Preparación de las rebanadas parasagitales para la Investigación de dorsal-ventral Organización de los roedores de corteza entorrinal medial

Se describen los procedimientos para la preparación y registro electrofisiológico de rodajas de cerebro que mantienen el eje dorsal-ventral medial de la corteza entorrinal (MEC). Debido a que la codificación neural de la localización sigue una organización dorsal-ventral en el MEC, estos procedimientos de facilitar la investigación de los mecanismos celulares importantes para la navegación y la memoria.

El objetivo general del siguiente experimento es examinar la organización topográfica de las propiedades sinápticas e integrativas de las neuronas en la corteza RH de entrada medial. Esto se logra mediante la preparación de cortes de la corteza RH de entrada medial orientados en un plano ventral dorsal. Como segundo paso, se realizan registros de pinzas de parche en las neuronas de la corteza RH para investigar sus propiedades sinápticas e integrativas.

A continuación, se determina la ubicación de la neurona registrada para evaluar la organización ventral dorsal de las propiedades electrofisiológicas medidas. Se obtienen resultados que muestran la organización topográfica de las propiedades intrínsecas de las células estrelladas en la capa dos a partir de las mediciones de su resistencia de entrada, constante de tiempo de membrana y umbral de potencial de acción, demostrando el procedimiento Hugh Pastel, un estudiante graduado de mi laboratorio. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los cortes de cerebro orientados horizontalmente, es que se puede registrar con precisión la posición de la neurona registrada a lo largo del eje ventral dorsal de la corteza interna.

Para comenzar este procedimiento, retire el cerebro del ratón e inmediatamente colóquelo en un corte en frío. Líquido cefalorraquídeo artificial burbujeante con carbógeno. Después de tres minutos, retire con cuidado el cerebro del esqueje A LCR con una espátula.

Colóquelo suavemente en posición vertical sobre el papel de filtro que se ha humedecido con el corte A CSF. Luego, use una navaja de afeitar o un bisturí para extirpar la mayor cantidad posible del cerebelo sin afectar la corteza enteral medial, que se encuentra en el extremo cordal del cerebro. Extirpar la parte rostral del cerebro seccionando en el plano coronal.

A continuación, hemis sec, el cerebro en el plano vertical de la línea media. Después de eso, regrese los hemisferios al corte burbujeante de un CSF durante un minuto y medio antes de montar. Asegúrese de que el borde cortante de la cuchilla de vibrato tenga un ángulo de 20 grados con respecto a la horizontal En la superficie de montaje, haga una tira poco profunda de superpegamento paralela a la hoja de vibrato, aproximadamente del ancho de una semiesfera y lo suficientemente larga como para acomodar las dos semiesferas de extremo a extremo.

A continuación, transfiera cada hemisferio del corte de un LCR a la superficie de montaje colocando el hemisferio de modo que su superficie medial descanse sobre la espátula y su extensión dorsal mire hacia la hoja de tono vibratorio. Deslice suavemente la semiesfera sobre la tira de superpegamento y asegúrese de que la superficie medial de cada hemisferio esté paralela a la base del vibrato. Después de eso, sumerja inmediatamente los hemisferios en un corte en frío.

Un líquido cefalorraquídeo. Mantenga la temperatura y la saturación durante todo el procedimiento de corte. Con el vibram, retire las cortezas de ambos hemisferios en el plano sagital hasta que la parte más lateral de la corteza enteral medial en cada hemisferio se identifique al menos a 600 micrómetros de la superficie lateral.

La extensión lateral de la corteza enteral medial se identifica por la ausencia de la banda blanca gruesa alrededor de la curva del cordón ventral del hipocampo. La forma no convexa de su límite rostral y la esquina angular del cordón dorsal cortan secciones sagitales de 400 micras desde ambos hemisferios hasta alcanzar la extensión medial de la corteza enteral medial. Después de cada corte, coloque inmediatamente las rodajas en un líquido cefalorraquídeo patrón A saturado de carbógeno mantenido en un baño de agua a 35 grados centígrados e incube durante aproximadamente 15 minutos.

Después de 15 minutos, retire el soporte para rebanadas del baño de agua y continúe burbujeando con carbógeno a temperatura ambiente durante al menos 45 minutos. Transfiera una rebanada a la cámara de registro, que está continuamente burbujeada con carbógeno saturado estándar A-C-S-F-A 35 grados Celsius. A continuación, identifique una región de registro aproximada dentro de la corteza RH de entrada medial.

A continuación, cambie a un objetivo de gran aumento. Identificar células viables dentro de esta región. En este punto, se pueden llevar a cabo experimentos utilizando la pinza de parche convencional de célula entera para registrar el potencial de membrana o la corriente de membrana de las neuronas identificadas.

La identidad neuronal se puede verificar a partir de las propiedades electrofisiológicas de la neurona registrada y mediante la inclusión de etiquetas fluorescentes dentro de la solución intracelular. Después del experimento para determinar la posición de una neurona registrada a lo largo del eje ventral dorsal, cambie a un objetivo de bajo aumento. Marque la ubicación de interés incluyendo el electrodo de registro en una imagen o bajando el diafragma del iris de campo.

Para dejar un círculo brillante alrededor de la ubicación de interés en una imagen duplicada, la región medial y la corteza HR y las áreas circundantes del corte para identificar la ubicación de grabación dentro de la imagen, el duplicado se puede superponer a la imagen inicial de la ubicación de grabación y sus alrededores. Es posible que se requieran hasta tres imágenes separadas de bajo aumento para cubrir el área desde una ubicación de registro ventral hasta el borde dorsal de la corteza interal medial. Estas imágenes se pueden unir utilizando un software de manipulación de imágenes.

El borde dorsal de la corteza enteral medial proporciona un punto de referencia conveniente para medir la posición ventral dorsal, pero el borde ventral de la corteza enteral medial no está tan bien definido. Aquí. Las secciones parasagitales DIC y NIAL muestran el hipocampo circular y la ausencia de una protuberancia paras orbicular en la capa uno de la corteza enteral lateral, respectivamente. Se trata de imágenes de los típicos cortes que contienen la corteza enteral medial.

El área de los paras está claramente revelada por las manchas de los misiles. En las imágenes correspondientes, el borde dorsal de la corteza enteral medial indicado por la flecha negra es ventral al grupo de células paras orbiculares que sobresale en la capa uno, como lo indica la flecha roja. A continuación se muestra un ejemplo de una imagen compuesta con cuatro aumentos de un corte sagital parasagital.

Las posiciones de una célula dorsal y una célula ventral se indican mediante círculos rellenos de azul y verde respectivamente. La flecha negra marca el borde dorsal estimado de la corteza interal medial y se extiende hacia las capas profundas por la línea punteada blanca. La línea blanca continua es una guía que muestra la trayectoria del contorno, a lo largo de la cual se muestra la medición de píxeles de la distancia desde el borde dorsal de la corteza interal medial hasta las células celulares ubicadas ventralmente de las células estrelladas dorsal y ventral marcadas.

Estos registros ayudan a establecer la identidad de las células e ilustran cómo las propiedades eléctricas de la corteza medial entran en la corteza. Las células estrelladas de la capa dos difieren en las ubicaciones dorsal y ventral al intentar este procedimiento. Es importante recordar que hay que tener mucho cuidado durante la preparación de los cortes, ya que los cortes de alta calidad son esenciales para registros electrofisiológicos productivos.