Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

El objetivo general de este procedimiento es inducir de manera constante y sencilla la EAE en cualquier cepa de ratón, incluidas aquellas consideradas resistentes a la inducción de EAE. Esto se logra primero inmunizando ratones donantes con proteínas de mielina específicas o antígenos peptídicos, emulsionados en adyuvante completo de Freund. Diez días después, se aíslan los ganglios linfáticos de los ratones donantes y las células de los ganglios linfáticos se vuelven a estimular in vitro cultivándolas con el mismo antígeno durante cuatro a cinco días.

Luego, las células se transfieren adoptivamente a ratones receptores ingénuos. Las cepas de ratones susceptibles desarrollarán EAE en un período de ocho a 14 días para inducir EAE en una cepa resistente. Catorce días después de la transferencia adoptiva, los ratones receptores se inmunizaron entonces con antígeno en CFA.

Mediante este método, se puede inducir EAE en cepas de ratones resistentes. La principal ventaja del protocolo de transferencia adaptativa y desafío para inducir EAE es que permite una inducción fiable de la enfermedad. Rara vez observamos menos del 100 % de enfermedad clínica.

Podemos adaptar el protocolo para inducir la enfermedad y cepas de ratones susceptibles, pero más importante aún, podemos utilizar este protocolo para inducir EAE en muchas cepas de ratones que anteriormente se consideraban resistentes a la enfermedad. Demostrando los procedimientos. Hoy es nuestra investigadora asociada principal, cha ching.

Comience preparando una solución de dos miligramos por mililitro de MBP en PBS. Utilice una jeringa de vidrio esmerilado equipada con bloqueo de tipo lure lock para aspirar 100 microlitros de solución de antígeno por cada ratón que se vaya a inmunizar.

Usando una jeringa separada, recolecte un volumen igual de adyuvante completo de Freund H 37 Ra. Luego, con una llave de paso de tres vías, conecte las dos jeringas y mueva los émbolos hacia adelante y hacia atrás para mezclar el antígeno y el adyuvante hasta que se forme una emulsión. Para verificar que este sea el caso, transfiera la solución a una de las jeringas y desconecte la vacía.

Retire ligeramente el émbolo de las jeringas vacías y luego expulse una gota de la mezcla residual en un vaso de precipitados con agua limpia a temperatura ambiente. Si la gota se dispersa, reconecte las jeringas y continúe mezclando. Repita la prueba si la gota permanece intacta y se ha formado una emulsión, para recoger la emulsión.

Para inmunizar. Conecte una jeringa plástica de un mililitro a la jeringa de vidrio de la cual se ha retirado el émbolo. Transfiera cuidadosamente la solución a la jeringa plástica, llenándola hasta el borde.

Luego inserte el émbolo de plástico y expulse algo de emulsión hasta que queden exactamente 1,2 mililitros. No debe haber burbujas de aire atrapadas en la jeringa. Si este procedimiento se realiza correctamente.

Desconecte la jeringa de plástico. Coloque una aguja de calibre 26 y llene el volumen muerto de la aguja empujando el émbolo hasta la marca de un mililitro. Sujete firmemente al ratón por la nuca y mantenga la cola hacia atrás entre el dedo anular y el meñique para que el tórax y el abdomen sean fácilmente accesibles. Por vía subcutánea.

Injecte 50 microlitros de emulsión en el tórax justo por encima de la axila derecha. Si la inyección se realiza correctamente, será visible una pequeña protuberancia blanca en el sitio de inyección. Repita el procedimiento por encima de la axila izquierda, luego suelte la cola y tome la pata derecha, exponiendo el flanco derecho del ratón.

Injecte 50 microlitros de solución justo debajo de la caja torácica. Suelte la pata derecha. Gire el ratón en la otra dirección y repita la inyección en el lado izquierdo.

Siete a 10 días después de la inmunización, obtenga los ganglios linfáticos de los animales sacrificados. Primero coloque al ratón sobre su espalda con las extremidades extendidas y sujetas al tablero de disección mediante alfileres.

