Name: Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a inducir encefalomielitis autoinmune experimental en cepas de ratones resistentes mediante transferencia adoptiva de células de ganglios linfáticos y estimulación antigénica. Este protocolo permite superar mecanismos de resistencia.

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Apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 NS37253 y NS055167 N01) y la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (RG 3288-A6).

1. Preparación CFA-antígeno emulsionado <ol><li> Disolver cobaya MBP (preparado de acuerdo con el método de Swanborg1 y se almacena en forma liofilizada a 4 ° C) en solución tampón de fosfato (PBS) a una concentración de 2 mg / ml. Si sintetizados péptidos MBP (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 se utilizan, preparar una solución de 2 mg / ml. Elaborar una cantidad apropiada de solución de antígeno (0,1 ml por ratón para ser vacunados) en una jeringa de vidrio con luer-lok. </li><li> Elaboración de un volumen de adyuvante completo de Freund H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) igual a la solución de antígeno en otra jeringa de vidrio equipado con Luer-lok. </li><li> Conecte los dos jeringas de vidrio con una llave de tres vías. Mezclar la solución con el Comité de Libertad Sindical MBP empujando los émbolos de ida y vuelta. Mantener el movimiento hasta que se forma una emulsión. </li><li> Para probar si se forma una emulsión, empujar toda la mezcla en una jeringa. Desconecte la jeringa vacía, tire tque el émbolo hacia atrás un poco y descargue una gota de la emulsión residual en un vaso de agua limpia a temperatura ambiente. Si la caída de emulsión permanece intacto en la superficie del agua, se forma una emulsión. Si la caída de la emulsión se dispersa, vuelva a conectar las jeringas y seguir el movimiento de mezcla. </li><li> Utilizar una jeringa de plástico de 1 ml para el proceso de inmunización para asegurar la entrega de una dosis exacta de antígeno. Para transferir la emulsión de antígeno a la jeringa de plástico, saque el émbolo e inserte la jeringa de plástico vacía en la apertura de llave de tres vías donde se desconecta la jeringa de vidrio anterior como en el punto 1.4. </li><li> Llenar la jeringa de plástico a la llanta, empujando el émbolo de la jeringa de vidrio. Insertar el émbolo de la jeringa de plástico hacia atrás y empujar hacia atrás el exceso de emulsión hasta alcanzar la marca de 1,2 ml en la jeringa de plástico. Esta maniobra asegura que ninguna burbuja de aire está atrapado dentro de la jeringa de plástico. </li><li> Retirar la jeringa de plástico de la llave de tres vías. Attach una aguja de calibre # 26 a la jeringa de plástico. Empuje el émbolo hasta la marca de 1 ml de modo que la emulsión ahora llena el volumen vacío de la aguja. </li></ol> 2. La inmunización de ratones donantes Nota: Los ratones hembra C57BL / 6 se suele inyectar una emulsión de antígeno en cuatro sitios en los flancos, siguiendo los métodos diseñados originalmente por el grupo de McFarlin de tres de los Institutos Nacionales de Salud. Para un investigador experimentado, una persona puede realizar toda la tarea. Para los principiantes, la ayuda puede ser solicitada para que una persona tiene el ratón y la otra persona hace de la inyección. Por otra parte, el ratón puede ser anestesiados para la inyección. <ol><li> Sostenga firmemente el ratón por la piel del cuello y contener la cola entre los dedos 4 º y 5 º de tal manera que el tórax y el abdomen son de fácil acceso. </li><li> Colocar la aguja de la jeringa de plástico 1 ml en un sitio en el tórax ligeramente por encima de la axila derecha (de la MOutilizar) e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno por vía subcutánea. Una protuberancia poco del blanquecino CFA puede ser visto a través de la piel pálida. Repetir lo mismo para el sitio en el tórax ligeramente por encima de la axila izquierda. </li><li> Suelte la cola y agarrar el pie derecho (del ratón), enciéndalo y sostenerlo entre el 4 º y 5 º dedos. Busque el sitio justo debajo de la caja torácica en el lado derecho e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno. </li><li> Suelte el pie derecho, gire el ratón hacia otro lado y mantener el pie izquierdo (del ratón) entre los días 4 y 5 º dedos. Localizar el sitio justo debajo de la costilla caso en el flanco izquierdo e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno. </li><li> Cambie a una aguja nueva después de la inyección de 10 ratones, o entorpecido si la aguja se hace. </li></ol> 3. Aislamiento de células de nódulos linfáticos de Cultivo de Tejidos de 7 a 10 días después de la inmunización <ol><li> Siete a 10 días después de la inmunización, el sacrificio de los ratonesy extraer los ganglios linfáticos de drenaje. El método preferido de la eutanasia es por inhalación de CO 2. Después del sacrificio, coloque el cursor sobre su espalda en una tabla de disección con las extremidades estiradas y se fija a la placa con alfileres. Los ratones se humedecen con una pulverización de 70% de etanol. </li><li> Cortar una hendidura en la piel longitudinalmente en el centro desde el extremo inferior del abdomen hasta la barbilla con tijeras y pinzas estériles. </li><li> Cortar la piel del abdomen de la zona de la ingle hasta cada pierna. Despegue y precisar la piel, la exposición