Medición única célula de la liberación de dopamina simultánea con fijación de voltaje y Amperometría
21 de noviembre de 2012
La técnica amperométrica mide la liberación de dopamina a partir de una única célula mediante la detección de la corriente oxidativo producido por la oxidación espontánea dopamina. Fijación de tensión simultánea y metodología amperometría revelar la relación mecanicista entre el general "actividad" del transportador de dopamina y el papel regulador de esta actividad en el transporte inverso de la dopamina.
El objetivo de este procedimiento es medir el transporte inverso de dopamina en una neurona que está sujeta por voltaje utilizando una pinza de parche simultánea y pirometría para medir la liberación de D mediada por DAT. Esto se logra probando primero la integridad del electrodo pirométrico con dopamina. El segundo paso es colocar el electrodo pirométrico cerca de la célula y lograr un parche de célula completa de la neurona con una pipeta de parche.
A continuación, se controla el voltaje de la célula con la pipeta de parche y se registra simultáneamente la dopamina mediada por DAT liberada por la célula con un electrodo pirométrico. El paso final es añadir el bloqueador DAT y volver a registrar toda la célula y las corrientes de pirometría para permitir que se reste la corriente mediada específicamente por el transportador de dopamina. La importancia de esta técnica es la capacidad de medir el transporte inverso de dopamina a través del transportador de dopamina y, al mismo tiempo, controlar el voltaje de la neurona dopaminérgica.
El sistema simultáneo de registro de barometría y pinza de parche requiere un microscopio invertido con una excelente óptica DIC y una lente de larga distancia de trabajo para generar una fuente de luz de CC para el sistema. Con bajo ruido eléctrico, conecte el faro del microscopio a la batería de un automóvil. Los micromanipuladores hidráulicos se utilizan porque no contribuyen apreciablemente a los niveles de ruido en nuestra configuración.
Se utiliza un manipulador para diestros para la pinza de voltaje, el registro de celdas completas y el manipulador para zurdos para la pirometría. Para preparar el electrodo para el registro al por mayor, tire de una pipeta de cuarzo con un extractor P 2000. Por lo general, usamos una pipeta con una resistencia de tres a cuatro mega ohmios.
A continuación, llene el electrodo con la solución de pipeta que contiene un milimolar de dopamina. A continuación, móntelo en el soporte de pipetas del manipulador derecho. Asegúrese de envolver el recipiente que contiene la solución de pipeta que contiene dopamina con papel de aluminio y manténgalo en hielo cuando no esté en uso.
Como la dopamina es oxidable, mantener la solución en hielo y protegida de la luz disminuirá la tasa de oxidación. Enrosque el alambre plateado en el portaelectrodos, luego enrosque el adaptador paramétrico am en el soporte de electrodos. A continuación, llene el electrodo tric con suficiente mercurio para entrar en contacto con el alambre de plata.
Cuando el electrodo esté montado en el adaptador, asegúrese de inspeccionar la fibra de carbono de bajo ruido pro CFE y el electrodo paramétrico bajo el microscopio para asegurarse de que la punta esté limpia e intacta. Asegúrese de sujetar el extremo más alejado de la fibra de carbono para proteger la punta de la fibra de carbono de daños. A continuación, monte el electrodo pro CFE Tric.
Posteriormente, monte el electrodo ensamblado en el manipulador hidráulico izquierdo para examinar la integridad del electrodo tric. Bájalo en una placa de Petri con fondo de vidrio que contenga la solución externa. Registre la corriente de referencia en ausencia de dopamina.
Luego agregue 10 microlitros de una solución de dopamina milimolar al plato. Un buen electrodo métrico emper debe registrar un aumento en la corriente oxidativa. Asegúrese de comprobar la integridad del electrodo métrico emper antes y después de los experimentos.
En este procedimiento, recupere las neuronas o células de dopamina diseñadas para expresar el transportador de dopamina colocadas en la placa de Petri con fondo de vidrio de la incubadora. Lave suavemente las células o las neuronas de dopamina tres veces con una solución externa tibia. Para visualizar las células y realizar el experimento, monte la placa de Petri con fondo de vidrio en la platina del microscopio y encuentre el punto focal correcto para visualizar las células con claridad.
A continuación, aplique presión positiva al electrodo de parche. Con una jeringa de un mililitro, introduzca suavemente ambos electrodos en la solución y acerque la célula con los micromanipuladores. A continuación, coloque el electrodo métrico emper en el lado izquierdo de la célula y el electrodo de parche a la derecha.
Cuando el electrodo de parche está en contacto con la celda. Aplique una succión ligera por la boca o la jeringa para formar un sello giga en la celda. Después de eso, rompa el sello con succión para lograr la configuración de la célula completa y espere de cinco a ocho minutos para la diálisis de la solución interna que contiene dopamina en la célula.
A continuación, registre las corrientes mediadas por DAT escalonando el voltaje de la membrana celular entre menos 60 y más 100 milivoltios desde un potencial de retención de menos 40 milivoltios a través de la pipeta. Para determinar la dopamina específica mediada por DAT, flx registre las corrientes métricas del emper en ausencia y presencia de un antagonista de DAT. A continuación, se determina la corriente tric específica mediada por DAT restando las trazas registradas en presencia de antagonista DAT de las trazas emper registradas sin el antagonista.