Rocíe al ratón con etanol. Luego, utilizando herramientas estériles, haga una incisión longitudinal en la piel del ratón desde el abdomen inferior hasta la barbilla.

Realice otra incisión desde el abdomen hasta una pata. Luego, hacia la otra. Retire la piel del ratón y fíjela en la tabla de disección.

También corte la piel a lo largo de los cuatro miembros. Luego retire y sujete con alfileres la parte superior de los colgajos de piel a ambos lados; los ganglios linfáticos inguinales y axilares, que normalmente se encuentran cerca de la ingle o las axilas, deben ser visibles como pequeñas masas opacas directamente bajo la piel. Utilice dos pinzas finas para retirar suavemente el tejido conectivo que se encuentra sobre el primer ganglio linfático.

Teniendo cuidado de no alterar los vasos sanguíneos en el proceso. Una vez que se haya eliminado el tejido conectivo, coloque un par de pinzas debajo del ganglio linfático y sepárelo del cuerpo. Transfiera el ganglio linfático a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga PBS estéril y recoja los otros tres ganglios linfáticos del mismo modo.

Una vez que se hayan extraído todos los ganglios linfáticos, transfiera la placa de Petri a una cabina de seguridad biológica. Utilizando la parte posterior del émbolo de una jeringa estéril, homogenice los ganglios linfáticos para liberar las células. Para eliminar los restos celulares, filtre la suspensión a través de una malla de nailon hacia un tubo cónico.

Luego, ajuste el volumen a 50 mililitros con PBS estéril y centrifugue las células durante 10 minutos. Tras la centrifugación, re suspenda las células en un pequeño volumen de medio de cultivo celular precalentado y cuente las células viables. Ajuste la concentración a cuatro veces 10 a la seis células por mililitro.

Luego, siembre las células a dos mililitros por pocillo en una placa de 24 pocillos. Añada el antígeno MVP a cada pocillo para obtener una concentración final de 100 microgramos por mililitro. Una vez que se ha añadido el antígeno.

Incube las células a 37 grados Celsius durante cinco días. Una vez que las células hayan sido reestimuladas, recójalas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue las células a 1000 RPM durante 10 minutos y resuspenda el precipitado en un pequeño volumen de PBS estéril.

Luego cuente las células y ajuste la concentración de células viables a 2,5 veces 10 a la octava células por mililitro con PBS. Aspire las células hacia una jeringa y coloque una aguja de calibre 26 para realizar la transferencia adoptiva. Inyecte 0,2 mililitros de células por vía intravenosa en la cola de cada ratón para desafiar a los ratones resistentes a las semanas posteriores a la transferencia adoptiva.

Injecte los animales con 200 microgramos de antígeno en un volumen de 200 microlitros de emulsión, de la misma manera que se realizó la inmunización de los ratones donadores. De siete a diez días después del desafío, se desarrollará la enfermedad paralítica y se podrá monitorear su progresión. La enfermedad comienza con debilidad en la cola.

Cuando la cola está flácida, se gradúa la enfermedad: un grado uno si hay enfermedad, dos si el ratón desarrolla parálisis en una de las patas traseras, y tres si ambas patas traseras están paralizadas. El grado cuatro corresponde a la parálisis de ambas patas delanteras.

Grado cinco, el ratón es más abundante. Y grado seis, el ratón está muerto. Como se muestra aquí, de siete a 14 días después del desafío, los ratones desarrollarán una enfermedad paralítica monofásica, que puede calificarse utilizando los criterios clásicos de EAE.

Aunque los ratones pueden recuperarse, no sufrirán una recaída espontánea. La inducción de la enfermedad requiere un desafío específico al antígeno. El desafío con CFA solo o con un antígeno irrelevante no logra provocar la enfermedad.

Después de ver este video, debería tener una comprensión clara del método de transferencia adoptiva y desafío para inducir EAE. Al combinar la transferencia adoptiva de células de ganglios linfáticos específicas para un antígeno con un desafío antigén游戏副本

Esta técnica debería adaptarse fácilmente para estudiar cualquier proceso de enfermedad autoinmune.