de los ganglios linfáticos inguinales. </li><li> Cortar la piel a lo largo de la patas delanteras (izquierda y derecha) para que la piel se puede pelar la espalda y clavado hacia abajo para mostrar los ganglios linfáticos de la axila cerca de las axilas. </li><li> Con dos pares de pinzas que trabajan juntos, alejarse de los tejidos conectivos que cubren y alrededor de los ganglios linfáticos inguinales. Cuando los tejidos conectivos se borran, coloque un par de pinzas en el ganglio linfático y se alejan del cuerpo. Coloque elganglios linfáticos en un plato de Petri de 35 mm lleno de PBS estéril. </li><li> Extraiga los tejidos conectivos que cubren los dos ganglios linfáticos axilares con dos pares de pinzas. Aislar los ganglios linfáticos y colocarlos en la placa de Petri. Tenga mucho cuidado de no romper los vasos sanguíneos que cruzan la zona como el sangrado facilita la identificación de los ganglios linfáticos muy difícil. </li><li> Después de todos los ganglios linfáticos se recogen, mover la placa de Petri con una campana de seguridad biológica. Romper y se burlan de los ganglios linfáticos aparte con los dos pares de pinzas, moler uno contra el otro. Alternativamente, los ganglios linfáticos puede ser roto mediante el extremo plano del émbolo de una jeringa de plástico de 3 ml presionando contra los ganglios linfáticos en la parte inferior de la placa de Petri. </li><li> Pase el nodo linfático bromeó suspensión celular a través de una malla de nylon para eliminar las membranas y escombros. </li><li> Completar el ganglio linfático suspensión de células a 50 ml con PBS estéril. Centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos. Resuspender el precipitado en medio de cultivo. ¿Es viable cell contar y ajustar la concentración de 4 x 10 6 células / ml. UseRPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternero, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico MEM, 0,1 mM MEM no esenciales aminoácidos, 100 penicilina U / ml, estreptomicina 100 mg / ml, 10 mM de tampón Hepes y x 5 10 -5 M 2-ME. Pre-caliente la cultura antes de resuspender las células. </li><li> Cultivar las células en placas de cultivo de 24 pocillos con un volumen de 2 ml por pocillo (concentración final de células 8 x 10 6 células / pocillo). Añadir antígeno a cada pocillo a una concentración final de 100 g / mL. Coloque la placa de cultivo en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Se incuban las células durante 5 días. </li></ol> 4. La recolección cultivadas células de nódulos linfáticos 5 días después del inicio de las Culturas <ol><li> Mezclar las células en cada pocillo pipeteando arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur de vidrio o una pipeta pequeño volumen. Recoger las células a un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Centrifugar las células a 1000 rpm durante 10 minutos. Resuspenden el sedimento celular en un pequeño volumen de PBS. </li><li> Contar las células y ajustar la concentración de células viables a 2,5 x 10 8 células / ml con PBS estéril. Dibujar las células en una jeringa provista de una aguja de calibre # 26. </li><li> Coloque una lámpara de calor sobre la jaula de los ratones receptores para ayudar a dilatar la vena de la cola. </li><li> El uso de un soporte de ratón, extender la cola del ratón a través de la hendidura en el soporte. Tire para extender la cola. Localice la vena. </li><li> Inyectar 0,2 ml / ratón de la suspensión celular, igualando 5 x 10 7 células. </li></ol> 5. Antigénica desafío de los ratones receptores de la célula 20 días después de la transferencia y el desarrollo de los síntomas de la enfermedad <ol><li> Los ratones receptores Challenge que no presentan signos de la enfermedad con el antígeno. Los procedimientos son los mismos que en el apartado 2 sobre &quot;La inmunización de ratones donantes&quot;. </li><li> Observar el desarrollo de la enfermedad paralítica 7 a 10 días después del desafío antigénico. <ol><li> Enfermedad comienza con debilidad en la cola. La enfermedad se clasifica como unacuando la cola se vuelve flácido. La enfermedad se clasifica como 2 cuando el ratón está paralizado en una pata trasera. La enfermedad se clasifica 3 cuando ambos miembros posteriores están paralizadas y el ratón arrastra los dos miembros posteriores al rastrear hacia adelante. La enfermedad se clasifica 4 cuando el ratón pierde uso de ambas extremidades anteriores, dejando el ratón totalmente inmóvil. La enfermedad se clasifica 5 cuando el ratón está moribundo y el cuerpo se curva hacia arriba. La muerte se califica como enfermedad de grado 6 4. </li></ol></li><li> MBP-específica EAE inducida en ratones C57BL / 6 después de este protocolo es monofásica. Los ratones pueden recuperarse de la enfermedad, pero no someterse a las recaídas espontáneas. </li></ol> 6. Los resultados representativos Los ratones que recibieron cebado e in vitro-expandidas células de los ganglios linfáticos de los donantes no desarrollaron síntomas de EAE enfermedades, reflejando su resistencia a la inducción de la enfermedad. Sin embargo, la enfermedad grave desarrollado después del desafío antigénico (Tabla I), demostrando la capacidad de la estimulación antigénicaen revertir el mecanismo de resistencia. Dos características especiales de la estimulación antigénica señalar son las dosis de antígeno y la cinética de reto para provocar la enfermedad. Dosis muy baja de antígeno que se necesita, como se muestra en la Tabla III. Sorprendentemente, los ratones que recibieron células de donantes del año anterior puede todavía desarrollar una enfermedad grave cuando fueron estimulados con el antígeno (Tabla IV). Estas dos observaciones sugieren fuertemente la participación de &quot;larga vida&quot; las células T en el mantenimiento de la resistencia a la EAE. Este protocolo es aplicable a muchas cepas de ratones resistentes a la EAE 4. