Name: El seguimiento de los reductores y oxidativo semirreacciones de una flavina monooxigenasa dependiente del uso de espectrofotometría de flujo detenido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprende a analizar las semirreacciones reductivas y oxidativas de SidA de Aspergillus fumigatus mediante espectrofotometría de flujo detenido. Este método permite medir constantes de velocidad de intermediarios enzimáticos.

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La investigación apoyada por el premio de la NSF MCB-1021384.

1. Preparación de tampón anaeróbico <ol><li> Preparar 1 l de 100 mM de tampón fosfato de potasio, pH 7,5. Verter 250 ml del tampón en un matraz de 500-ml Büchner con una barra agitadora. </li><li> Tapar el matraz con un tapón de goma y colocarlo en una placa de agitación. Conectar el tubo corto del matraz a una línea de Schlenk. </li><li> Desgasificar el tampón de bajo vacío durante 5 horas a temperatura ambiente con agitación. Durante este período de tiempo, lleve a cabo 5 rondas consecutivas de desgasificación al vacío y lavado con argón cada hora. </li><li> Enjuagar el matraz con argón durante 10 segundos y desconectarlo de el colector de vacío. Colocar el frasco dentro de la guantera. </li><li> Mantener el matraz abierto en la guantera durante la noche con agitación vigorosa. </li></ol> 2. Extracción de oxígeno del sistema de flujo detenido <ol><li> Preparar 1 l de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0. Verter 125 ml de este tampón en un matraz de 250-ml Büchner y realizar los pasos 1.2-1.4. </li><li> Pesar 5mg de glucosa oxidasa de Aspergillus niger (181.300 U / g) y 0,9 g de glucosa utilizando un tubo Eppendorf de 1,5 ml y 50 ml tubo Falcon cónica, respectivamente. Coloque ambos recipientes en la guantera. </li><li> Disolver la glucosa oxidasa y glucosa en 50 ml de acetato de sodio anaerobia 0,1 M, pH 5,0 (concentración final de 18,13 U / ml y 100 mm, respectivamente). Llenar las jeringas de depósito con esta solución (Figura 1). </li><li> Asegúrese de que las válvulas de la unidad están en la &quot;carga&quot; la posición y llenar las jeringas unidad (Figura 1). Gire la válvula de F a la &quot;unidad&quot; de posición. Vacíe la jeringa parada haciendo clic en Vaciar en el software de control Pro-Data. Empuje el búfer de la unidad F jeringa a través del circuito de flujo manualmente aumentar la memoria RAM de la unidad correspondiente. Repita este paso diez veces en total. Realice el mismo procedimiento con los otros tres jeringas de accionamiento. Espere una hora. </li><li> Sustituir la solución de las jeringas de depósito con el mismo tampón contaiNing glucosa oxidasa y glucosa. Repita el paso 2.4. </li><li> Repita el paso 2.5 y permitir que la solución permanezca en el sistema de flujo durante la noche. </li><li> Después de la incubación durante la noche, repita el paso 2.5. </li></ol> 3. Preparación de tampón de oxígeno saturado <ol><li> Preparar 100 mM de tampón fosfato potásico (pH 7,5) y verter 50 ml en un vial de 50 ml con una barra agitadora. Tapar el frasco con un tapón de Wheaton y un sello de aluminio de Wheaton. </li><li> Coloque el vial en el hielo. Sumergir una aguja larga conectada a un tanque que contiene 100% de oxígeno en la solución. Introduzca otra aguja corta a través del tapón del vial como una salida. </li><li> Burbuja de la solución con oxígeno al 100% durante 1 hora con agitación. </li><li> Primero retire la aguja corta del vial y espere 10 segundos antes de retirar la aguja larga. Coloque el frasco cerrado en la guantera. </li></ol> 4. Preparación de la solución de NADPH <ol><li> Pesar 1 mg de NADPH en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y coloque it en la guantera. </li><li> Disolver el NADPH en 300 l de anaeróbica 100 mM de tampón fosfato de potasio, pH 7,5. Retire 30 l de esta solución de la guantera para determinar la concentración de NADPH con un espectrofotómetro (340 nm ε = 6270 M -1 cm -1). </li></ol> 5. La eliminación de oxígeno de la solución de enzima <ol><li> Tomar 400 mL de solución de enzima de valores del congelador y descongele en la guantera. La solución madre de enzima (360 mM) se preparó previamente en 100 mM de tampón fosfato potásico (pH 7,5) que contenía NaCl 100 mM, y se congelaron en nitrógeno líquido. </li><li> Transferir la solución de la enzima en un vial