Una desviación hacia arriba en las corrientes trices corresponde a un flujo de dopamina hacia afuera que se muestra aquí. A DAT las corrientes mediadas se registran aumentando el voltaje de la membrana en 20 milivoltios entre menos 60 y más 100 milivoltios a partir de un potencial de retención de menos cuatro C milivoltios con la pipeta que contiene dos milimolares de dopamina en el modo de parcheo de toda la celda. Aquí está la corriente métrica Emper adquirida simultáneamente con la corriente de toda la celda.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el transporte inverso de dopamina a través del transportador de dopamina en una neurona sujeta de voltaje. Recuerde verificar la integridad del electrodo paramétrico antes y después de los experimentos, y no olvide restar las trazas registradas en presencia de ese antagonista de las trazas tric registradas sin el antagonista.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo describe una técnica para medir el transporte inverso de dopamina en neuronas mediante el acople simultáneo de registro con micropipeta y pirografía. El método permite evaluar la liberación mediada por el transportador de dopamina (DAT) mientras se controla el voltaje de la neurona.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Dinámica de neurotransmisores
Antecedentes
- La dopamina es un neurotransmisor fundamental implicado en diversas funciones cerebrales.
- El transportador de dopamina desempeña un papel clave en la regulación de los niveles de dopamina.
- Comprender los mecanismos de transporte inverso es esencial para obtener conocimientos sobre la señalización dopaminérgica.
- Esta técnica combina el bloqueo de voltaje con mediciones amperométricas para mejorar la precisión.
Objetivo del estudio
- Medir el transporte inverso de dopamina en neuronas con voltaje controlado.
- Investigar la relación entre la actividad del transportador de dopamina (DAT) y la liberación de dopamina.
- Proporcionar un método para estudiar la función de las neuronas dopaminérgicas en tiempo real.
Métodos Utilizados
- Evaluar la integridad del electrodo voltamétrico con dopamina.
- Obtener un parche de célula íntegra del neutrón utilizando una pipeta de parche.
- Controlar el voltaje celular mediante la pipeta de parche.
- Registrar la liberación de dopamina mediada por DAT utilizando el electrodo voltamétrico.
Resultados Principales
- Medición exitosa de la liberación de dopamina durante el bloqueo de voltaje.
- Se demostró el efecto de los inhibidores del DAT sobre el transporte de dopamina.
- Proporcionó información sobre los mecanismos reguladores del transporte de dopamina.
- Se validó el método para estudiar la dinámica neuronal de la dopamina.
Conclusiones
- La técnica mide eficazmente el transporte inverso de dopamina.
- El control simultáneo del voltaje mejora la comprensión de la función del DAT.
- Este método puede aplicarse a estudios adicionales sobre la señalización dopaminérgica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la medición directa del eflujo de dopamina a través del transportador de dopamina bajo control de voltaje, proporcionando una comprensión mecanicista de la función del transportador relevante para el descubrimiento de fármacos neuropsiquiátricos. Al aislar la liberación mediada por DAT en tiempo real, apoya la validación del blanco terapéutico y reduce los riesgos asociados a hipótesis sobre la señalización dopaminérgica en modelos de enfermedad. El enfoque mejora la confianza predictiva en las etapas iniciales del descubrimiento al vincular la actividad del transportador con la dinámica de los neurotransmisores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza el mecanismo de eflujo del transportador de dopamina para validar el compromiso funcional del blanco en neuronas vivas.
- Valor operativo: Permite la grabación simultánea electrofisiológica y amperométrica para correlacionar el potencial de membrana con el flujo de dopamina mediado por el transportador.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas y resueltas en el tiempo de corriente oxidativa que reflejan la liberación de dopamina dependiente de DAT bajo pasos de voltaje controlados.
- Valor operativo: Establece un formato de ensayo reproducible para medir el eflujo mediado por transportadores, facilitando la selección de compuestos moduladores de DAT.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la actividad de ef flujo de DAT con la homeostasis extracelular de dopamina, aportando información para modelos de enfermedades en los que se sospecha disfunción del transportador.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para enfermedades para evaluar perturbaciones genéticas o farmacológicas de la función del transportador de dopamina.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la eliminación de riesgos mecanicistas en los blancos del transportador de dopamina antes de los esfuerzos de identificación de compuestos activos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre mecanismos de inversión del transportador y la aclaración de vías en neuronas dopaminérgicas.
- Tamizaje: Proporciona salidas cuantitativas listas para ensayos, para evaluar los efectos de compuestos sobre la efusión mediada por DAT.
- Análisis: Ofrece mediciones simultáneas de corriente total de célula y amperometría para aislar señales específicas de DAT mediante sustracción farmacológica.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de la disregulación de la dopamina en sistemas neuronales con control de voltaje.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la función del transportador en múltiples modelos neuronales o contextos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del blanco al medir directamente la liberación de dopamina mediada por eflujo bajo control fisiológico de voltaje.
- Valor operativo: Favorece la estandarización del ensayo mediante la sincronización de la técnica de patch clamp y la amperometría, reduciendo la variabilidad en las mediciones del flujo de neurotransmisores.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al aclarar el mecanismo de acción del transportador, reduciendo la eliminación tardía por malentendidos mecanicistas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos dirigidos al DAT basada en datos funcionales de modulación del eflujo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología, amperometría y cultivo neuronal para mantener la integridad del electrodo y la fidelidad de la señal.
- Depende de instrumentación de bajo ruido, incluyendo manipuladores hidráulicos, amplificadores duales Axopatch 200B y electrodos de fibra de carbono para grabaciones simultáneas.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de voltaje y de los métodos de sustracción con antagonistas para garantizar la comparabilidad entre experimentos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes modelos neuronales, particularmente respecto a los niveles de expresión del transportador de dopamina y la salud de la membrana.
- Incluye limitaciones prácticas, como la oxidación de la solución de dopamina, que requiere manipulación protectora y validación de la línea base antes y después de los experimentos.