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3778/3778fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo del diseño experimental para la inducción de la EAE en prestigiosas cepas de ratones resistentes. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> Clínica de EAE después de la transferencia adoptiva </td><td colspan="3"><strong&gt; Clínica EAE después de la estimulación antigénica </td></tr><tr><td> Tensión </td><td> Antígeno </td><td> incidencia </td><td> Av.. la enfermedad de grado (Rango) </td><td> Av.. día de comienzo (Rango) </td><td> Incidencia </td><td> Av.. la enfermedad de grado (Rango) </td><td> Av.. día de comienzo (Rango) </td></tr><tr><td> SJL </td><td> MBP </td><td> 21/21 </td><td> 4.0 (3-5) </td><td> 8.0 (6-10) </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP </td><td> 0/10 </td><td> - </td><td> - </td><td> 7/7 </td><td> 3.85 (3-5) </td><td> 9.28 (9-10) </td></tr><tr><td> Ratones Balb / c </td><td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 5/5 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 7.0 (7) </td></tr><tr><td> C3H/HeJ </td&gt; <td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 8.0 (8) </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP 60-80 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 2.75 (2-4) </td><td> 10.2 (9-11) </td></tr></tbody></table> Tabla I. La inducción de MBP-mediada por la EAE en ratones C57BL / 6. La transferencia adoptiva de la EAE preparada y en las células del donante in vitro, la ampliación no inducir en ratones C57BL / 6. Desafío antigénico después de la transferencia de células prestados los ratones susceptibles a la inducción de la enfermedad. Av.., Promedio. ND, no hacer. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica después de la estimulación antigénica </td></tr><tr><td> Cebado antígeno </td><td> La exposición al antígeno </td><td> Incidencia </td><td> Av.. la enfermedad de grado (Rango)</td><td> Av.. día de comienzo (Rango) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> CFA solos </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> OVA-CFA </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> MBP-MIA </td><td> 3/3 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 7.7 (7-9) </td></tr></tbody></table> Tabla II. La especificidad de una estimulación antigénica. Los ratones receptores fueron desafiados con el antígeno de cebado, así como otros antígenos irrelevantes. Sólo el antígeno cebado inducido enfermedad grave. OVA: ovoalbúmina de pollo. Av.., Promedio. <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica después de la estimulación antigénica </td></tr><tr><td> Dosis de la exposición al antígeno (ug / ratón) </td><td> Incidencia </td><td> Av.. la enfermedad de grado (Rango) </td><td> Av.. día de comienzo (Rango) </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 4/4 </td><td> 3.67 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 4/4 </td><td> 3.25 (3-4) </td><td> 8.25 (7-10) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (8-9) </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.76 (8-9) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4/4 </td><td> 2.5 (2-3) </td><td> 9.75 (9-10) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2/4 </td><td> 1.0 (1.0) </td><td&gt; 16 (14-18) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla III. Dosis de antígeno Challenge necesaria para la inducción enfermedad. Varias concentraciones de MBP se utilizan para desafiar a los ratones receptores fueron probados. Av.., Promedio. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica después de la estimulación antigénica </td></tr><tr><td> La exposición al antígeno </td><td> Día del Desafío </td><td> Incidencia </td><td> Av.. Enfermedades de grado (Rango) </td><td> Av.. Día de inicio (Rango) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 5 </td><td> 3/4 </td><td> 1.33 (1-2) </td><td> 9.67 (9-10) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 10 </td&gt; <td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 15 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 7.25 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 8.0 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 35 </td><td> 4/4 </td><td> 3.5 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 60 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 9.0 (8-10) </td></tr><tr><td colspan="5"> -------------------------- </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 343 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 10.33 (10-11) </td></tr><tr><td> MBP-MIA </td><td> 445 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 7.0 (7.0) </td></tr></tbody></table> Tabla IV. Cinética de la estimulación antigénica. Los ratones receptores fueron impugnadas en el puesto de varios punto de momento, adoptarive la transferencia de células. Av.., Promedio.