de 25 ml con una barra de agitación, tapar el frasco con un tapón de Wheaton y un sello de aluminio de Wheaton y retirar de la guantera. </li><li> Coloque el vial en hielo y conectarlo a una línea de Schlenk mediante la inserción de una aguja a través del tapón del vial. </li><li> Desgasificar la solución de la enzima mediante la realización de 5 rondas consecutivas dedesgasificación al vacío y lavado con argón cada 20 minutos durante 1 hora. </li><li> Enjuague bien el vial con argón durante 10 segundos y desconectarlo del colector de vacío. Coloque el vial en hielo dentro de la guantera. </li></ol> 6. Reductora de medio de reacción: Reducción de Monitoreo Flavin <ol><li> Preparación del instrumento de flujo detenido y el software de control Pro-Data para el modo individual de mezcla siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Encienda un baño de agua circulante (15 ° C). Quitar el oxígeno del agua burbujeando nitrógeno a través de ella durante 20 minutos. Esto evita la contaminación de oxígeno a través del circuito de flujo. </li><li> Mantener la temperatura de las jeringas de accionamiento y la celda de observación a 15 ° C mediante la conexión de la carcasa baño de agua de la flujo detenido al baño circulante. </li><li> En la ventana Panel de control de la matriz de control de datos de software de Pro-Fotodiodo de selección, disparo externo (para activar la operación de flujo detenido), y LogaritCuerpo de Inspectores de escala. </li><li> Inicie el software de visualización de datos de Pro-y definir el directorio donde los archivos de datos serán almacenados. </li><li> Sustituir la solución de depósito de jeringas C y F con anaeróbica 100 mM de tampón fosfato potásico (pH 7,5). Encienda el aire y las válvulas F a la &quot;unidad&quot; de posición. Vacíe la jeringa parada haciendo clic en Vaciar en el software de control Pro-Data. Presione el buffer de las dos jeringas de accionamiento a través del circuito de flujo manualmente levantando la unidad correspondiente de carnero cinco veces en total (haga clic en Vaciar antes de cada movimiento de la memoria RAM). </li><li> Con el fin de asegurar que la glucosa oxidasa se ha eliminado por completo del circuito de flujo, realice el paso 6.6 cuatro veces en total. </li><li> Haga clic en la línea de base en el software de control Pro-Data. </li><li> Mezclar 100 l de solución madre de enzima con 1100 l de anaeróbica 100 mM de tampón fosfato de potasio (concentración final después de mezclar en el flujo se detuvo a 15 micras). </li><li> Vuelva a colocar la solución de depósito de syrInge F con la solución de enzima. Gire la válvula de F a la &quot;unidad&quot; de posición. Vacíe la jeringa parada haciendo clic en Vaciar en el software de control Pro-Data. Empuje la solución de enzima a partir de la unidad F jeringa a través del circuito de flujo por manualmente elevar el pistón de accionamiento correspondiente. Realice esto tres veces en total. En el software de control Pro-Data, establecer el tiempo de adquisición a 60 s. </li><li> Asegurarse de que ambas jeringas de accionamiento están llenos con sus correspondientes soluciones y la unidad de carneros están en contacto con los pistones impulsores de la jeringa. Abra las dos válvulas a la &quot;unidad&quot; y haga clic en la posición de adquirir en el software de control Pro-Data para llevar a cabo la unidad. Repetir este paso dos veces más para obtener los datos, por triplicado. Esta rendimientos espectros de la forma oxidada de la enzima. </li><li> Usando el valor de A 452 nm, obtenido a partir de las unidades, determinar la concentración de la enzima antes de la mezcla (ε 452 nm = 13700 M -1 cm -1) y preparar a 4 ml de una soluci NADPHn de 1,5 veces más concentrada. </li><li> Vuelva a colocar la solución de depósito de la jeringa C con la solución de NADPH y vaciar y llenar la jeringa parada tres veces como se describe en 6,10. </li><li> Repita el paso 6.11. Esta rendimientos espectros durante la reducción de la enzima. </li></ol> 7. Oxidativo Half-reacción: La oxidación de Vigilancia Flavin <ol><li> Preparación del instrumento de flujo detenido y el software de control Pro-Data para el modo de doble mezcla siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Repita los pasos 6.2-6.5. </li><li> Sustituir la solución en los cuatro jeringas de depósito y anaeróbica 100 mM de