Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

El objetivo general de este procedimiento es obtener células epiteliales a partir de cultivos tridimensionales de tejidos con células mixtas para analizar los efectos de los fibroblastos estromales sobre la biología de las células epiteliales. Esto se logra primero estableciendo cultivos tridimensionales mixtos con células y esteroides. Luego, los esferoides se separan del cultivo en matriz para aislar las células epiteliales tras el cultivo conjunto.

El siguiente paso consiste en realizar el pase de las células epiteliales tras el co-cultivo hasta que estén listas para su análisis. En última instancia, los efectos de la exposición a fibroblastos en cultivo tridimensional sobre el comportamiento de las células epiteliales pueden evaluarse mediante imágenes microscópicas de los cultivos y el análisis posterior al co-cultivo. Células epiteliales, como la imagen de fluorescencia de la invasión de la matriz y la migración en Transwell mostrada aquí, serán utilizadas para demostrar el procedimiento Quin, un asociado de investigación de mi laboratorio, el día anterior al establecimiento de los co-cultivos.

Saques el gel matre del congelador y deshiélelo sobre hielo en un refrigerador a cuatro grados Celsius durante la noche. El día del experimento, coloque el medio de cultivo sobre hielo al menos una hora antes de mezclarlo con el gel matra. Para diluir el gel matra descongelado.

Añada la mitad del volumen necesario del medio H Mac frío con hielo para la co-cultivo a un tubo estéril sobre hielo. Luego, añada al tubo la misma mitad del volumen total de matrigel descongelado para obtener una dilución uno a uno, manteniendo el tubo sobre hielo. A continuación, coloque 50 microlitros de la mezcla de medio de matrigel en el centro de los pozos designados de una placa de 24 pozos e incube la placa en un incubador a 37 grados Celsius con aire humidificado y 5 %CO₂ durante 10 minutos.

Luego, agregue 450 microlitros adicionales de la mezcla de medio de gel de matrigel a los pocillos e incube durante otros 60 minutos. Durante la segunda incubación, prepare una suspensión uno a uno de fibroblastos y células epiteliales a una concentración de 0,5 × 10⁵ células en cada 0,5 mililitro de medio H me. Cuando la mezcla de medio de matrigel haya solidificado, suelte suavemente la suspensión celular sobre la parte superior del gel y regrese el cultivo al incubador durante dos días.

Cambie el medio cada dos o tres días aspirando muy suavemente el medio desde el lateral del pocillo y reemplazándolo suavemente con medio HEC fresco; supervise diariamente la formación de esferoides bajo el microscopio, según corresponda, utilizando microscopía de luz o microscopía de fluorescencia. Comience pipeteando el cultivo hacia arriba y hacia abajo 10 veces utilizando una pipeta de vidrio estéril de dos mililitros. Luego transfiera el cultivo con la pipeta de vidrio a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y centrifugue durante 10 minutos a 350 ×g a temperatura ambiente; tras la centrifugación, el esteroide celular se sedimentará en el fondo del tubo.

Utilice la punta de una pipeta Pasteur estéril para retirar suavemente el gel de matrigel disruptado de la parte superior de la preparación de centrifugación. A continuación, añada un mililitro de medio H-MAC al sedimento, pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces con una pipeta de vidrio estéril de dos mililitros, y transfiera el cultivo a un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Permita que el esteroide se adhiera al recipiente durante al menos 48 horas antes de cambiar el medio.

Con el tiempo, las células abandonarán la estructura esférica y crecerán como monocapas después de que los cultivos celulares hayan alcanzado el 50 % de confluencia; páselos mediante un protocolo de estandarización a una placa de 35 milímetros durante dos a cuatro días y luego transfiéralos a una placa de 100 milímetros durante tres a cinco días antes de realizar un análisis adicional de las células. Utilice una pipeta Pasteur estéril para aspirar el medio y luego retire manualmente tantos esferoides residuales como sea posible. En cultivos co-tridimensionales de esferoides con fibroblastos y TM1 silenciado, tal como se demuestra aquí en las figuras D, E y F, se induce una mayor invasión de la matriz por parte de las células epiteliales de memoria en comparación con los fibroblastos de control en las figuras A, B y C. Observe las proyecciones epiteliales que invaden la matriz en los esferoides que incorporan fibroblastos con TM1 silenciado, indicadas con flechas en las figuras D y F. Los fibroblastos con sobreexpresión inducida de TM1, mostrados aquí en las figuras J, K y L, inducen una menor invasión por parte de la línea celular de cáncer de mama SUM159 en comparación con los fibroblastos de control en las figuras G, H e I. Compare la ausencia de proyecciones epiteliales en los esferoides que incorporan fibroblastos modificados con TM1 con aquellos que incorporan fibroblastos de control, indicadas por las flechas en las figuras G e I, una vez establecidos los esferoides en co-cultivo.

Las poblaciones celulares pueden aislarse de los esteroides mediante repicado en un contexto bidimensional. Este conjunto de imágenes muestra cultivos bajo microscopía de luz y de fluorescencia tras su aislamiento a partir de cultivo en matrigel aquí. El día cero representa la imagen inmediatamente después del aislamiento; los días uno, dos y cinco indican los días posteriores al aislamiento.

Observe cómo la corona de células que abandonan este esteroide aumenta con el tiempo. Eventualmente, queda un esteroide fantasma con muy pocas células, como se destaca aquí mediante la flecha. Quedan muy pocos esteroides después de la eliminación del fantasma y un pase.

Dependiendo de las tasas de crecimiento relativas de las células analizadas. Las poblaciones puras pueden surgir mediante pases seriados o pueden separarse utilizando marcadores celulares adecuados. En este ejemplo, las muestras se analizan mediante citometría de flujo, utilizando fluorescencia verde y fluorescencia roja para identificar fibroblastos que expresan GFP y células epiteliales que expresan mCherry, respectivamente, con el fin de determinar las poblaciones relativas de células epiteliales y fibroblastos.

Después del aislamiento del cultivo tridimensional en co-cultivo, las células epiteliales conservan las propiedades conferidas por el co-cultivo con fibroblastos durante períodos prolongados, lo que permite una amplia oportunidad para el análisis. En este ejemplo, la exposición a fibroblastos deficientes en TM1 indujo un aumento en la migración en las células H max en co-cultivo, que persistió durante semanas después del aislamiento del co-cultivo tridimensional en comparación con la exposición a fibroblastos de control etiquetados aquí como C siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como aquellos para analizar cambios en la expresión génica y marcas epigenéticas, pueden realizarse con el fin de responder preguntas adicionales sobre los efectos de los fibroblastos en las células epiteliales.