Simples dispositivos de microfluidos para
30 de septiembre de 2012
Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico libre In vivo Formación de imágenes de C. elegans, Intacto Drosophila Larvas y larvas de pez cebra. El dispositivo utiliza una membrana de PDMS deformable para inmovilizar estos organismos modelo con el fin de realizar las imágenes de lapso de tiempo de numerosos procesos, tales como el ritmo cardíaco, la división celular y subcelular transporte neuronal. Se demuestra el uso de este dispositivo y muestran ejemplos
Hola, soy Shamal, investigadora posdoctoral con TUR Kika en el Centro Nacional de Ciencias Biológicas de la India. En este video les mostraré cómo fabricar un dispositivo microbiano mediante técnicas de litografía suave en un entorno de laboratorio convencional. Voy a utilizar estos dispositivos para realizar imágenes celulares y subcelulares de alta resolución de organismos modelo genéticos.
El protocolo actual permitirá a los investigadores realizar esta imagenología de intervalo en organismos completos sin anestesia. Comencemos. Hemos desarrollado un dispositivo microfónico sencillo para realizar imagenología in vivo sin anestesia en organismos modelo genéticos como Caenorhabditis elegans, oph intacto y pez cebra.
En este estudio, demostramos un dispositivo de movilización claro basado en membrana, fabricado mediante moldeado blando de PDMS. Con el fin de inmovilizar un organismo individual, localizamos un animal individual bajo un microscopio estereoscópico y lo recogemos utilizando una pequeña gota de solución tampón con una micropipeta, insertamos el animal individual en el canal de flujo y lo inmovilizamos bajo la membrana de PTMS. Utilizando una conexión de gas nitrógeno presurizado a través de una válvula esférica de tres vías.
Diseñe las estructuras micro fredic utilizando software de limpieza. Limpie obleas de silicio de dos centímetros por dos centímetros en KH al 20% durante un minuto y enjuáguelas con agua desionizada. Seque las piezas con gas nitrógeno y deshidrátelas a 122 °C durante cuatro horas.
Centrifugar el metal Spinco hexa sobre láminas de silicio a 500 RPM durante cinco segundos y a 3000 RPM durante 30 segundos. Centrifugar el SU 8 2 0 2 5 Spinco sobre obleas de silicio a 500 RPM durante cinco segundos y a 2000 RPM durante 30 segundos. Hornear suavemente las láminas de silicio recubiertas a 65 grados Celsius durante un minuto y a 95 grados Celsius durante 10 minutos.
Exponga las obleas recubiertas con SU-8 horneadas a una lámpara UV de 200 vatios a través de la máscara fotográfica para el diseño uno y el diseño dos, correspondientes a la capa de flujo y la capa de control, respectivamente. Hornee posteriormente las obleas a 65 grados Celsius durante un minuto y a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Revele las piezas utilizando la solución reveladora SUA durante 20 minutos.
Codifique los fragmentos con vapor de tricloro perfluorocetileno en un desecador durante dos horas. Mezcle la base de poli-dil-xox y el agente de curado en una proporción de 10 a 1 en peso. Desgasifique la mezcla para eliminar todas las burbujas de aire producidas durante la mezcla.
Vierta una mezcla de PDMS de cinco milímetros de espesor sobre obleas de silicio con el diseño del patrón de peso SC. Agite suavemente dos veces para evitar la formación de burbujas de aire. Aplique recubrimiento por centrifugado y una capa uniforme de PDMS sobre las obleas de silicio con el diseño uno para la capa de flujo a 500 RPM durante cinco segundos y 1500 RPM durante 30 segundos.
Coloque al horno ambas piezas del diseño uno y del diseño dos que contienen PDMS a 50 grados Celsius durante seis horas. Corte la pieza de PDMS del sustrato de silicio utilizando una cuchilla inferior que contenga el patrón SCH dos. Perfore un pequeño orificio en la parte superior del depósito, conectando la trampa principal en el molde de PDMS.
Utilizando una aguja de punción más alta o de calibre 18. Exponga la superficie inferior de la capa de control y la superficie superior de la capa de flujo al plasma de aire 18 wat durante dos minutos. Coloque las dos superficies tratadas con plasma juntas con presión suave y caliente a 50 grados Celsius durante dos horas.
