El seguimiento de los reductores y oxidativo semirreacciones de una flavina monooxigenasa dependiente del uso de espectrofotometría de flujo detenido
18 de marzo de 2012
Se describe la utilización de un instrumento de flujo detenido para investigar tanto los reductores y oxidativa semirreacciones de Aspergillus fumigatus Un sideróforo (SIDA), una flavina monooxigenasa dependiente. A continuación, muestran los espectros correspondientes a las especies en la reacción de Sida y el cálculo de las constantes de velocidad de su formación.
Este procedimiento utiliza un instrumento de flujo detenido para detectar las diferentes formas espectrales de SID A y medir las velocidades. La reacción catalizada por SID A puede dividirse en las semirreacciones reductora y oxidativa del FAD. La flavina oxidada se une al N-A-D-P-H y reacciona para formar flavina reducida y NADP más, y la reacción con oxígeno molecular y la unión de ornitina dan lugar a la formación de C cuatro.
Una flavina hidroxilada tras la hidroxilación de ornitina, la flavina hidroxilada se deshidrata para formar la enzima oxidada. NA DP más permanece unido durante todo el ciclo catalítico y es el último sustrato en liberarse. El instrumento de flujo detenido facilita la mezcla rápida de pequeños volúmenes de reactivos y registra.
Los cambios espectrales a lo largo del tiempo en un espectrofotómetro de flujo permiten medir la velocidad de formación y desaparición de intermediarios transitorios en una reacción catalizada por enzima. Dos miembros de mi laboratorio, Rita Robinson y Enviro Romero, demostrarán estos experimentos utilizando la flavina monooxigenasa como sistema modelo. Vierta 250 mililitros de tampón fosfato de potasio 100 milimolar en un matraz Büchner de 500 mililitros que contenga una barra de agitación.
Cierre el matraz con un tapón de goma, luego colóquelo sobre una placa agitadora y conecte el tubo corto del matraz a una línea de vacío. Desgasifique el tampón bajo vacío durante una hora a temperatura ambiente con agitación, seguido de un lavado con argón. Repita cinco veces.
Finalmente, enjuague el matraz con argón durante 10 segundos. Desconecte el matraz del sistema de vacío y colóquelo dentro de la caja de guantes. Continúe agitando vigorosamente con el matraz abierto.
Llene las jeringas del depósito con soluciones de glucosa a 18,13 unidades por mililitro de glucosa oxidasa y 100 milimolares. Ahora coloque las válvulas de accionamiento en la posición de carga. Llene las jeringas de accionamiento.
A continuación, gire la válvula F a la posición de accionamiento. Utilizando el software de control pro data, haga clic en vaciar la jeringa de parada y luego impulse el tampón desde la jeringa de accionamiento F a través del circuito de flujo elevando manualmente el émbolo de accionamiento correspondiente. Continúe con las otras tres jeringas de accionamiento y equilibre durante una hora.
Ahora rellene las jeringas del depósito y repita el lavado del sistema con flujo detenido. Para preparar el tampón saturado con oxígeno, burbujee la solución con oxígeno al 100 % durante una hora con agitación.
Luego retire la aguja corta del vial y espere 10 segundos. Proceda a retirar la aguja larga y coloque el vial cerrado en la caja de guantes. Para la solución de N-A-D-P-H.
Coloque un tubo einor de 1,5 mililitros que contenga un miligramo de N-A-D-P-H dentro de la cabina de guantes. Disuelva en 300 microlitros de tampón fosfato de potasio anaeróbico 100 milimolar, pH 7,5.
Retire 30 microlitros para determinar la concentración de N-A-D-P-H. Ahora, para eliminar el oxígeno del stock de enzima, transfiera la solución a un vial de 25 mililitros que contenga una barra de agitación, una tapa con junta y tapón, y un sello de aluminio. Coloque sobre hielo.
Conéctese a una línea Schlenk, luego desgasifique al vacío durante 20 minutos, seguido de un purgado con argón. Finalmente, purgue el vial con argón durante 10 segundos y desconéctelo del sistema de vacío. Coloque el vial sobre hielo dentro de la caja de guantes.
En la ventana del panel de control del software de control pro data, seleccione matriz de fotodiodos, disparo externo y escala logarítmica. Además, inicie el software pro data viewer y defina el directorio para el almacenamiento de archivos de datos.
Ahora sustituya la solución en las jeringas de depósito C y F con tampón de fosfato de potasio anaeróbico 100 milimolar, pH 7,5. Gire las válvulas C y F a la posición de accionamiento. Haga clic en vaciar la jeringa de parada en el software de control de datos pro.
