Name: TransFLP - Un método para modificar genéticamente Vibrio cholerae Sobre la base de la transformación natural y la recombinación FLP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprende a modificar genéticamente Vibrio cholerae mediante transformación natural inducida por quitina y recombinación FLP. Este método rápido permite deleciones e integraciones genómicas eficientes para estudios microbiológicos.

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Me gustaría reconocer Olga de Souza Silva de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Nacional Suizo (FNS) Grant 31003A_127029.

El método TransFLP (Figura 1) se ejemplifica mediante tres enfoques diferentes: i) la deleción de dos genes adyacentes que codifican los determinantes de virulencia de V. cholerae (por ejemplo, ΔctxAB), II) la extracción de una isla de patogenicidad (por ejemplo, ΔVPI-1), y III) la integración de una secuencia de T7 RNA polimerasa dependiente de promotor aguas arriba de un gen de interés, lo que permite posteriormente su artificial expresión en la cepa de fondo respectivo (por ejemplo, T7-tfox) (Figura 2). 1. Preparación de Copos de quitina <ol><li> Peso 50-80 mg de copos de quitina en un tubo de plástico estándar de 1,5 ml. Este puede ser preparado en grandes cantidades. Copos de quitina están disponibles comercialmente de Sigma (número cat. C9213). </li><li> Autoclave los copos de mantenimiento de las tapas de los tubos abiertos. </li><li> Inmediatamente después de cerrar las tapas de la autoclave se ha enfriado. </li><li> Tienda autoclave quitina escamasa temperatura ambiente. </li></ol> 2. Opcional: Transformación artificial de V. cholerae con Flp recombinasa plásmido que codifica <ol><li> Preparar electrocompetentes V. cholerae células utilizando métodos estándar 11. La tienda de alícuotas de células competentes a -80 ° C. </li><li> Añadir 1-2 l de una normal de mini-preparación de plásmido pBR-flp 5 a la electrocompetentes V. células cholerae y transferir la mezcla en una cubeta de electroporación (0,2 cm ancho hueco). </li><li> Aplicar un pulso a 1,6 kV. </li><li> Añadir 0,9 ml de medio SOC, suavemente la transferencia de células a un tubo estándar de 14 ml. Incubar que no se mueve durante 2,5 a 3 horas a 30 ° C. </li><li> Placa de 100 l y 300 l en placas de LB que contenían 100 ug / ml de ampicilina y se incuba a 30 ° C durante la noche. </li><li> Purificar solo clon y almacena como reserva de glicerol para experimentos TransFLP futuras. </li></ol> 3. Diseño de oligonucleótidos y reacción en cadena de la polimerasa <ol><li> Al menos seis oligonucleótidos se requieren para amplificar la región de ADN (s) de interés, así como el casete FRT-flanqueado antibiótico por PCR (Figura 3). Se recomienda incluir también un par de oligonucleótidos de cebado fuera del fragmento de PCR insertado. Esto permite la comprobación de la integración y la escisión correcta de la casete de resistencia a FRT-flanqueado antibiótico (por ejemplo, representado como &#39;chk-up&#39; y cebadores &#39;chk hacia abajo &quot;en las figuras 3 a 5). </li><li> Diseñar los oligonucleótidos # 2, # 3, # 4, # 5 y con cuidado. Ellos deben ser capaces de hibridarse suficientemente (por ejemplo, ~ 28 pb) a la plantilla de ADN. La plantilla de ADN es ADN genómico (gDNA) para los cebadores # 2 y # 5 y FRT-Kan-FRT-que contiene ADN plásmido tal como pROD17 12 y pBR-FRT-KAN FRT-(este estudio) para los cebadores # 3 y # 4 ( Figura 3A). </li><li> Diseño de los cebadores # 2 al # 5 que permite una amplia base-apareamiento en su extremo 5 &#39;entre el # 2 / # 3 y # 4 / # 5, respectivamente (Figura 3A </strong&gt; recuadro). Dos rondas de PCR seguir. </li><li> Realizar tres reacciones de PCR independientes como 1 ª ronda de PCR. El primero será amplificar la región corriente arriba del gen / ADN de la región de interés con la ayuda de oligonucleótidos # 1 y # 2. La PCR debería resultar en un fragmento de al menos 500 pb de longitud para permitir la recombinación homóloga dentro de las células. Fragmentos más cortos (~ 250 pb) puede ser suficiente 8 pero no se recomiendan. </li><li> En