Corte los dispositivos unidos del sustrato de silicio con el diseño SUH uno y haga perforaciones para los orificios de acceso en los depósitos de entrada y salida del canal de flujo. Exponga la parte inferior del PD del dispositivo y una cubierta de vidrio limpia. Someta a plasma de aire de 18 voltios durante dos minutos.
Coloque las dos superficies tratadas con plasma con presión suave y hornee a 50 grados durante dos horas. Almacene el dispositivo en un ambiente limpio para su uso futuro. Después de la fabricación de los dispositivos, voy a mostrarle cómo utilizar una membrana de PDMS para inmovilizar C. elegans en el dispositivo. Conecte un extremo de un tubo microflex a un regulador de suministro de gas nitrógeno presurizado y el otro extremo al depósito principal del trampa a través de una aguja de calibre 18.
Una llave de paso de tres vías utilizada en la parte media de la conexión del tubo permite aplicar o liberar la presión sobre la membrana. Llene el tubo y conéctelo al dispositivo de PDMS con una columna de 10 centímetros de agua destilada antes de conectarlo al reservorio del trampa principal. Gire la válvula del suministro de nitrógeno hasta alcanzar PSI de proteína y observe, con un microscopio invertido a baja magnificación, cómo la membrana de la trampa principal se desvía hacia el canal de flujo.
Entonces, libere el embudo de tres vías y coloque la membrana en posición de reposo. Llene el canal de flujo con tampón durante 10 minutos. Antes de un experimento, localice una única *Aequorea victoria* utilizando un microscopio estéreo de baja magnificación.
Seleccione un solo animal utilizando un pequeño volumen de solución tampón en una punta micro. Pase el animal individualmente a través de la entrada del canal de flujo. Ajuste la presión de pipeteo para posicionar al animal individual bajo la trampa principal.
Aumente lentamente la presión de la membrana de PDMS para colocar al animal contra el límite del canal e inmovilícelo con una presión de entre 7 y 14 PSI. Utilice un microscopio invertido con el ajuste deseado para obtener imágenes de relleno derecho de alta resolución o imágenes de fluorescencia. Adquiera imágenes individuales o series temporales de fluorescencia a una velocidad de fotogramas predeterminada en tiempo real.
Suelte la presión de la trampa y observe el comportamiento locomotor del animal. Durante cinco minutos con baja magnificación, lave el animal e inserte un animal nuevo. Para repetir los pasos de DevOp, utilice la punta cortada de la micropipeta para tomar una larva oph individual e insertarla en el dispositivo microférrico de mayor tamaño.
Introduzca la larva individual a través de la entrada del canal de flujo. Aumente lentamente la presión de la membrana de PDMS e inmovilícela con siete presiones ESI. Utilice un microscopio invertido para la obtención de imágenes de fluorescencia con baja ampliación y adquiera imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo para la visualización del transporte.
Suelte la presión de la trampa y observe el comportamiento locomotor de la larva con baja magnificación. Utilice el mismo principio del dispositivo para inmovilizar y adquirir imágenes de lapso de tiempo de peces cebra de 30 horas post-fecundación. Corazón val.
Después de ver este video, usted debería ser capaz de fabricar dispositivos microscópicos similares en su propio laboratorio y utilizarlos con éxito para inmovilizar organismos en experimentos asombrosos de alta resolución. Gracias por ver el video y buena suerte en sus experimentos.
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Descripción general
Se ha desarrollado un dispositivo microfluídico sencillo para la obtención de imágenes in vivo sin anestesia de C. elegans, larvas intactas de Drosophila y larvas de pez cebra. Este dispositivo utiliza una membrana de PDMS deformable para inmovilizar a estos organismos durante la adquisición de imágenes de procesos biológicos diversos mediante lapso de tiempo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Microfluídica
Antecedentes
- La imagenología in vivo es fundamental para estudiar organismos vivos.
- La imagenología tradicional requiere frecuentemente anestésicos, que pueden afectar los procesos biológicos.
- Los dispositivos microfluídicos ofrecen una manera de estudiar organismos sin usar anestésicos.