<ol><li>Swanborg, R. H. Experimental allergic encephalomyelitis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanborg%2C+RH+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Sabato, G. D. 162, Academic Press. New York, NY. 413-421 (1988).</li>
<li>Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelin+basic+protein-specific+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice%3A+Mapping+of+T+cell+epitopes+and+T+cell+Vb+gene+segment+usage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage.</a> J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).</li>
<li>McCarron, R., McFarlin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+SJL%2FJ%2C+PL%2FJ%2C+and+%28SJL%2FJ+x+PL%2FJ%29F1+mice.+Influence+of+I-A+haplotypes+on+encephalitogenic+epitope+of+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J, PL/J, and (SJL/J x PL/J)F1 mice. Influence of I-A haplotypes on encephalitogenic epitope of myelin basic protein.</a> J. Immunol. 141, 1143-1149 (1988).</li>
<li>Shaw, M. K., Kim, C., Ho, K. -L., Lisak, R. P., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination+of+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge+induces+consistent+murine+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice+and+other+reputed+resistant+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains.</a> J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).</li>
<li>Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. S., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-specific+T+cells+also+recognize+neuronal+autoantigen+in+a+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 15, 626-632 (2009).</li>
<li>Anderson, A. C., Reddy, J., Nazareno, R., Sobel, R. A., Nicholson, L. B., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+plays+an+important+role+in+the+homeostatic+regulation+of+the+autoreactive+reperteroire+in+na%C3%AFve+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 plays an important role in the homeostatic regulation of the autoreactive reperteroire in naïve mice.</a> J. Immunol. 173, 828-834 (2004).</li>
<li>Anderton, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+and+T-effector+cells+in+autoimmune+CNS+inflammation%3A+a+delicate+balance+easily+disturbed%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed.</a> Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).</li>
<li>Arnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+encephalomyelitis+-+susceptibility+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic encephalomyelitis - susceptibility and suppression.</a> Immunol. Rev. 55, 5(1981).</li>
<li>Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., Carton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+mice+by+antibodies+against+IFN-g%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-g.</a> J. Immunol. 140, 1506-1510 (1988).</li>
<li>Arbomson-Leeman, S., Alexander, J., Bronson, R., Corroll, J., Southwood, S., Dorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis-resistant+mice+have+highly+encephalitogenic+myelin+basic+protein+%28MBP%29-specific+T+cell+clones+that+recognize+a+MBP+peptide+with+high+affinity+for+MHC+class+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis-resistant mice have highly encephalitogenic myelin basic protein (MBP)-specific T cell clones that recognize a MBP peptide with high affinity for MHC class II.</a> J. Immunol. 154, 388-398 (1995).</li>
<li>Reddy, J., Illes, Z., Zhang, X., Encinas, J., Nicholson, L., Sobel, R. A., Wucherpfennig, K. W., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+proteolipid+protein-specific+CD4%2BCD25%2B+regulatory+cells+mediate+genetic+resistance+to+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Myelin proteolipid protein-specific CD4+CD25+ regulatory cells mediate genetic resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15434-15439 (2004).</li>
<li>Korn, T., Reddy, J., Gao, W., Bettelli, E., Awasthi, A., Petersen, T. R., Backstrom, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-+specific+regulatory+T+cells+accumulate+in+the+CNS+but+fail+to+control+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Myelin- specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation.</a> Nature Med. 13, 423-431 (2007).</li>
<li>Shaw, M. K., Li, J., Ho, P. P., Hao, H., Lisak, R. P., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific adoptive experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Longevity of donor T cells and lack of disease relapses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+MK+%22Neuroimmunology+Research+Focus%22">Neuroimmunology Research Focus</a>. Broglie, P. V. , Nova Science Publisher. New York. 175-191 (2007).</li>
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Los estudios de la EAE en ratones a menudo utilizan los neuroantigens, la proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP) o las proteínas de mielina de oligodendrocitos (MOG). Estudios anteriores utilizan sobre todo MBP. PLP estimula respuestas fuertes y consistentes de los ratones SJL. Más recientemente, MOG es el neuroantigen común usado porque ratones B6 son susceptibles a la inducción de la enfermedad con este antígeno. Muchas de las cepas de ratón de genes específicos están en el fondo B6 genética. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Conejillos de Indias la médula espinal </td><td> Rockland inmuno-químicos, Inc. Gilbertsville, PA 19525 <a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank">www.rockland-inc.com</a> </td><td> GP-T065 </td><td> congelado </td></tr><tr><td> Adyuvante de Freund, completo H37Ra </td><td> Difco Laboratories Detroit, MI </td><td> 231131 </td><td></td></tr><tr><td> Multifit intercambio de jeringas, capaz de </td><td> BD <a href="http://www.bd.com/us" target="_blank">www.bd.com / us</a> </td><td> 512133 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> MediatechInc. Manassas, VA <a href="http://www.cellgro.com" target="_blank">www.cellgro.com</a> </td><td> 10-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> OVA </td><td> Sigma-Aldrich <a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a> </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Ratones </td><td> Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine </td><td> Ratones B6: 0000664 </td><td></td></tr></tbody></table>

superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (eae) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) y se ha utilizado como un modelo animal para el estudio de la enfermedad desmielinizante humana, la esclerosis múltiple (MS). EAE se caracteriza por la infiltración patológica de células mononucleares en el SNC y por la manifestación clínica de la enfermedad paralítica. Similar a la EM, EAE es también bajo control genético en que ciertas cepas de ratón son susceptibles a la inducción de la enfermedad, mientras que otros son resistentes. Por lo general, C57BL / 6 (H-2 b) los ratones inmunizados con la proteína básica de mielina (MBP) no presenta signos de parálisis. Esta falta de respuesta no es ciertamente debido a defectos en el procesamiento de antígenos o la presentación de antígenos de MBP, como un protocolo experimental descrito aquí se han utilizado para inducir EAE severa en ratones C57BL / 6, así como otras cepas de ratón reputadas resistentes. Además, encefalitógenas clones de células T de los ratones C57BL / 6 y ratones Balb / c reactivas a MBP había sido éxitocompletamente aislado y propagado. El protocolo experimental implica el uso de un sistema celular en el que la transferencia adoptiva MBP-cebado (200 ug / ratón) C57BL / 6 donantes células de ganglios linfáticos se aislaron y cultivaron durante cinco días con el antígeno para ampliar el grupo de células T específicas de MBP. Al final del período de cultivo, 50 millones de células viables se transfieren a ingenuos receptores singénicos a través de la vena de la cola. Los ratones receptores así tratados no suelen desarrollar EAE, reafirmando así su condición resistentes, y pueden permanecer normal por tiempo indefinido. Diez días después de la transferencia de células, los ratones receptores tienen el desafío de adyuvante completo de Freund (CFA)-MBP emulsionada en cuatro sitios en los flancos. EAE severa comienza a desarrollarse en estos ratones de diez a catorce días después del desafío. Los resultados mostraron que la inducción de la enfermedad fue específico antigénica como desafío con antígenos irrelevantes no indujo signos clínicos de enfermedad. Significativamente, una titulación de la dosis de antígeno utilizado paradesafiar los ratones receptores mostró que podría ser tan baja como 5 ug / ratón. Además, un estudio cinético de la temporización de una estimulación antigénica mostró que desafío para inducir la enfermedad fue eficaz tan pronto como 5 desafío antigénico días después y mientras más de 445 días post desafío antigénico. Estos datos apuntan claramente hacia la participación de una &quot;larga vida&quot; población de células T en el mantenimiento de la falta de respuesta. La participación de las células T reguladoras (Tregs) en este sistema no está definido.

