GC-basado en la detección de ácido Aldononitrile acetato derivado de glucosamina y murámico de la determinación de residuos microbiana en el suelo

El objetivo general de este video es proporcionar una descripción detallada del análisis mediante GC de los derivados de acetato de aldonitrilo de glucosamina y ácido muico extraídos de suelos. El proceso comienza con la digestión ácida, que descompone los polímeros orgánicos y libera glucosamina y ácido muico. Luego, los monómeros de azúcares amino se aíslan y purifican a partir de la solución de mezcla.

A continuación se realiza la derivatización para convertir esos azúcares amino en acetatos de aldonitrilo volátiles para el análisis mediante cromatografía de gases. El paso final del procedimiento es la extracción líquido-líquido y la determinación por GC. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran una separación en la línea base de los azúcares amino en forma de acetatos de aldonitrilo, que eluyen entre los patrones de myo y acetol y glutamina metílica, mediante GC con detección por ionización de llama.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos es que equilibra de forma óptima la precisión, sensibilidad, simplicidad, separación cromática gráfica y estabilidad durante el almacenamiento de las muestras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del ciclo global del carbono, como la contribución de los microorganismos SSE a los reservorios de carbono estable en el suelo. Aunque este método puede proporcionar información sobre la acumulación de detritos microbianos en los suelos, también puede aplicarse en otras matrices, como sistemas oceánicos, tejidos biológicos e incluso muestras extraterrestres.

Para comenzar este protocolo, liofilice las muestras de suelo después de su recolección en campo, y muela y homogenice las muestras de suelo utilizando un molino de bolas o un mortero y mano. Pese las muestras de suelo molidas en frascos de hidrólisis de 25 mililitros. Añada 10 mililitros de ácido clorhídrico seis molar a cada frasco de hidrólisis, y llénelo con gas nitrógeno antes de taparlo firmemente.

Hidrólisis a 105 grados Celsius en una incubadora durante ocho horas. Utilizando un interruptor automático de temporizador, retire los matraces de la incubadora y enfríe a temperatura ambiente.

Añada 100 microlitros de estándar interno myo acetol a cada matraz. Mezcle agitando suavemente y configure embudos de plástico que drenen hacia matraces en forma de pera de 200 mililitros. Utilice uniones esmeriladas de cono estándar tamaño 24/40 colocadas sobre vasos de plástico para mayor estabilidad.

Doble los círculos de papel Watman número dos para filtración cualitativa en cuartos y colóquelos en los embudos. Agite suavemente cada matraz de hidrólisis y vierta la suspensión en el embudo. Para filtrar cada muestra, seque el filtrado utilizando un evaporador rotatorio a aproximadamente 45 grados Celsius aplicando vacío.

Suspenda el residuo seco de cada matraz emparejado con tres a cinco mililitros de agua y viértalo en un tubo de teflón de 40 mililitros. Enjuague cada matraz con una segunda alícuota de agua. Ajuste el pH de las muestras a entre 6,6 y 6,8 utilizando una solución unimolar de hidróxido de potasio para precipitar iones metálicos y otras moléculas orgánicas. Luego, elimine los precipitados mediante centrifugación a 2000 ×g durante 10 minutos tras la centrifugación.

Vierta los sobrenadantes en tubos de vidrio de 40 mililitros y cubra las aberturas de los tubos con paraform. Congele los sobrenadantes y luego haga agujeros en el paraform. Liofilice los sobrenadantes congelados para eliminar todo el líquido. Una vez que los sobrenadantes se hayan secado, disuelva el residuo con tres mililitros de metanol seco.

Vortexee bien, tape las tubos y luego centrifugue a 2000 veces G durante 10 minutos. Para precipitar las sales, transfiera los sobrenadantes a viales cónicos de reacción de tres mililitros y evapore hasta sequedad mediante una máquina VA rápida a 45 grados Celsius o bajo un flujo suave de gas nitrógeno seco. Una vez evaporado, agregue 100 microlitros del estándar de recuperación y metilglutamina, y un mililitro de agua a cada vial.

Luego congele las muestras antes de comenzar la derivatización. Prepare los patrones según se describe en el protocolo escrito y, a continuación, liofilice tanto las muestras como los patrones. Prepare el reactivo de derivatización que contenga 32 miligramos por mililitro de hidroxilamina hidrocloruro y 40 miligramos por mililitro.