paralelo realizar la segunda PCR, que amplifica el casete FRT-flanqueado antibiótico. Para los ejemplos que aquí se utiliza principalmente aph (kan R). Uso oligonucleótidos # 3 y # 4 para esta reacción (Figura 3A). </li><li> Al mismo tiempo, amplificar la región de ADN corriente abajo por PCR (tercera muestra). El fragmento de PCR también debe ser de al menos 500 pb de longitud. Realizar la PCR con gDNA como molde y los oligonucleótidos # 5 y # 6 (Figura 3A). </li><li> Después de la purificación de todos PCR tresfragmentos, lleve a cabo la 2 ª ronda de PCR. Usar una mezcla igual de los tres fragmentos obtenidos en la primera ronda como molde. La amplificación es catalizada por los oligonucleótidos # 1 y # 6. El fragmento resultante de PCR (Figura 3B) sirve como la transformación de ADN en el experimento de transformación natural (Figura 1). </li></ol> 4. La quitina inducida por transformación natural <ol><li> Crecer V. células cholerae aeróbicamente en medio rico a 30 º C hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 0,5. </li><li> Cosechar las bacterias por centrifugación. Lavar la pella una vez en medio artificial definido (DASW 6) antes de resuspender las células en 2 volúmenes de DASW. Añadir 1 ml de cultivo a 50-80 mg de escamas estéril quitina (como se explica en el punto 1). Si las bacterias puerto plásmido pBR-flp (opcional punto 2), añadir ampicilina (50 mg / ml) a la cultura. Incubar a 30 ° C durante 16-24 h sin movimiento. </li><li> Añadir &amp; ge; 200 ng de la 2 ª ronda de PCR fragmento derivado (que se explica en el punto 3). Mezclar cuidadosamente sin ampliamente separar las bacterias de las superficies de quitina. Incubar a 30 ° C durante 24 horas sin movimiento. </li><li> Vortex la cultura extensamente durante ≥ 30 segundos. Corre 100-300 l selectivos en placas de LB medio (por ejemplo, kanamicina o gentamicina que contienen placas de LB ejemplos proporcionados aquí). El uso de dos placas selectivas si las bacterias albergar el plásmido pBR-flp añadiendo ampicilina concomitantemente a los otros antibióticos. Incubar las placas a 30 ° C durante 16-24 horas o hasta que las colonias son visibles. </li><li> Aislar transformantes individuales de placas selectivas. Tales transformantes han sustituido el locus cromosómico original por el fragmento de PCR debido a un evento de doble entrecruzamiento. Estas cepas se pueden usar directamente para experimentos adicionales en caso de que la eliminación de la casete de antibiótico no es necesario. </li></ol> 5. La eliminación selectiva de casete (s) por Flp-Recombinación <ol><li> Artificialmente transformar sus transformantes con el plásmido pBR-flp como se describe en el punto 2 si no se hace antes de que el ensayo de transformación natural. </li><li> Cultivar las bacterias en placas de agar LB que contenían ampicilina a 37 ° C durante 16-24 h. Opciones: cambiar la temperatura entre el 2-3 hr a 40 ° C, según la expresión de FLP del plásmido pBR-flp se de-reprimidos a altas temperaturas; 5,10 bacterias de transferencia a placas frescas después de aprox. 8 horas de incubación. </li><li> Prueba de sensibilidad a los antibióticos (demostrada aquí para kanamicina; Figura 1) por restreaking los clones en paralelo sobre placas de agar que contienen antibiótico ni antibióticos. Aislar colonias individuales sensibles. Congelar clon resistente a la ampicilina como la acción del glicerol si tiene intención de modificar aún más la tensión con supresión otro / inserción con TransFLP. </li></ol> 6. Curado del plásmido <ol><li> Cultive hasta el día bajo condiciones aeróbicas ya 30 º C. Usar medio rico sin la adición de ningún antibiótico. </li><li> Opcional: Crecer cultivo fresco por 3-6 horas por dilución de 1:100 del cultivo de una noche fresca en medio libre de antibióticos. </li><li> Placa o estría de dilución (s) de cultivo en placa de agar LB sin formato (s) e incubar a 30 ° C durante 8-16 h (hasta que las colonias son visibles). </li><li> Prueba de sensibilidad a la ampicilina de los clones por restreaking los clones en paralelo sobre placas de agar que contienen antibióticos y libre de antibióticos-(Figura 1). Congelar ampicilina cepa sensible como la acción del glicerol. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método TransFLP descrito anteriormente y en otros lugares 5 ha sido ampliamente utilizado en nuestro laboratorio. El tipo de manipulaciones genéticas que son factibles incluyen, entre otros: la supresión de los genes individuales y grupos de genes, la supresión de las islas genómicas (por ejemplo, VPI-1), la inserción de secuencias de aguas arriba de un gen de interés (por ejemplo, secuencias de promotor) y la inserción de secuencias en el extremo de un gen específico (por ejemplo,</e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> La quitina escamas </td><td> Sigma </td><td> C9213 </td><td> Autoclave necesario </td></tr><tr><td> OPCIONAL: Micropulser (en caso de casete antibiótico debe ser extirpado por recombinasa Flp codificada en pBR-flp) </td><td> Biorad </td><td> 165-2100 </td><td> O electroporators comparables </td></tr></tbody></table>

transflp - un método para modificar genéticamente<em&gt; vibrio cholerae</em&gt; sobre la base de la transformación natural y la recombinación flp

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Hay varios métodos disponibles para manipular los cromosomas bacterianos 1-3. La mayoría de estos protocolos se basan en la inserción de plásmidos replicativos condicionalmente (por ejemplo, albergar replicones pir-dependientes o sensibles a la temperatura 1,2). Estos plásmidos se integran en los cromosomas bacterianos basado en la recombinación mediada por homología. Tales mutantes de inserción son a menudo utilizados directamente en la configuración experimental. Alternativamente, la selección para la escisión del plásmido seguido por su pérdida puede ser realizado, para que las bacterias Gram negativas a menudo se basa en la enzima sacarasa contraseleccionable levano codificada por el gen sacB 4. La escisión puede restaurar el genotipo pre-inserción o resultado en un intercambio entre el cromosoma y la copia codificada por plásmidos del gen modificado. Una desventaja de esta técnica es que requiere mucho tiempo. El plásmido tiene que ser clonado primero, que requiere la transferencia horizontal en V. cholerae más (n<html> otably en el apareamiento con una E. coli cepa donante) o transformación artificial de este último, y la escisión del plásmido es aleatoria y puede restaurar el genotipo inicial o crear la modificación deseada si no hay selección positiva se ejerce. Aquí, se presenta un método para la manipulación rápida de la V. cholerae cromosoma (s) 5 (Figura 1). Este método se basa en TransFLP el recientemente descubierto quitina mediada por la inducción de competencia natural en este organismo representante 6 y otro del género Vibrio, como V. fischeri 7. Competencia natural permite la captación de ADN libre incluyendo fragmentos de ADN generados por PCR. Una vez absorbido, el ADN se recombina con el cromosoma dada la presencia de un mínimo de 250-500 pb de la región homóloga flanqueante 8. Incluyendo un marcador de selección en-entre estas regiones flanqueantes permite la fácil detección de los transformantes que ocurren con frecuencia. t &quot;&gt; Este método se puede utilizar para diferentes manipulaciones genéticas de V. cholerae y bacterias naturalmente competentes también potencialmente otros. Proporcionamos tres ejemplos novedosos en lo que puede lograrse por este método, además de nuestro estudio publicado anteriormente sobre las supresiones de genes individuales y el Además de las secuencias de etiqueta de afinidad-5. Varios pasos de optimización sobre el protocolo inicial de quitina inducida por transformación natural 6 se incorporan en este protocolo TransFLP. Estos incluyen entre otros la sustitución de fragmentos de conchas de cangrejo por comercialmente disponible quitina copos 8, la donación de PCR derivado de ADN como la transformación de material 9, y la adición de sitios diana de recombinación FLP-(FRT) 5. sitios FRT permitir la escisión dirigida a sitio del marcador de selección mediada por la recombinasa Flp 10.