- Los organismos modelo como C. elegans y Drosophila se utilizan ampliamente en la investigación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un dispositivo microfluídico para imágenes sin anestesia.
- Permitir la obtención de imágenes de procesos biológicos en organismos vivos mediante lapso de tiempo.
- Mostrar la aplicación del dispositivo en diferentes sistemas modelo.
Métodos Utilizados
- Elaboración de un dispositivo microfluídico mediante técnicas de litografía suave.
- Uso de una membrana de PDMS deformable para la inmovilización de organismos.
- Adquisición de imágenes de intervalos temporales de latidos cardíacos, división celular y transporte neuronal.
- Aplicación en C. elegans, larvas de Drosophila y larvas de pez cebra.
Resultados principales
- Imágenes exitosas de diversos procesos biológicos sin anestésicos.
- Versatilidad demostrada del dispositivo en diferentes organismos modelo.
- Recopilación de datos sobre latidos cardíacos, división celular y transporte neuronal.
- Posibilidades demostradas de imágenes de alta resolución en especímenes vivos.
Conclusiones
- El dispositivo microfluídico permite imágenes detalladas in vivo.
- Abre nuevas vías para la investigación en estudios con organismos vivos.
- El enfoque puede mejorar nuestra comprensión de los procesos biológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los dispositivos de inmovilización microfluídicos para imágenes in vivo de C. elegans, Drosophila y pez cebra permiten estudios de alta resolución y libres de anestésicos de procesos celulares y subcelulares. Esta capacidad satisface una necesidad crítica de datos fisiológicamente relevantes en las etapas iniciales de descubrimiento y en los flujos de trabajo de validación de dianas. El enfoque favorece la confianza predictiva y reduce la ambigüedad biológica en puntos clave de inflexión del proceso de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la observación directa del transporte neuronal, la dinámica de las vesículas sinápticas y la división celular en organismos modelo intactos.
- Apoya la validación funcional de dianas al mantener los estados fisiológicos nativos durante la obtención de imágenes.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al eliminar los artefactos inducidos por anestésicos en los datos de imagenología en vivo.
- Mejora la confiabilidad predictiva para hipótesis biológicas posteriores y la selección de proyectos en carteras.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una inmovilización estandarizada para ensayos de imágenes cuantitativas y de lapso de tiempo reproducibles.
- Permite la selección de alta densidad para el transporte celular y eventos de desarrollo en múltiples contextos genéticos.
- Apoya la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma en modelos de C. elegans, Drosophila y pez cebra.
- Ofrece lecturas confiables y libres de artefactos para estudios de perturbaciones por compuestos o genéticas.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades al permitir la obtención de imágenes en modelos genéticos ampliamente utilizados.
- Mantiene la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al apoyar puntos finales fisiológicamente relevantes.
- Reduce el riesgo de falsos positivos/negativos debido a los efectos anestésicos sobre procesos neuronales o del desarrollo.
- Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos sólidos obtenidos de animales vivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de inmovilización microfluídico se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la observación en tiempo real de eventos celulares en organismos vivos.
- Selección: Proporciona disponibilidad y reproducibilidad de ensayos para cribados cuantitativos basados en imágenes.
- Análisis: Ofrece mediciones de alta resolución y con lapse de tiempo de transporte, división y actividad fisiológica para análisis comparativo.
- Investigación Traductiva: Conecta los hallazgos del descubrimiento con modelos preclínicos mediante el uso de organismos genéticamente conservados.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable adaptable a múltiples sistemas modelo y preguntas experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de inmovilización y de obtención de imágenes para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más acertadas de avance o interrupción del proyecto y una mayor eficiencia del capital al proporcionar datos libres de artefactos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en fase de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la fabricación de dispositivos microfluídicos y técnicas de litografía suave.
- Necesita acceso a microscopía de fluorescencia invertida e instrumentación de control de presión.
- Exige estandarización entre equipos para las dimensiones del dispositivo y los protocolos de imagen.
- Adaptable a C. elegans, Drosophila y pez cebra con modificaciones en el tamaño del dispositivo.
- Limitado a organismos con diámetros pequeños y tejidos ópticamente accesibles, según lo indicado en el estudio.
