El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo

El objetivo de este experimento es demostrar la visualización de la dinámica y los patrones de localización de proteínas in vivo en embriones de drosófila vivos mediante microscopía confocal de intervalos. Esto se logra primero recolectando embriones de cepas mantenidas de drosófila. A continuación, se transfieren los embriones a un portaobjetos y luego se eliminan manualmente las cubiertas de los embriones para obtener embriones desovillados.

A continuación, se montan de forma organizada en portaobjetos previamente preparados y, según el experimento, pueden ser microinyectados con los reactivos adecuados para inducir el punto de control del huso. El paso final de este procedimiento consiste en realizar imágenes de lapso de tiempo de embriones mediante microscopía confocal. En última instancia, la microscopía de lapso de tiempo y focal se utiliza para mostrar la proteína del punto de control del huso, la colocalización de los cromosomas, sus comportamientos y el efecto de agentes inductores del punto de control en líneas transgénicas de oph relacionadas con el punto de control.

El método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de regulación del ME, como el efecto de las mutaciones o depleciones de la proteína del punto de control del huso mediante el uso de líneas génicas sobre la colocalización de otros componentes del punto de control, y la consecuencia de esto sobre la capacidad del punto de control de ensamblaje del huso para funcionar eficientemente. Las moscas transgénicas se mantienen a 25 grados Celsius en viales de plástico que contienen alimento para moscas, y con polvo adicional de levadura seca en la parte superior. El vial se reemplaza rutinariamente cada dos o tres semanas, dependiendo de las condiciones de crecimiento.

Para preparar el alimento para moscas, caliente una cantidad adecuada de la mezcla de alimento para moscas con agitación constante para disolver los componentes utilizando una bomba peristáltica, y distribuya de ocho a 10 mililitros de este medio en forma de suspensión en cada vial de plástico. Cuando la suspensión de alimento haya solidificado y alcanzado la temperatura ambiente, tape cada vial con un tapón de espuma de algodón. Coloque estos viales con alimento en una bandeja, ciérrelos en una bolsa de plástico y almacénelos a cuatro grados Celsius para una recolección de huevos a pequeña escala.

Transfiera aproximadamente 50 pares de moscas adultas de dos a tres días de edad a un vial fresco con alimento para moscas, que contenga polvo adicional de levadura seca en su superficie para la puesta de embriones. Incube a 25 grados Celsius, temperatura mantenida en este caso por el aire acondicionado. Cada hora, transfiera las moscas a un vial nuevo y deje los embriones durante 30 minutos.

Para asegurarse de que algunos de los embriones recolectados se encuentren alrededor del ciclo de división nuclear ocho a diez. Normalmente se descarta la recolección de la primera hora, ya que suele contener embriones envejecidos que se retuvieron en los cuerpos de las hembras cuando las condiciones no eran adecuadas para la puesta. Por lo tanto, solo se utilizarán en estos experimentos embriones a partir de la transferencia de la segunda hora en adelante.

Se utilizan portaobjetos y cubreobjetos de 50 por 22 milímetros para este procedimiento. Comience tomando un cubreobjetos y humedezca ligeramente las cuatro esquinas de un lado con una pequeña cantidad de agua, utilizando un pincel fino y húmedo. Coloque el cubreobjetos sobre un portaobjetos.

La tensión superficial capilar causada por la película líquida delgada debería impedir que la cubreobjetos se mueva. Aplique una tira delgada de pegamento de heptano a través del centro de la cubreobjetos. El heptano debería evaporarse en segundos, dejando el pegamento sobre la cubreobjetos.

A continuación, utilice un lápiz de diamante para cortar otro cubreobjetos en pequeños cuadrados de aproximadamente 1,5 milímetros cuadrados. Tome un cuadrado y colóquelo en uno de los extremos de la tira de pegamento. Este se utilizará para abrir la punta de la aguja cuando sea necesario realizar microinyecciones.

Tome otro portaobjetos y pegue un trozo de cinta adhesiva doble cara de dos centímetros de largo; luego retire el papel protector para comenzar el procedimiento de recubrimiento de embriones. Transfiera las moscas a un vial fresco con alimento, utilizando un pincel fino y húmedo. Transfiera aproximadamente 50 huevos a la cinta adhesiva doble cara sobre el portaobjetos preparado.

Utilice una cantidad adecuada de líquido para permitir que los huevos se extiendan. Cuando el líquido se haya evaporado, los huevos quedarán adheridos a la cinta bajo un microscopio estereoscópico. Toque suavemente los huevos varias veces a lo largo de su eje longitudinal con el lado exterior de una de las puntas de un par de pinzas hasta que se rompa y abra el Corian.

Deje el embrión en la cáscara de Corian para prevenir la deshidratación rápida. Continúe este proceso hasta que se hayan tratado de 10 a 20 huevos. A continuación, tome los embriones, retírelos uno por uno de la cáscara de Corian y colóquelos suavemente en una tira vertical.

En la tira de pegamento. Alinee los embriones con el lado largo antiparalelo al lado largo de la tira de pegamento. Coloque los embriones en una cámara de desecación durante tres a ocho minutos.

Finalmente, cubra los embriones con una cantidad adecuada de aceite de volter para tenis para evitar la deshidratación excesiva antes de la microinyección. La microingestión es el aspecto más difícil de este procedimiento. Para hacer la microingestión lo más sencilla y eficiente posible, se debe seguir el protocolo específico para la preparación ligera.

Los embriones deben prepararse cuidadosamente para que se encuentren en condiciones óptimas para la microingestión. Las agujas para la microinyección de embriones se preparan previamente. Utilizando una punta fina de carga, rellene por retroceso una aguja con uno o dos microlitros de una concentración adecuada del reactivo en tampón de inyección.

