiento 4-7 </sup&gt;. Células definitivas endodermo luego someterse compromiso pancreático por inhibición de la inhibición sónica erizo, lo cual puede lograrse in vitro mediante la adición de ciclopamina 8. Maduración de páncreas está mediada por varios eventos paralelos, que incluyen la inhibición de la muesca de señalización; agregación de células progenitoras pancreáticas en 3-dimensionales racimos; inducción de la vascularización; para nombrar unos pocos. Con mucho, el más exitoso en la maduración in vitro de células derivadas de CES pancreáticas progenitoras se han logrado a través de la inhibición de la señalización Notch por la suplementación DAPT 9. Aunque tuvo éxito, esto da como resultado un bajo rendimiento del fenotipo maduro con funcionalidad reducida. Un área menos estudiada es el efecto de la señalización de las células endoteliales en la maduración de páncreas, que es cada vez más apreciado como un factor importante que contribuye a la maduración in vivo los islotes pancreáticos 10,11. El presente estudio explora estos efectos de endotelioial de señalización celular en la maduración de los humanos derivados de la CES, las células pancreáticas productoras de insulina en progenitoras de los islotes, como las células. Se presenta un protocolo de múltiples etapas de diferenciación dirigida, donde los humanos CES primero se induce hacia endodermo por activin A junto con la inhibición de la vía PI3K. Especificación de las células de páncreas endodermo se logra mediante la inhibición de la señalización erizo sónico por ciclopamina junto con la inducción de retinoide por adición de ácido retinoico. La etapa final de la maduración es inducida por la señalización de las células endoteliales consigue una configuración de co-cultivo. Mientras que varias células endoteliales han sido probados en el co-cultivo, en este documento se presentan los datos con las células de rata microvasculares endoteliales del corazón (RHMVEC), principalmente por la facilidad de análisis.

El estudio actual describe un enfoque de diferenciación dirigida en la inducción de diferenciación pancreática de células madre embrionarias humanas. De gran importancia es la constatación de que las células endoteliales de co-cultivo de maduración media de las células madre embrionarias derivan en células progenitoras pancreáticas de insulina que expresan.

Células endoteliales Co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida

Las células madre embrionarias (ESC) poseen dos características principales: pueden propagarse indefinidamente in vitro en estado indiferenciado y son...

Este protocolo presenta la diferenciación multietapa de células madre embrionarias humanas como un enfoque eficaz para obtener células productoras de insulina con un rendimiento superior al de protocolos previamente desarrollados. Primero, se induce el endodermo definitivo con activina A y un inhibidor de PI3K. Luego, para promover la inducción de progenitores pancreáticos, se exponen las células a activina A y ácido retinoico. A continuación, se realiza un cultivo conjunto con células endoteliales para mediar la maduración de los progenitores pancreáticos en células que expresan insulina.Proceda a los análisis funcionales mediante microscopía de inmunofluorescencia y QPCR para demostrar la expresión del péptido C y la sobrerregulación de insulina. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como not es que este método produce una mayor sobrerregulación de insulina, así como un mayor rendimiento de cpep en cultivos de células que la expresan. Incube colonias de células madre embrionarias humanas hasta un tamaño entre uno y 1,5 milímetros de diámetro para que las células alcancen el CO a 12.Placa de pocillos con un mililitro por pocillo de matrigel de HESC diluido en medio D-M-E-M-F 12. Mientras tanto, aspire el medio de los HSC y reemplace los mts por uno nuevo. Luego, recoga las células mediante raspado. Agréguelas a un tubo cónico de 15 mililitros y añada MTR fresco uno. A continuación, siembre las células a una relación de división de uno a cuatro en los pocillos previamente recubiertos con matrigel de una placa de 12 pocillos.Una vez que las células en proliferación alcancen de uno a 1,5 milímetros de diámetro, se inicia la diferenciación mediante la adición de medio de inducción de endodermo definitivo que contiene activador de a y el inhibidor de PI tres K. Cultive las células durante cuatro días.Reponga el medio diariamente. Proceda a la inducción de progenitores pancreáticos cultivando primero en D-M-E-M-F 12 completo que contenga 0,2 micromolar de KAAD, ciclodopamina durante 24 horas. A continuación, cambie el medio a D-M-E-M-F 12 completo que contenga 0,2 micromolar de KAAD ciclodopamina y 2 micromolar de ácido retinoico todo-trans, incube durante tres días reponiendo el medio diariamente.Las células en medio de maduración durante dos días antes de realizar el paso final de maduración como control positivo para la maduración in vivo de células progenitoras pancreáticas derivadas de CEE en presencia del inhibidor de la ruta Notch DAPT antes de la disociación. Inspeccione las células endoteliales bajo el microscopio, luego tripsinice y cuente las células para la condición de co-cultivo por contacto. Añada 1 millón de células endoteliales microvasculares de corazón de rata a las células en diferenciación en medio MCDB 131 completo.Prepare también un cultivo control con solo medio de co-cultivo y nuestras células endoteliales. Coloque todas las condiciones de tratamiento en un incubador durante seis días con cambio de medio. Recolecte diariamente células de muestra al final de cada etapa del proceso de diferenciación.Extraiga los ARN de endodermo, progenitores pancreáticos y ojos maduros utilizando el kit de extracción nucleus spin E-R-R-N-A siguiendo las instrucciones del fabricante. Con un espectrofotómetro smart spec plus y una cubeta de cuarzo, determine la calidad del ARN mediante la relación de absorbancia a 260 nanómetros frente a 280 nanómetros. Asimismo, calcule las concentraciones de las muestras con 100 nanogramos de ARN molde por muestra.Realice reacciones de RT utilizando el kit de transcripción inversa impromptu. Proceda a preparar la QPCR utilizando los cebadores mostrados, cargue las reacciones en el termociclador y ejecute el programa de QPCR. Luego, utilizando los valores de CT, calcule el cambio relativo en la expresión del ARNm diana respecto a las células indiferenciadas al final de cada etapa de diferenciación.Células fijadas en formaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, permeabilizar con Triton X-100 al 0,25% durante 10 minutos para bloquear la tinción no específica. Añadir suero de asno al 10% en TX al 0,05% durante 30 minutos.A continuación, agregue el anticuerpo primario en tampón de bloqueo e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Lave las muestras con Triton X al 0,05 % durante cinco minutos. Luego, agregue el anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo e incube durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.Realice tres lavados de cinco minutos con 0,05 %x para mantener los núcleos en la tinción de caballo a una dilución de uno a 1000 en PBS. Incube durante cinco minutos, seguido de tres lavados con PBS. Adquiera imágenes de las células fijadas y teñidas utilizando un microscopio invertido y software de imagen. La adición de activina A y FGF básico a células madre embrionarias humanas indiferenciadas durante cuatro días induce endodermo definitivo. El análisis Q-R-T-P-C-R confirmó la presencia de los marcadores esperados de endodermo definitivo: SOX17, CXCR4 y FoxA2.La tinción inmunológica para SOX17 en verde muestra la colocalización con el núcleo teñido en azul con DAPI. La diferenciación a células progenitoras pancreáticas, tras la adición de ciclo, amina y ácido retinoico, se confirmó mediante RT-PCR de marcadores de progenitores pancreáticos y también mediante tinción inmunológica para PDX1. En la etapa final de diferenciación, el cultivo en contacto con células endoteliales microvasculares del corazón de rata indujo fuertemente la sobreexpresión de insulina en las células progenitoras pancreáticas derivadas de células madre embrionarias humanas.Los cultivos en capa única con RHM VEC marcados con AC-LDL muestran regiones donde las ECS se adhirieron a la placa. Si existen espacios vacíos, se pueden encontrar otros RHM VEC en contacto directo con las ESC en diferenciación, tal como se espera. La tinción inmunológica de RHM VEC demuestra ausencia de expresión detectable de insulina.La tinción de Eptide también es un marcador útil para células diferenciadas mediante el método de cultivo conjunto tras su desarrollo. Esta técnica permitió investigar las interacciones entre células en el proceso de diferenciación de células madre, lo que evidentemente aumenta la funcionalidad del fenotipo maduro.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un protocolo para aislar, cúmulos cultura, y la imagen de células de los islotes (CCI) derivadas de células pancreáticas fetales humanas se describe. El método se detallan los pasos necesarios para generar los CCI a partir de tejido, la cultura como monocapas o en suspensión en forma de agregados, y la imagen de los marcadores de proliferación y las decisiones del destino celular pancreáticas.

