TransFLP - Un método para modificar genéticamente Vibrio cholerae Sobre la base de la transformación natural y la recombinación FLP

El objetivo de este procedimiento es manipular genéticamente el cráneo mediante este método rápido y deficiente, que se basa en la transformación natural y la combinación de volteo. Esto se logra preparando primero una fuente adecuada de quitina, ya que la quitina es el inductor natural de la transformación. Durante el segundo paso, se genera una construcción de ADN utilizando dos rondas de PCR y se realiza su transformación natural, lo que permite que el plásmido PBR que contiene bacterias absorba el fragmento de PCR y se incorpore a sus genomas.

A continuación, se utiliza un cambio ascendente de temperatura para inducir la enzima lipasa codificada por plásmido para la eliminación del objetivo de recombinación invertida o del casete de resistencia a los antibióticos flanqueado por el sitio FRT. En el paso final, las bacterias se curan del plásmido que codifica para FLP. En última instancia, la PCR y la secuenciación se utilizan para demostrar que la manipulación genética fue exitosa.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de plásmidos suicidas para manipular genéticamente vire, es que este método es muy rápido y eficiente. Comience pesando muestras de 50 a 80 miligramos de copos de quitina en tubos de plástico estándar de 1,5 mililitros, luego mantenga las tapas de los tubos abiertas, autoclave los copos después de que el autoclave haya llamado, cierre inmediatamente las tapas y almacene el kit de autoclave en escamas a temperatura ambiente, se requieren al menos seis oligonucleótidos para amplificar las regiones de ADN de interés, así como el casete de antibiótico FRT flanqueado por PCR. También se recomienda incluir un par de cebadores de oligonucleótidos fuera del fragmento de PCR insertado.

Esto permite comprobar con cuidado la integración y la correcta escisión del diseño del casete de resistencia a antibióticos flanqueado por FRT, los oligonucleótidos número dos, tres, cuatro y cinco. Los cebadores dos y cinco deben contener al menos 28 pares de bases para poder arrodillarse lo suficiente ante el ADN genómico y los cebadores. Tres y cuatro deben construirse con una FRT que contenga plásmido como base de diseño de los cebadores dos y cinco para permitir un amplio emparejamiento de bases complementarias en el extremo de los cinco cebadores entre los cebadores dos y tres y los cebadores cuatro y cinco respectivamente.

Ahora, para la primera ronda de PCR, use los oligonucleótidos uno y dos para preparar la primera de tres reacciones de PCR simultáneas pero independientes para la amplificación de la región aguas arriba de la región experimental de interés de las construcciones diseñadas a medida. Paralelamente, prepare la segunda reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos tres y cuatro para amplificar el casete de antibiótico flanqueado por FRT. Por ejemplo, en este experimento, se utilizó el gen PH A que codifica para la resistencia a la canina.

Amplifique concomitantemente la región de ADN aguas abajo preparando la tercera reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos cinco y seis y el ADN genómico como plantilla. A continuación, inicie la reacción de PCR para las tres muestras después de la purificación de los tres fragmentos de PCR, utilice una mezcla con cantidades iguales de los tres fragmentos obtenidos en la primera ronda como plantilla para realizar una segunda ronda de PCR. Esta amplificación será catalizada por los oligonucleótidos uno y seis.

El fragmento de PCR resultante servirá como ADN transformador en los experimentos de transformación natural. Después de cultivar células v cólera, medio enriquecido aeróbicamente a 30 grados centígrados. Recolecta las bacterias por centrifugación a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera el cultivo bacteriano a la cometa en copos e incube la suspensión celular durante la noche a 30 grados centígrados. A continuación, mezcle cuidadosamente al menos 200 nanogramos de los fragmentos derivados de la PCR de la segunda ronda en la suspensión de células bacterianas. Teniendo cuidado de no separar extensamente las bacterias de las superficies de quitina, luego incube esta solución a 30 grados centígrados sin movimiento durante otro día.

Ahora en vórtice, el cultivo vigoroso durante al menos 30 segundos para las bacterias que albergan el plásmido flip PBR extendió de 100 a 300 microlitros de la solución celular en placas selectivas dobles que contienen ampicilina. Además del otro antibiótico en las placas, incube los cultivos de células bacterianas a 30 grados centígrados hasta que las colonias sean visibles. A continuación, aísle los transformantes individuales de las placas selectivas.

Comience este paso cultivando las bacterias en placas de agar LB que contienen ampicilina a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Como paso opcional, cambie la temperatura durante dos o tres horas a 40 grados centígrados, ya que la expresión de volt del plásmido flip PBR se reprime a temperaturas más altas. Después de ocho horas más de incubación a 37 grados centígrados, transfiera las bacterias a platos frescos.