Luego, impulse el tampón desde ambas jeringas de accionamiento a través del circuito de flujo elevando manualmente el émbolo de accionamiento correspondiente. Repita el lavado con las jeringas de reserva C y F otras tres veces. Para asegurar la eliminación completa de la glucosa oxidasa del circuito de flujo, proceda a hacer clic en línea base en el software de control de datos pro.
Sustituya la solución del jeringa del depósito F con la solución enzimática. Gire la válvula F a la posición de accionamiento. Haga clic en vaciar la jeringa de parada en el software de control de datos pro.
Presione la solución enzimática desde la jeringa motriz F a través del circuito de flujo elevando manualmente el émbolo motriz correspondiente. Regrese al software de control de datos pro y establezca el tiempo de adquisición en 60 segundos. Verifique que ambas jeringas motorizadas estén llenas con sus soluciones respectivas y que los émbolos motorizados estén en contacto con los pistones de las jeringas motorizadas.
Gire ambas válvulas a la posición de impulso y haga clic en adquirir en el software de control de datos Pro para realizar el impulso. Adquiera datos espectrales de la forma oxidada de la enzima por triplicado utilizando el valor de 452 nanómetros obtenido de los impulsos. Determine la concentración de la enzima antes de mezclar y prepare cuatro mililitros de solución de N-A-D-P-H.
Llene la jeringa del depósito C con una solución de N-A-D-P-H que sea 1,5 veces más concentrada y vacíe y vuelva a llenar la jeringa de parada tres veces, como se mostró anteriormente. Ahora, adquiera espectros durante la reducción de la enzima, lavando el contenido del circuito de flujo con tampón anaeróbico de fosfato de potasio 100 milimolar, pH 7,5. A continuación, haga clic en línea base en el software de control de datos Pro.
Luego mezcle 200 microlitros de solución stock de enzima con 1000 microlitros de tampón anaeróbico de fosfato de potasio 100 milimolar, pH 7,5. Reemplace la solución del émbolo del depósito A con la solución de enzima.
Gire la válvula A a la posición de accionamiento en el software de control Pro Data. Haga clic en detener la jeringa vacía. Pase la solución enzimática desde la jeringa de accionamiento A a través del circuito de flujo elevando manualmente el émbolo de accionamiento correspondiente.
Establezca el tiempo de retardo en 0,5 segundos y el tiempo de adquisición en 60 segundos. Verifique que todas las jeringas de accionamiento estén llenas con sus soluciones correspondientes y que los émbolos de accionamiento estén en contacto con los pistones de las jeringas de accionamiento. Luego, coloque todas las válvulas de accionamiento en la posición de accionamiento y haga clic en adquirir en el software de control de datos pro.
Obtenga datos espectrales de la forma oxidada de la enzima por triplicado. A continuación, sustituya la solución de la jeringa del depósito B por una solución de N-A-D-P-H, 1,5 veces más concentrada que la solución de enzima en la jeringa A. Gire la válvula B a la posición de accionamiento y vacíe y rellene la jeringa de parada tres veces, como se mostró anteriormente en la ventana del panel de control.
Establezca el tiempo de retardo en 0,5 segundos. Tras una adquisición de 20 segundos, reemplace la solución del jeringa de reserva con el tampón oxigenado. Gire la válvula C a la posición de accionamiento.
Lave tres veces en el software de control de datos pro. Establezca el tiempo de retardo en 15 segundos y el tiempo de adquisición en 900 segundos. Continúe adquiriendo espectros durante la reoxidación de la enzima completamente reducida en el instrumento de flujo detenido.
La reducción anaeróbica de SID A con N-A-D-P-H puede monitorizarse midiendo los cambios en el estado redox del flavín utilizando absorbancia a 452 nm. Los cambios espectrales se registran a lo largo del tiempo desde el SID A oxidado hasta el último espectro del SID A completamente reducido. La velocidad de este paso enzimático puede determinarse ajustando los datos a la ecuación apropiada. La velocidad de oxidación y los intermediarios de la reacción también pueden determinarse utilizando el modo de mezcla doble del flujo detenido en esta reacción por AF Sid A. El intermediario hidroxiflavínico C cuatro A se detecta claramente con un λ máx de 380 nanómetros, mientras que la enzima oxidada presenta un λ máx de 450 nanómetros.
Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cuatro a seis horas si se realiza adecuadamente. Recuerde asegurarse de que las soluciones sean anaeróbicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar tanto el ion relativo como el ulcerativo de FLA independiente mediante experimentos posteriores más avanzados, como la química rápida.
Quentin puede ayudar a elucidar la naturaleza triste de los intermedios.
Descripción general
Este estudio utiliza un instrumento de flujo detenido para analizar las semirreacciones reductivas y oxidativas de la sideróforo A (SidA) de Aspergillus fumigatus, una monooxigenasa dependiente de flavina. La investigación incluye el análisis espectral de los intermediarios de la reacción y el cálculo de las constantes de velocidad para su formación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Enzimología
- Espectroscopía
Antecedentes
- Aspergillus fumigatus es un patógeno fúngico importante.