El aislamiento, la cultura, y de imágenes de Human Fetal pancreáticas grupos de células

Aquí, se presenta un nuevo método que permite la conversión de fibroblastos adultos de la piel en células secretoras de insulina. Esta técnica se basa en la conversión epigenética, no implica el uso de vectores retrovirales ni la adquisición de un estado pluripotente estable. Por lo tanto, es muy prometedor para aplicaciones de medicina traslacional.

Conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos

Aquí se describe un protocolo de 4 etapas para diferenciar células madre embrionarias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de líneas de células madre pluripotentes humanas.

La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Este protocolo presenta una comparación entre dos protocolos de inducción diferentes para diferenciar las células madre de la pulpa dental humana (hDPSC) hacia los linajes pancreáticos in vitro:el protocolo integrador y el protocolo no integrativo. El protocolo integrador genera más células productoras de insulina (IMIC).

In vitro Inducción de células madre de pulpa dental humana hacia linajes pancreáticos

El presente protocolo describe un método mejorado para aumentar la coexpresión de los factores de transcripción PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en monocapas planas. Esto se logra reponiendo la matriz fresca, manipulando la densidad celular y disociando las células endodérmicas.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en precursores de células beta pancreáticas en un sistema de cultivo 2D

La diferenciación de las células madre en células de los islotes proporciona una solución alternativa al tratamiento convencional de la diabetes y al modelado de la enfermedad. Describimos un protocolo detallado de cultivo de células madre que combina un kit de diferenciación comercial con un método previamente validado para ayudar a producir islotes derivados de células madre secretores de insulina en una placa.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en grupos de islotes productores de insulina

Este artículo presenta un protocolo para la diferenciación dirigida y el análisis funcional de células similares a β células. Describimos las condiciones óptimas de cultivo y los pasajes para las células madre pluripotentes humanas antes de generar células pancreáticas productoras de insulina. La diferenciación de seis etapas progresa desde la formación definitiva del endodermo hasta las células funcionales similares a las células β que secretan insulina en respuesta a la glucosa.

Protocolo optimizado para generar células pancreáticas funcionales secretoras de insulina a partir de células madre pluripotentes humanas

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina.

HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

Aprende a diferenciar células madre embrionarias humanas en células productoras de insulina mediante co-cultivo con células endoteliales. Este protocolo mejora la maduración y el rendimiento para investigación en diabetes.

Células endoteliales Co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida (Video) | JoVE Journal

Células endoteliales Co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida

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