Ahora restrinja los clones en paralelo en placas de agar que contengan antibióticos y no estén libres de antibióticos para probar la sensibilidad a los antibióticos y luego aísle una sola colonia sensible a los antibióticos resultante. Comience este paso cultivando el cultivo durante la noche en condiciones aeróbicas a 30 grados centígrados, enriqueciendo el medio sin antibióticos. A la mañana siguiente, cultive un nuevo cultivo durante tres a seis horas diluyendo el cultivo durante la noche en una proporción de uno a 100 en un medio fresco libre de antibióticos por la tarde, rayando o diluyendo el cultivo en placas de agar LB simples, y luego incube las placas durante otras ocho a 16 horas a 30 grados Celsius hasta que las colonias sean visibles.

En este primer experimento se pretendía eliminar los genes vecinos CTXA y CTXB. Los oligonucleótidos para el método trans flip se generaron como se acaba de demostrar la cepa parental, la cepa intermedia que alberga el casete de resistencia a antibióticos flanqueado por FRT en lugar del locus de ADN original de C-T-X-A-B y la cepa final delecionada para C-T-X-A-B y liberada del casete de resistencia se probaron para su genotipo. Se realizó PCR al por mayor para este experimento utilizando cebadores que no se arrodillaron ante el fragmento de PCR transformante, pero solo al ADN cromosómico. Los fragmentos de PCR se separaron mediante electroforesis de aerogel estándar para determinar su tamaño.

En el carril uno, la cepa mundial de cólera tipo B se localizó con el tamaño de fragmento esperado de 3.143 pares de bases. En el carril dos, el fragmento de PCR derivado de la cepa delta C-T-X-A-B-F-R-T puede. FRT se ubicó en 3, 162 pares de bases.

Y en el carril tres, el fragmento delta ctx A B FFR TP CR se ubicó en 1.769 pares de bases en comparación con la escalera de un KB. En el segundo ejemplo en el que se eliminó una isla genómica completa, se eligió como objetivo para este experimento la isla de patogenicidad de Vibrio o VPI. El método trans flip se modificó en dos pasos.

En primer lugar, la integración del gen de resistencia a la kanamicina fue procedida por un solo sitio FRT al comienzo de PI uno. A continuación, se realizó una segunda ronda de transformación natural, lo que permitió la inserción de un marcador de resistencia a los antibióticos adicional, a saber, la resistencia a la gentamicina, seguida de un segundo sitio FRT al final de la isla de patogenicidad. Los respectivos pares de cebadores se indican encima de cada imagen de gel y se continuó con el método trans FLP como se acaba de demostrar.

Las cepas parentales, intermedias y finales se verificaron por PCR del ADN genómico purificado en el carril uno. El fragmento de PCR de la cepa silvestre de cólera tipo V se ejecutó en el carril dos. Se ejecutó el fragmento de PCR resultante de la cepa VPI un FRT puede GM FRT.

Y en el carril tres, se analizó el producto de PCR derivado de la cepa delta VPI one FRT. Los pares de imprimaciones se indican encima de cada imagen de gel. A la cepa final le falta toda la VPI.

En este tercer ejemplo, una secuencia promotora dependiente de ARN polimerasa T seven se integró aguas arriba con el gen T fox, un importante regulador de la transformación natural utilizando el método trans flip con una ligera modificación del protocolo estándar. La secuencia de consenso del promotor dependiente del ARN T siete se incluyó como salientes en los oligonucleótidos número cuatro y número cinco, de modo que esta secuencia de ADN se mantuvo dentro del cromosoma. Incluso después de que se extirpó el casete de resistencia a los antibióticos, la construcción se integró en una cepa coloreada de ARN T siete que contenía V.

En esta cepa, la expresión del gen de la ARN polimerasa T seven fue impulsada por el promotor LAC UV five para probar la expresión dependiente de la ARN polimerasa T seven de T Fox. Se realizaron ensayos de transformación natural en medio LB. La cepa parental que carece del promotor dependiente de T seven que precede al gen T Fox no es transformable naturalmente en estas condiciones debido a la falta de transcripción de T FOX en medio rico y en ausencia de su inductor natural, la quitina. Este fenotipo fue independiente de si la ARN polimerasa T seven fue inducida artificialmente por IPTG o no.

Sin embargo, la cepa generada por trans flip, que contiene el promotor dependiente de la ARN polimerasa T seven aguas arriba del gen de competencia T Fox, era de hecho un medio enriquecible transformable de forma natural debido a la fuga del promotor LAC UV five en el medio LB. La ARN polimerasa T seven producida ya transcribió T FOX del promotor dependiente de la ARN polimerasa T seven sin inducción por IPTG. Esto inició la competencia natural y la transformación, confirmando la funcionalidad de la secuencia promotora dependiente de la ARN polimerasa T siete integrada.

Este fenotipo se mejoró significativamente con la inducción completa de la ARN polimerasa T seven debido a la adición del inductor del promotor LAC UV five IPTG. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular genéticamente el cólera VI utilizando una combinación de transformación natural inducida por quitina y recombinación inversa. Una vez dominada, esta técnica le permite eliminar genes o islas genómicas, así como integrar secuencias de ADN de una manera dirigida al sitio en solo unos pocos días.