TransFLP - Un método para modificar genéticamente

El objetivo de este procedimiento es manipular genéticamente *Vibrio crassostreae* mediante este método rápido e ineficiente, que se basa en la transformación natural y la combinación de fragmentos. Esto se logra primero preparando una fuente adecuada de quitina, ya que la quitina es el inductor natural de la transformación. En un segundo paso, se genera un constructo de ADN mediante dos rondas de PCR y se lleva a cabo su transformación natural, permitiendo que las bacterias que contienen el plásmido PBR flip incorporen el fragmento de PCR en sus genomas.

A continuación, se utiliza un aumento de temperatura para inducir la enzima lipasa codificada por el plásmido y eliminar el casete de resistencia al antibiótico flanqueado por el sitio de recombinación FRT (flip recombination target). En la etapa final, se elimina el plásmido que codifica la FLP de las bacterias. Finalmente, se emplea PCR y secuenciación para demostrar que la manipulación genética fue exitosa.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso de plásmidos suicidas para manipular genéticamente vire, es que este método es muy rápido y eficiente. Comience pesando muestras de 50 a 80 miligramos de escamas de quitina en tubos plásticos estándar de 1,5 mililitros; luego, manteniendo las tapas de los tubos abiertas, autoclave las escamas y, tan pronto como el autoclave haya finalizado, cierre inmediatamente las tapas y almacene las escamas autoclavadas a temperatura ambiente. Se requieren al menos seis oligonucleótidos para amplificar por PCR las regiones de ADN de interés, así como el casete de antibiótico flanqueado por FRT. También se recomienda incluir un par de cebadores de oligonucleótidos fuera del fragmento de PCR insertado.

Esto permite verificar la integración y la excisión correcta del casete de resistencia a antibióticos flanqueado por FRT, utilizando con cuidado los oligonucleótidos número dos, número tres, número cuatro y número cinco. Los cebadores dos y cinco deben contener al menos 28 pares de bases para poder hibridarse suficientemente con el ADN genómico y los cebadores. Los cebadores tres y cuatro deben construirse utilizando un plásmido que contenga FRT como molde, y diseñar los cebadores dos y cinco para permitir un apareamiento extenso de bases complementarias en el extremo 5' entre los cebadores dos y tres, y entre los cebadores cuatro y cinco, respectivamente.

Ahora, para la primera ronda de PCR, utilice los oligonucleótidos uno y dos para preparar la primera de tres reacciones de PCR simultáneas pero independientes, con el fin de amplificar la región upstream de la región experimental de interés en los constructos diseñados personalizados. En paralelo, prepare la segunda reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos tres y cuatro para amplificar el casete de antibiótico flanqueado por FRT. Por ejemplo, en este experimento, se utilizó el gen A PH que codifica resistencia a canamicina.

Amplifique simultáneamente la región de ADN adyacente mediante la preparación de una tercera reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos cinco y seis y el ADN genómico como molde. Luego, tras la purificación de los tres fragmentos de PCR, inicie la reacción de PCR para las tres muestras; utilice una mezcla con cantidades iguales de los tres fragmentos obtenidos en la primera ronda como molde para realizar una segunda ronda de PCR. Esta amplificación será catalizada por los oligonucleótidos uno y seis.

El fragmento de PCR resultante servirá como ADN transformante en los experimentos de transformación natural. Después de cultivar las células de V. cholerae, medio enriquecido aeróbicamente a 30 grados Celsius. Recoger las bacterias por centrifugación a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera el cultivo bacteriano en forma de escamas al cometa e incube la suspensión celular durante la noche a 30 grados Celsius. Luego, mezcle cuidadosamente al menos 200 nanogramos de los fragmentos obtenidos en la segunda ronda de PCR en la suspensión de células bacterianas. Teniendo cuidado de no despegar extensamente las bacterias de las superficies de quitina, incube esta solución a 30 grados Celsius sin agitación durante otro día.

Ahora, agite en vórtice la cultura vigorosamente durante al menos 30 segundos; siembra de 100 a 300 microlitros de la solución celular sobre placas doblemente selectivas que contienen ampicilina, además del otro antibiótico presente en las placas. Incube los cultivos bacterianos a 30 grados Celsius hasta que sean visibles las colonias. Aísle luego los transformantes individuales a partir de las placas selectivas.

Comience este paso cultivando las bacterias en placas de agar LB que contengan ampicilina a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Como paso opcional, cambie la temperatura durante dos a tres horas a 40 grados Celsius, ya que la expresión de flip a partir del plásmido PBR flip se desrepresiona a temperaturas más altas. Después de ocho horas adicionales de incubación a 37 grados Celsius, transfiera las bacterias a placas frescas.