Cuatro dimetil amino purina en metanol de purina. Añada 300 microlitros del reactivo de derivatización a cada uno de los viales reactivos, tápelos firmemente y vortexe a fondo. Coloque los viales sellados en un baño de agua de 75 a 80 grados Celsius durante 35 minutos.

Retire los viales del baño de agua y enfríe a temperatura ambiente. Luego, agregue un mililitro de anhídrido acético a cada uno de los viales reactivos de tres mililitros, tápelos firmemente y vortexe a fondo. A continuación, una segunda incubación en un baño de agua de 75 a 80 grados Celsius durante 25 minutos.

Retire los viales del baño de agua y enfríe a temperatura ambiente. Para iniciar la separación y medición, agregue 1,5 mililitros de diclorometano a cada tubo y luego vortex. Después de agregar un mililitro de ácido clorhídrico uno molar a cada vial y agitar completamente mediante vortex, deje reposar las soluciones sin perturbar hasta que las dos fases se separen.

Aspire y deseche la fase acuosa superior. Utilizando un pipeteador de 1000 microlitros de la misma manera, extraiga la fase orgánica tres veces, pero con un mililitro de agua en el último paso de lavado. Tenga especial cuidado para asegurarse de que se haya eliminado toda la fase acuosa superior.

Seque la solución final utilizando un evaporador rápido a 45 grados Celsius o mediante un flujo de gas nitrógeno, disuelva cada muestra en 300 microlitros de acetato de etilo y hexano, y transfiera a viales ámbar de dos mililitros con tapa roscada y un inserto de pequeño volumen, tapando firmemente para su cuantificación mediante cromatografía de gases con detector de ionización de llama, empleando una columna capilar de sílice fundida no polar, como la DB cinco, según se indica en el protocolo escrito. Tras la ejecución y análisis estándar, ajuste el caudal del gas portador de manera que los derivados de acetol glucosamina y ácido mu-ámico eluyan a 250 grados Celsius y la glutamina con extremo metilo eluya a 270 grados Celsius.

Realice una inyección dividida de 30 a 1 de un microlitro con la entrada del CG ajustada a 250 grados Celsius utilizando un muestreador automático posterior al análisis de cromatografía de gases. Y como paso final de este procedimiento, realice la validación del derivado utilizando los métodos de cromatografía y espectrometría descritos en el protocolo escrito. Aquí se muestran ejemplos del análisis de glucosamina y ácido urémico a partir de patrones estándar y de una muestra de suelo; además de glucosamina y ácido muco, se pueden determinar simultáneamente dos isómeros de la glucosamina: la osamina y la galactosamina, mediante el método basado en la cantidad exacta de los patrones aplicados y los factores de respuesta de cada estándar interno.

Se puede determinar la cantidad de estos biomarcadores en las muestras de suelo. El estándar de recuperación también se ha utilizado para monitorear cualitativamente el proceso de derivatización. A continuación se muestran los esquemas de formación de aldonitrilo acetato, glucosamina derivada y ácido muco.

El número uno representa la reacción de nitrilo, y el número dos representa la acetilación. Las estructuras propuestas de los fragmentos iónicos formados mediante ionización por electrones se estudiaron comparando los espectros de iones de las muestras preparadas con diversas incorporaciones de isótopos. Aquí se muestra el desplazamiento de masa del ión dominante del derivado de acetato de nitrilo de aldon glucosamina en diferentes escenarios.

En este ejemplo, se preparó con agentes no marcados, así como con anhídrido acético marcado isotópicamente y glucosamina marcada isotópicamente. El asterisco en la estructura química representa el átomo de isótopo pesado o el grupo isotópico. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener condiciones rigurosamente anhidras durante la derivatización.

Tanto los disolventes orgánicos como el material de vidrio utilizados en esta etapa deben estar secos. Aunque muchos proveedores venden disolventes anhidros, los disponibles pueden secarse pasándolos a través de columnas que contienen agentes desecantes como sulfato de magnesio. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la espectrometría de masas con relación isotópica, con el fin de responder preguntas adicionales, como cómo reaccionan los macroorganismos en el contexto de la belleza, o cómo el carbono o el nitrógeno se transforman y acumulan en los suelos al diferenciar los macroorganismos vivos de los muertos tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la macroecología y la biología y química del suelo exploraran la contribución macro a la materia orgánica del suelo y la secuestración en sistemas terrestres naturales o manejados.