Los resultados representativos de los tres ejemplos que se muestran en las Figuras 4 a 6. El primer enfoque dirigido a eliminar los genes vecinos ctxA y ctxB. Juntos codifican el factor de virulencia de V. cholerae, la toxina del cólera. Hemos diseñado oligonucleótidos para el método TransFLP como se ha descrito anteriormente y según la figura 3. La cepa parental, la cepa intermedia albergar el casete FRT-flanqueado resistencia a los antibióticos en el locus d...

Un método rápido para modificar el genoma de<em&gt; V. cholerae</em&gt; Se describe. Estas modificaciones incluyen la supresión de los genes individuales, grupos de genes y las islas genómicas, así como la integración de secuencias cortas (por ejemplo, elementos promotores o secuencias de etiqueta de afinidad-). El método se basa en la transformación natural y recombinación FLP-.

TransFLP - Un método para modificar genéticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sobre la base de la transformación natural y la recombinación FLP

Existen diversos métodos disponibles para manipular cromosomas bacterianos1-3. La mayoría de estos protocolos se basan en la inserción de plásmidos replicativos condicionales...

El objetivo de este procedimiento es manipular genéticamente *Vibrio crassostreae* mediante este método rápido e ineficiente, que se basa en la transformación natural y la combinación de fragmentos. Esto se logra primero preparando una fuente adecuada de quitina, ya que la quitina es el inductor natural de la transformación. En un segundo paso, se genera un constructo de ADN mediante dos rondas de PCR y se lleva a cabo su transformación natural, permitiendo que las bacterias que contienen el plásmido PBR flip incorporen el fragmento de PCR en sus genomas.A continuación, se utiliza un aumento de temperatura para inducir la enzima lipasa codificada por el plásmido y eliminar el casete de resistencia al antibiótico flanqueado por el sitio de recombinación FRT (flip recombination target). En la etapa final, se elimina el plásmido que codifica la FLP de las bacterias. Finalmente, se emplea PCR y secuenciación para demostrar que la manipulación genética fue exitosa.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso de plásmidos suicidas para manipular genéticamente vire, es que este método es muy rápido y eficiente. Comience pesando muestras de 50 a 80 miligramos de escamas de quitina en tubos plásticos estándar de 1,5 mililitros; luego, manteniendo las tapas de los tubos abiertas, autoclave las escamas y, tan pronto como el autoclave haya finalizado, cierre inmediatamente las tapas y almacene las escamas autoclavadas a temperatura ambiente. Se requieren al menos seis oligonucleótidos para amplificar por PCR las regiones de ADN de interés, así como el casete de antibiótico flanqueado por FRT. También se recomienda incluir un par de cebadores de oligonucleótidos fuera del fragmento de PCR insertado.Esto permite verificar la integración y la excisión correcta del casete de resistencia a antibióticos flanqueado por FRT, utilizando con cuidado los oligonucleótidos número dos, número tres, número cuatro y número cinco. Los cebadores dos y cinco deben contener al menos 28 pares de bases para poder hibridarse suficientemente con el ADN genómico y los cebadores. Los cebadores tres y cuatro deben construirse utilizando un plásmido que contenga FRT como molde, y diseñar los cebadores dos y cinco para permitir un apareamiento extenso de bases complementarias en el extremo 5' entre los cebadores dos y tres, y entre los cebadores cuatro y cinco, respectivamente.Ahora, para la primera ronda de PCR, utilice los oligonucleótidos uno y dos para preparar la primera de tres reacciones de PCR simultáneas pero independientes, con el fin de amplificar la región upstream de la región experimental de interés en los constructos diseñados personalizados. En paralelo, prepare la segunda reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos tres y cuatro para amplificar el casete de antibiótico flanqueado por FRT. Por ejemplo, en este experimento, se utilizó el gen A PH que codifica resistencia a canamicina.Amplifique simultáneamente la región de ADN adyacente mediante la preparación de una tercera reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos cinco y seis y el ADN genómico como molde. Luego, tras la purificación de los tres fragmentos de PCR, inicie la reacción de PCR para las tres muestras; utilice una mezcla con cantidades iguales de los tres fragmentos obtenidos en la primera ronda como molde para realizar una segunda ronda de PCR. Esta amplificación será catalizada por los oligonucleótidos uno y seis.El fragmento de PCR resultante servirá como ADN transformante en los experimentos de transformación natural. Después de cultivar las células de V. cholerae, medio enriquecido aeróbicamente a 30 grados Celsius. Recoger las bacterias por centrifugación a temperatura ambiente.A continuación, transfiera el cultivo bacteriano en forma de escamas al cometa e incube la suspensión celular durante la noche a 30 grados Celsius. Luego, mezcle cuidadosamente al menos 200 nanogramos de los fragmentos obtenidos en la segunda ronda de PCR en la suspensión de células bacterianas. Teniendo cuidado de no despegar extensamente las bacterias de las superficies de quitina, incube esta solución a 30 grados Celsius sin agitación durante otro día.Ahora, agite en vórtice la cultura vigorosamente durante al menos 30 segundos; siembra de 100 a 300 microlitros de la solución celular sobre placas doblemente selectivas que contienen ampicilina, además del otro antibiótico presente en las placas. Incube los cultivos bacterianos a 30 grados Celsius hasta que sean visibles las colonias. Aísle luego los transformantes individuales a partir de las placas selectivas.Comience este paso cultivando las bacterias en placas de agar LB que contengan ampicilina a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Como paso opcional, cambie la temperatura durante dos a tres horas a 40 grados Celsius, ya que la expresión de flip a partir del plásmido PBR flip se desrepresiona a temperaturas más altas. Después de ocho horas adicionales de incubación a 37 grados Celsius, transfiera las bacterias a placas frescas.Ahora, restringir los clones en paralelo en placas de agar que contienen antibiótico y placas libres de antibiótico para evaluar la sensibilidad a antibióticos, y luego aislar una sola colonia sensible al antibiótico resultante. Comience este paso cultivando la cepa durante la noche en condiciones aeróbicas a 30 grados Celsius, en medio enriquecido sin antibióticos. A la mañana siguiente, cultive una nueva cepa durante tres a seis horas diluyendo la cepa nocturna en una proporción de uno a 100 en medio fresco sin antibiótico. Por la tarde, realice una siembra por estría o una dilución en placa de la cepa en placas de agar LB simples, e incube las placas durante otras ocho a 16 horas a 30 grados Celsius hasta que las colonias sean visibles.En este primer experimento dirigido a eliminar los genes vecinos CTXA y CTXB. Los oligonucleótidos para el método trans flip se generaron tal como se acaba de demostrar; la cepa parental, la cepa intermedia que portaba el casete de resistencia a antibióticos flanqueado por secuencias FRT en lugar del locus de ADN original de C-T-X-A-B y la cepa final, eliminada para C-T-X-A-B y libre del casete de resistencia, se analizaron todas para determinar su genotipo. Se realizó PCR en bloque para este experimento utilizando cebadores que no se unían al fragmento de PCR transformante, sino únicamente al ADN cromosómico. Los fragmentos de PCR se separaron mediante electroforesis estándar en aerogel para determinar su tamaño.En la banda uno, la cepa mundial tipo B de cólera se ubicó en el tamaño esperado del fragmento de 3.143 pares de bases. En la banda dos, el fragmento