Ahora, restringir los clones en paralelo en placas de agar que contienen antibiótico y placas libres de antibiótico para evaluar la sensibilidad a antibióticos, y luego aislar una sola colonia sensible al antibiótico resultante. Comience este paso cultivando la cepa durante la noche en condiciones aeróbicas a 30 grados Celsius, en medio enriquecido sin antibióticos. A la mañana siguiente, cultive una nueva cepa durante tres a seis horas diluyendo la cepa nocturna en una proporción de uno a 100 en medio fresco sin antibiótico. Por la tarde, realice una siembra por estría o una dilución en placa de la cepa en placas de agar LB simples, e incube las placas durante otras ocho a 16 horas a 30 grados Celsius hasta que las colonias sean visibles.

En este primer experimento dirigido a eliminar los genes vecinos CTXA y CTXB. Los oligonucleótidos para el método trans flip se generaron tal como se acaba de demostrar; la cepa parental, la cepa intermedia que portaba el casete de resistencia a antibióticos flanqueado por secuencias FRT en lugar del locus de ADN original de C-T-X-A-B y la cepa final, eliminada para C-T-X-A-B y libre del casete de resistencia, se analizaron todas para determinar su genotipo. Se realizó PCR en bloque para este experimento utilizando cebadores que no se unían al fragmento de PCR transformante, sino únicamente al ADN cromosómico. Los fragmentos de PCR se separaron mediante electroforesis estándar en aerogel para determinar su tamaño.

En la banda uno, la cepa mundial tipo B de cólera se ubicó en el tamaño esperado del fragmento de 3.143 pares de bases. En la banda dos, el fragmento de PCR derivado de la cepa delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT se ubicó en 3.162 pares de bases.

Y en la banda tres, el fragmento delta ctx A B FFR TP CR se ubicó en 1.769 pares de bases en comparación con la escalera de un kb. En el segundo ejemplo, en el cual se eliminó una isla genómica completa, se eligió la isla de patogenicidad de Vibrio uno o VPI uno como objetivo para este experimento. El método trans flip se modificó en dos pasos.

Primero, la integración del gen de resistencia a la kanamicina se llevó a cabo mediante un sitio FRT simple al inicio de la isla I. Luego, se realizó una segunda ronda de transformación natural, permitiendo la inserción de un marcador adicional de resistencia a antibióticos, concretamente la resistencia a gentamicina seguida de un segundo sitio FRT al final de la isla de patogenicidad. Los pares de cebadores respectivos se indican encima de cada imagen de gel, y el método trans FLP continuó como se acaba de demostrar.

Las cepas parental, intermedia y final se verificaron mediante PCR del ADN genómico purificado en la banda uno. El fragmento de PCR de la cepa silvestre de V. cholerae se corrió en la banda dos. Se corrió el fragmento de PCR resultante de la cepa VPI uno FRT con GM FRT.

Y en la banda tres, se analizó el producto de PCR derivado de la cepa delta VPI uno FRT. Los pares de cebadores se indican encima de cada imagen del gel. La cepa final carece de todo el VPI uno.

En este tercer ejemplo, una secuencia promotora dependiente de la ARN polimerasa T siete se integró en posición ascendente con el gen T fox, un regulador principal de la transformación natural, utilizando el método trans flip con una ligera modificación respecto al protocolo estándar. La secuencia consenso del promotor dependiente de la ARN polimerasa T siete se incluyó como extremos salientes en los oligonucleótidos número cuatro y número cinco, de forma que esta secuencia de ADN se mantuviera dentro del cromosoma. Incluso después de que se eliminara el casete de resistencia al antibiótico, el constructo se integró entonces en una cepa de V colorizada que contenía la ARN polimerasa T siete.

En esta cepa, la expresión del gen de la polimerasa de ARN T siete fue controlada por el promotor LAC UV cinco para evaluar la expresión dependiente de la polimerasa de ARN T siete del gen T Fox. Los ensayos de transformación natural se realizaron en medio LB. La cepa parental, que carece del promotor dependiente de T siete antes del gen T Fox, no es naturalmente transformable bajo estas condiciones debido a la ausencia de transcripción de T FOX en medio rico y en ausencia del inductor natural quitina. Este fenotipo fue independiente de si la polimerasa de ARN T siete fue inducida artificialmente mediante IPTG o no.

Sin embargo, la cepa con el cambio trans generado, que contiene el promotor dependiente de la ARN polimerasa T7 upstream del gen de competencia T Fox, fue efectivamente naturalmente transformable en medio enriquecido debido al escape del promotor LAC UV cinco en medio LB. La ARN polimerasa T7 producida ya transcribió T FOX desde el promotor dependiente de la ARN polimerasa T7 sin inducción por IPTG. Esto inició la competencia natural y la transformación, confirmando la funcionalidad de la secuencia del promotor dependiente de la ARN polimerasa T7 integrada.

Este fenotipo se vio significativamente potenciado mediante la inducción completa de la ARN polimerasa T7 debido a la adición del inductor del promotor LAC UV5, IPTG. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo manipular genéticamente Vibrio cholerae utilizando una combinación de transformación natural inducida por quitina y recombinación tipo flip. Una vez dominada, esta técnica le permite eliminar genes o islas genómicas, así como integrar secuencias de ADN de manera dirigida a un sitio específico en tan solo unos pocos días.