Ciertas cepas de ratón son capaces de resistir la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) con proteína básica de mielina. Aquí se describe es un protocolo de inmunización simple que invierte la falta de respuesta e induce la enfermedad paralítica en varios típicas manchas de EAE de ratón resistentes.

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) y se ha utilizado como modelo animal para...

El objetivo general de este procedimiento es inducir de manera constante y sencilla la EAE en cualquier cepa de ratón, incluidas aquellas consideradas resistentes a la inducción de EAE. Esto se logra primero inmunizando ratones donantes con proteínas de mielina específicas o antígenos peptídicos, emulsionados en adyuvante completo de Freund. Diez días después, se aíslan los ganglios linfáticos de los ratones donantes y las células de los ganglios linfáticos se vuelven a estimular in vitro cultivándolas con el mismo antígeno durante cuatro a cinco días.Luego, las células se transfieren adoptivamente a ratones receptores ingénuos. Las cepas de ratones susceptibles desarrollarán EAE en un período de ocho a 14 días para inducir EAE en una cepa resistente. Catorce días después de la transferencia adoptiva, los ratones receptores se inmunizaron entonces con antígeno en CFA.Mediante este método, se puede inducir EAE en cepas de ratones resistentes. La principal ventaja del protocolo de transferencia adaptativa y desafío para inducir EAE es que permite una inducción fiable de la enfermedad. Rara vez observamos menos del 100 % de enfermedad clínica.Podemos adaptar el protocolo para inducir la enfermedad y cepas de ratones susceptibles, pero más importante aún, podemos utilizar este protocolo para inducir EAE en muchas cepas de ratones que anteriormente se consideraban resistentes a la enfermedad. Demostrando los procedimientos. Hoy es nuestra investigadora asociada principal, cha ching.Comience preparando una solución de dos miligramos por mililitro de MBP en PBS. Utilice una jeringa de vidrio esmerilado equipada con bloqueo de tipo lure lock para aspirar 100 microlitros de solución de antígeno por cada ratón que se vaya a inmunizar.Usando una jeringa separada, recolecte un volumen igual de adyuvante completo de Freund H 37 Ra. Luego, con una llave de paso de tres vías, conecte las dos jeringas y mueva los émbolos hacia adelante y hacia atrás para mezclar el antígeno y el adyuvante hasta que se forme una emulsión. Para verificar que este sea el caso, transfiera la solución a una de las jeringas y desconecte la vacía.Retire ligeramente el émbolo de las jeringas vacías y luego expulse una gota de la mezcla residual en un vaso de precipitados con agua limpia a temperatura ambiente. Si la gota se dispersa, reconecte las jeringas y continúe mezclando. Repita la prueba si la gota permanece intacta y se ha formado una emulsión, para recoger la emulsión.Para inmunizar. Conecte una jeringa plástica de un mililitro a la jeringa de vidrio de la cual se ha retirado el émbolo. Transfiera cuidadosamente la solución a la jeringa plástica, llenándola hasta el borde.Luego inserte el émbolo de plástico y expulse algo de emulsión hasta que queden exactamente 1,2 mililitros. No debe haber burbujas de aire atrapadas en la jeringa. Si este procedimiento se realiza correctamente.Desconecte la jeringa de plástico. Coloque una aguja de calibre 26 y llene el volumen muerto de la aguja empujando el émbolo hasta la marca de un mililitro. Sujete firmemente al ratón por la nuca y mantenga la cola hacia atrás entre el dedo anular y el meñique para que el tórax y el abdomen sean fácilmente accesibles. Por vía subcutánea.Injecte 50 microlitros de emulsión en el tórax justo por encima de la axila derecha. Si la inyección se realiza correctamente, será visible una pequeña protuberancia blanca en el sitio de inyección. Repita el procedimiento por encima de la axila izquierda, luego suelte la cola y tome la pata derecha, exponiendo el flanco derecho del ratón.Injecte 50 microlitros de solución justo debajo de la caja torácica. Suelte la pata derecha. Gire el ratón en la otra dirección y repita la inyección en el lado izquierdo.Siete a 10 días después de la inmunización, obtenga los ganglios linfáticos de los animales sacrificados. Primero coloque al ratón sobre su espalda con las extremidades extendidas y sujetas al tablero de disección mediante alfileres.Rocíe al ratón con etanol. Luego, utilizando herramientas estériles, haga una incisión longitudinal en la piel del ratón desde el abdomen inferior