Monte la aguja en el portaagujas de un microscopio confocal invertido Leica TCSP dos con el tubo de presión conectado al sistema de control de inyección. Localice un embrión bajo el objetivo de 40 aumentos. A continuación, encuentre la sombra de la aguja sin cambiar el plano focal.

Esto se logra moviendo la aguja hacia el centro del campo de visión y bajándola gradualmente hasta el plano focal adecuado. Mueva muy suavemente la platina del microscopio para localizar el pequeño cuadrado de cubreobjetos previamente montado en un extremo de la tira de pegamento. Desplace la punta de la aguja muy suavemente hasta que toque el borde del pequeño cubreobjetos cuadrado y lo rompa ligeramente.

Mueva la platina para que los embriones vuelvan a entrar en el campo visual y seleccione un embrión de la edad adecuada para la inyección. Acerque cuidadosamente el embrión a la aguja y reajuste el plano focal tanto para el embrión como para la aguja. Introduzca el embrión en la aguja.

Introduzca una gota de reactivo en el lateral del embrión y luego desplace el embrión. Se obtienen imágenes de intervalos de tiempo o imágenes individuales de embriones vivos mediante un sistema de microscopía confocal invertida Leica TCSS SP dos con un objetivo de inmersión en aceite de 40 aumentos. Al obtener imágenes de múltiples fluoróforos que tienen espectros solapados y están coexpresados en el mismo embrión, se recoge secuencialmente la longitud de onda de emisión de cada proteína fluorescente.

Las imágenes aparecieron posteriormente al configurar los intervalos de tiempo para la obtención de imágenes de lapso de tiempo. Estos factores deben tenerse en cuenta. Comúnmente, se obtiene una sola imagen como promedio de dos líneas de escaneo.

Con un promedio de dos escaneos de cuadro, se requiere un mínimo de 6,3 segundos para escanear una imagen de cinco por doce por cinco por doce píxeles en modo de escaneo simultáneo y 15,44 segundos en modo de escaneo secuencial, a fin de obtener una buena relación señal-ruido. El diafragma de pinza se ajusta normalmente entre una y dos au o unidades de Airy, y la potencia del láser se regula al nivel más bajo posible para evitar cualquier fotoblanqueo significativo. Esta película representativa de lapso de tiempo muestra la reclutación dinámica del núcleo cinético de CDC 20 y el movimiento cromosómico en embriones vivos de ophs in cial.

Se tomaron imágenes de lapso de tiempo de un embrión transgénico inicial que expresa simultáneamente GFP-CDC20, mostrado en verde, y RFP histona 2B, mostrado en rojo. Durante los ciclos de división nuclear, se capturaron siete u ocho cuadros cada 10 segundos, y el cuadro en el que las células ya se encuentran en profase se considera el punto de tiempo cero. Esta figura muestra los cuadros del video de lapso de tiempo; GFP-CDC20 puede observarse fácilmente en los cinetocoros de profase y prometafase, como indican las flechas blancas en las imágenes tres y cuatro, respectivamente, y persiste en los cinetocoros de metafase y anafase, tal como se observa en las imágenes cinco y seis, respectivamente.

La G-F-P-C-D-C 20 está excluida del núcleo interfásico indicado por la cabeza de flecha blanca en la imagen uno y entra al núcleo en profase temprana, como se muestra en la imagen dos. En las imágenes ocho a 14, las morfologías de la cromatina se determinaron utilizando la histona RFP dos B expresada conjuntamente como marcadores fusionados. Las imágenes se muestran en la fila inferior.

Utilizando este protocolo, se pueden estudiar las funciones del punto de control de la ensambladura del huso o SAC mediante la manipulación de embriones mediante microinyección de anticuerpos, proteínas marcadas con fluorescencia o compuestos químicos de interés que potencialmente activan el SAC. En este ejemplo, los embriones se tratan con colchicina para despolimerizar los microtúbulos, provocando así el SAC. Se utilizan GFP CDC 20 o GFP MAD2. Se emplearon dos señales nucleares cinéticas como marcadores de la progresión del ciclo celular.

En el panel superior, las ARES indican los esci detenidos en las imágenes dos a seis. El área marcada con una flecha en la imagen uno indica el estado antes del tratamiento con colchicina, en el que G-F-P-C-D-C 20 queda excluido del núcleo en interfase tardía. Las imágenes del panel central muestran que en ausencia de MAD endógeno dos, G-F-P-C-D-C 20 indicado por flechas en las imágenes siete a doce continúa oscilando hacia dentro y fuera del núcleo, así como hacia arriba y abajo del cinetocoro.

Aunque la citocinesis parece estar defectuosa, esto sugiere una función fallida del SAC en detener las células en respuesta al tratamiento con colchicina. Un ejemplo de separación fallida del núcleo hija se observa en la imagen 10. Finalmente, en el panel inferior, las puntas de flecha en las imágenes 14 a 18 indican núcleos cinéticos en reposo con acumulación de las proteínas de fusión GFP MA dos, lo que sugiere que el GFP MA dos funcional rescata el fenotipo de defecto sac en el embrión mutante MA dos.

La flecha en la imagen 13 indica la acumulación de GFP MAD2 en un núcleo en una fase tardía de interfase. Tras ver estos videos, deberías tener una buena comprensión de cómo cosechar los embriones de Drosophila utilizando los pedúnculos, descoordinar manualmente los embriones antes de preparar las láminas para la microingestión y realizar imágenes en vivo con microscopía confocal.