- La sideróforo A (SidA) desempeña un papel crucial en la adquisición de hierro.
- Las monooxigenasas dependientes de flavina son importantes para diversas reacciones bioquímicas.
- Comprender los mecanismos de reacción puede ayudar en el desarrollo de estrategias antifúngicas.
Objetivo del estudio
- Investigar los mecanismos de reacción de SidA.
- Medir las constantes de velocidad de los intermediarios de reacción.
- Proporcionar información sobre el ciclo catalítico de las enzimas dependientes de flavina.
Métodos Utilizados
- Espectroscopía de flujo detenido para mezclado rápido y análisis espectral.
- Preparación de condiciones anaeróbicas para reacciones enzimáticas.
- Medición de cambios espectrales a lo largo del tiempo para determinar la cinética de la reacción.
- Uso de tampones y reactivos específicos para facilitar las reacciones.
Resultados Principales
- Identificación de diferentes formas espectrales de SidA durante las reacciones.
- Cálculo de constantes de velocidad para la formación de intermediarios de reacción.
- Demostración del ciclo catalítico que involucra NADP y oxígeno.
- Caracterización de intermediarios transitorios en la ruta de reacción.
Conclusiones
- La técnica de flujo detenido es eficaz para estudiar la cinética enzimática.
- Los conocimientos obtenidos pueden orientar investigaciones futuras sobre enzimas dependientes de flavina.
- Los hallazgos contribuyen al entendimiento del metabolismo fúngico.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La espectrofotometría de flujo detenido permite un análisis cinético preciso de las reacciones de monooxigenasas dependientes de flavina, apoyando la desestimación de riesgos mecanicísticos y la validación de dianas en las fases iniciales del descubrimiento. Al resolver las semirreacciones reductora y oxidativa y cuantificar los intermediarios transitorios, este enfoque aumenta la confianza predictiva en carteras dirigidas a enzimas. La adaptabilidad del método a otros sistemas dependientes de flavina lo posiciona como una capacidad reutilizable en I+D de biofármacos.&D pipelines.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la medición directa de constantes de velocidad intrínsecas para la comprobación de hipótesis mecanicistas.
- Posibilita la identificación y caracterización de intermediarios catalíticos para la validación funcional de dianas.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos al aclarar las rutas de reacción enzimática.
- Mejora la confiabilidad predictiva para avanzar dianas enzimáticas en carteras de descubrimiento.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona lecturas espectrales validadas para la estandarización y reproducibilidad de ensayos.
- Permite el seguimiento cuantitativo de los estados redox de enzimas para una evaluación confiable de compuestos.
- Facilita la preparación de sistemas biológicos robustos para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Permite la reutilización de la plataforma en diferentes objetivos de monooxigenasas dependientes de flavina.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona información mecanicista con sistemas enzimáticos relevantes para la enfermedad cuando sea aplicable.
- Garantiza la continuidad desde la validación cinética en fase de descubrimiento hasta la selección de modelos preclínicos.
- Contribuye a decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la clarificación de mecanismos catalíticos.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales mediante la detección cuantitativa de intermediarios.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la identificación de compuestos prometedores, proporcionando claridad mecanicista antes del avance preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al resolver las semirreacciones reductivas y oxidativas.
- Selección: Proporciona resultados espectrales cuantitativos y reproducibles para la preparación del ensayo.
- Análisis: Permite la medición de constantes de velocidad y la detección de intermediarios transitorios para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos mecanicistas con la selección de modelos preclínicos cuando los blancos enzimáticos son relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo estandarizado adaptable a otras monooxigenasas dependientes de flavina.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas enzimáticas.
- Valor operativo: Proporciona mediciones cinéticas estandarizadas, reproducibles y escalables.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del proyecto y una selección eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de los activos dirigidos a enzimas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en enzimología y análisis de datos cinéticos.
- Necesita acceso a espectrofotometría de flujo interrumpido y a infraestructura para manipulación anaeróbica.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos en la preparación de tampones y la calibración de instrumentos.
- Adaptable a diversos sistemas de monooxigenasas dependientes de flavina con una optimización adecuada.
- Depende del mantenimiento de condiciones anaeróbicas estrictas para la medición precisa de la semirreacción.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Anaerobic Buffer
2:24
Removing Oxygen from the Stopped-flow System
3:22
Key Solutions
4:45
Reductive Half-reaction: Monitoring Flavin Reduction
7:31
Oxidative Half-reaction: Monitoring Flavin Oxidation
10:10
Stopped Flow: Spectral Forms of Af SidA
11:27
Conclusion