hasta la barbilla.Realice otra incisión desde el abdomen hasta una pata. Luego, hacia la otra. Retire la piel del ratón y fíjela en la tabla de disección.También corte la piel a lo largo de los cuatro miembros. Luego retire y sujete con alfileres la parte superior de los colgajos de piel a ambos lados; los ganglios linfáticos inguinales y axilares, que normalmente se encuentran cerca de la ingle o las axilas, deben ser visibles como pequeñas masas opacas directamente bajo la piel. Utilice dos pinzas finas para retirar suavemente el tejido conectivo que se encuentra sobre el primer ganglio linfático.Teniendo cuidado de no alterar los vasos sanguíneos en el proceso. Una vez que se haya eliminado el tejido conectivo, coloque un par de pinzas debajo del ganglio linfático y sepárelo del cuerpo. Transfiera el ganglio linfático a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga PBS estéril y recoja los otros tres ganglios linfáticos del mismo modo.Una vez que se hayan extraído todos los ganglios linfáticos, transfiera la placa de Petri a una cabina de seguridad biológica. Utilizando la parte posterior del émbolo de una jeringa estéril, homogenice los ganglios linfáticos para liberar las células. Para eliminar los restos celulares, filtre la suspensión a través de una malla de nailon hacia un tubo cónico.Luego, ajuste el volumen a 50 mililitros con PBS estéril y centrifugue las células durante 10 minutos. Tras la centrifugación, re suspenda las células en un pequeño volumen de medio de cultivo celular precalentado y cuente las células viables. Ajuste la concentración a cuatro veces 10 a la seis células por mililitro.Luego, siembre las células a dos mililitros por pocillo en una placa de 24 pocillos. Añada el antígeno MVP a cada pocillo para obtener una concentración final de 100 microgramos por mililitro. Una vez que se ha añadido el antígeno.Incube las células a 37 grados Celsius durante cinco días. Una vez que las células hayan sido reestimuladas, recójalas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue las células a 1000 RPM durante 10 minutos y resuspenda el precipitado en un pequeño volumen de PBS estéril.Luego cuente las células y ajuste la concentración de células viables a 2,5 veces 10 a la octava células por mililitro con PBS. Aspire las células hacia una jeringa y coloque una aguja de calibre 26 para realizar la transferencia adoptiva. Inyecte 0,2 mililitros de células por vía intravenosa en la cola de cada ratón para desafiar a los ratones resistentes a las semanas posteriores a la transferencia adoptiva.Injecte los animales con 200 microgramos de antígeno en un volumen de 200 microlitros de emulsión, de la misma manera que se realizó la inmunización de los ratones donadores. De siete a diez días después del desafío, se desarrollará la enfermedad paralítica y se podrá monitorear su progresión. La enfermedad comienza con debilidad en la cola.Cuando la cola está flácida, se gradúa la enfermedad: un grado uno si hay enfermedad, dos si el ratón desarrolla parálisis en una de las patas traseras, y tres si ambas patas traseras están paralizadas. El grado cuatro corresponde a la parálisis de ambas patas delanteras.Grado cinco, el ratón es más abundante. Y grado seis, el ratón está muerto. Como se muestra aquí, de siete a 14 días después del desafío, los ratones desarrollarán una enfermedad paralítica monofásica, que puede calificarse utilizando los criterios clásicos de EAE.Aunque los ratones pueden recuperarse, no sufrirán una recaída espontánea. La inducción de la enfermedad requiere un desafío específico al antígeno. El desafío con CFA solo o con un antígeno irrelevante no logra provocar la enfermedad.Después de ver este video, debería tener una comprensión clara del método de transferencia adoptiva y desafío para inducir EAE. Al combinar la transferencia adoptiva de células de ganglios linfáticos específicas para un antígeno con un desafío antigén游戏副本Esta técnica debería adaptarse fácilmente para estudiar cualquier proceso de enfermedad autoinmune.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica de homogeneización eficiente para generar una emulsión adyuvante de antígeno para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en un modelo murino. La emulsión contiene un autoantígeno, la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), en la fase acuosa, rodeada por una fase oleosa continua que comprende una bacteria patógena inactivada. La emulsión asegura una liberación sostenida de antígenos para una respuesta inmunitaria prolongada.