de PCR derivado de la cepa delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT se ubicó en 3.162 pares de bases.Y en la banda tres, el fragmento delta ctx A B FFR TP CR se ubicó en 1.769 pares de bases en comparación con la escalera de un kb. En el segundo ejemplo, en el cual se eliminó una isla genómica completa, se eligió la isla de patogenicidad de Vibrio uno o VPI uno como objetivo para este experimento. El método trans flip se modificó en dos pasos.Primero, la integración del gen de resistencia a la kanamicina se llevó a cabo mediante un sitio FRT simple al inicio de la isla I. Luego, se realizó una segunda ronda de transformación natural, permitiendo la inserción de un marcador adicional de resistencia a antibióticos, concretamente la resistencia a gentamicina seguida de un segundo sitio FRT al final de la isla de patogenicidad. Los pares de cebadores respectivos se indican encima de cada imagen de gel, y el método trans FLP continuó como se acaba de demostrar.Las cepas parental, intermedia y final se verificaron mediante PCR del ADN genómico purificado en la banda uno. El fragmento de PCR de la cepa silvestre de V. cholerae se corrió en la banda dos. Se corrió el fragmento de PCR resultante de la cepa VPI uno FRT con GM FRT.Y en la banda tres, se analizó el producto de PCR derivado de la cepa delta VPI uno FRT. Los pares de cebadores se indican encima de cada imagen del gel. La cepa final carece de todo el VPI uno.En este tercer ejemplo, una secuencia promotora dependiente de la ARN polimerasa T siete se integró en posición ascendente con el gen T fox, un regulador principal de la transformación natural, utilizando el método trans flip con una ligera modificación respecto al protocolo estándar. La secuencia consenso del promotor dependiente de la ARN polimerasa T siete se incluyó como extremos salientes en los oligonucleótidos número cuatro y número cinco, de forma que esta secuencia de ADN se mantuviera dentro del cromosoma. Incluso después de que se eliminara el casete de resistencia al antibiótico, el constructo se integró entonces en una cepa de V colorizada que contenía la ARN polimerasa T siete.En esta cepa, la expresión del gen de la polimerasa de ARN T siete fue controlada por el promotor LAC UV cinco para evaluar la expresión dependiente de la polimerasa de ARN T siete del gen T Fox. Los ensayos de transformación natural se realizaron en medio LB. La cepa parental, que carece del promotor dependiente de T siete antes del gen T Fox, no es naturalmente transformable bajo estas condiciones debido a la ausencia de transcripción de T FOX en medio rico y en ausencia del inductor natural quitina. Este fenotipo fue independiente de si la polimerasa de ARN T siete fue inducida artificialmente mediante IPTG o no.Sin embargo, la cepa con el cambio trans generado, que contiene el promotor dependiente de la ARN polimerasa T7 upstream del gen de competencia T Fox, fue efectivamente naturalmente transformable en medio enriquecido debido al escape del promotor LAC UV cinco en medio LB. La ARN polimerasa T7 producida ya transcribió T FOX desde el promotor dependiente de la ARN polimerasa T7 sin inducción por IPTG. Esto inició la competencia natural y la transformación, confirmando la funcionalidad de la secuencia del promotor dependiente de la ARN polimerasa T7 integrada.Este fenotipo se vio significativamente potenciado mediante la inducción completa de la ARN polimerasa T7 debido a la adición del inductor del promotor LAC UV5, IPTG. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo manipular genéticamente Vibrio cholerae utilizando una combinación de transformación natural inducida por quitina y recombinación tipo flip. Una vez dominada, esta técnica le permite eliminar genes o islas genómicas, así como integrar secuencias de ADN de manera dirigida a un sitio específico en tan solo unos pocos días.

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