Preparación de una emulsión antigénica adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune

El video demuestra la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón mediante la inyección de una combinación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina y Mycobacterium tuberculosis inactivada. El modelo permite a los investigadores estudiar los mecanismos de la enfermedad y probar intervenciones terapéuticas.

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

Este video muestra el método para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inyectando péptidos derivados de mielina con un adyuvante para activar las células T autorreactivas, que migran al cerebro. La toxina de la tos ferina se administra para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que estas células T y otras células inmunitarias ingresen al cerebro. Estas células inmunitarias causan desmielinización, lo que conduce a una transmisión nerviosa...

Generación de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal establecido de la esclerosis múltiple. C57BL / 6 ratones se inmunizan con mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG) péptido 35-55 (MOG 35-55), dando como resultado una parálisis flácida ascendente causada por las células inmunes autorreactivas en el sistema nervioso central. Se discutirán Protocolos para la inducción de la enfermedad y el seguimiento.

La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducida por la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones C57BL / 6 ratones

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood - brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Aprenda a inducir encefalomielitis autoinmune experimental en cepas de ratones resistentes mediante transferencia adoptiva de células de ganglios linfáticos y estimulación antigénica. Este protocolo permite superar mecanismos de resistencia.

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica (Video) | JoVE Journal

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

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