tampón fosfato potásico (pH 7,5). Gire la válvula de F a la &quot;unidad&quot; de posición. Vacíe la jeringa parada haciendo clic en Vaciar en el software de control Pro-Data. Empuje el búfer de la unidad F jeringa a través del circuito de flujo manualmente aumentar la memoria RAM de la unidad correspondiente. Realice este paso cinco veces en total con cada jeringa unidad. </li><li> Realice el paso 7.3 en cuatro ocasiones en totAl eliminar completamente el contenido del circuito de flujo. </li><li> Haga clic en la línea de base el software de control Pro-Data. </li><li> Mezclar 200 l de solución madre de enzima con 1000 l de anaeróbica 100 mM de tampón fosfato de potasio (concentración final después de mezclar en el flujo se detuvo a 15 micras). </li><li> Sustituir la solución de la jeringa depósito A con la solución de enzima. Gire la válvula de la A a la &quot;unidad&quot; de posición. Vacíe la jeringa parada haciendo clic en Vaciar en el software de control Pro-Data. Empuje la solución de enzima de la jeringa la unidad A través del circuito de flujo por manualmente elevar el pistón de accionamiento correspondiente. Realice este paso tres veces en total. En el software de control Pro-datos, establezca el tiempo de retardo de 0,5 s y el tiempo de adquisición a 60 s. </li><li> Asegurarse de que todas las jeringas de accionamiento están llenos con sus correspondientes soluciones y la unidad de carneros están en contacto con los pistones impulsores de la jeringa. Gire todas las válvulas a la &quot;unidad&quot; y haga clic en la posición de adquirir en el Pro-Datun software de control para realizar la unidad. Repetir este paso dos veces más para obtener los datos, por triplicado. Esta rendimientos espectros de la forma oxidada de la enzima. </li><li> Sustituir la solución de la jeringa depósito B con una solución de NADPH 1,5 veces más concentrada que la solución de enzima en jeringa A. Gire la válvula B a la &quot;unidad&quot; posición y vaciar y rellenar la jeringa parada tres veces como se describe en 7,7. </li><li> Vuelva a colocar la solución de depósito de la jeringa C con tampón oxigenado. Gire la válvula de C a la &quot;unidad&quot; y la posición de vaciar y llenar la jeringa parada tres veces como se describe en 7.7. En el software de control Pro-datos, establezca el tiempo de retardo y la adquisición de 15 y 900 s, respectivamente. </li><li> Repita el paso 7.8. Esta rendimientos espectros durante la reoxidación de la enzima totalmente reducido. </li></ol> 8. Análisis de Datos <ol><li> Inicie el software de conversión de Pro-Data. Haga clic en el icono de Opciones y seleccione Guardar en ProDataCSV. </li><li> Abiertoel directorio donde los ficheros de datos fueron almacenados. Arrastre los archivos a la ventana del convertidor APL Pro-Data. Los datos se guardan automáticamente como archivos de formato CSV en el mismo directorio. </li><li> Abrir los archivos de formato CSV con Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.). Normalizar la línea de base de las huellas de flujo detenido restando la absorción correspondiente a 700 nm. </li><li> Analizar las huellas corregidos utilizando KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) mediante el ajuste de la trama de la absorción a un máximo en función del tiempo que corresponde a la función exponencial adecuada. Como se muestra en la Figura 2B, la absorbancia a 452 nm se representa como una función del tiempo con el fin de determinar el porcentaje de reducción flavina después de mezclar la enzima y NADPH en el instrumento de flujo detenido. En este caso, el mejor ajuste de los datos se obtuvieron usando una ecuación de doble exponencial y las tasas de 0,65 y 0,23 s -1 se calcularon para la primera y segunda fase de la reducción, RESpectivamente. Para determinar la tasa de formación del intermedio C4a-hydroperoxyflavin y la reoxidación después de reaccionar con la enzima reducida de oxígeno, se analizaron las huellas de flujo detenido a 380 nm y 452, respectivamente (Figura 3B). Utilizando una ecuación exponencial simple, se calcularon las tasas de 1,4 y 0,006 s-1 para la primera y segunda etapa de la oxidación de medio de reacción, respectivamente. </li></ol> 9. Los resultados representativos Los resultados de los experimentos descritos en las secciones anteriores muestran cómo la reductiva medio de reacción de A Sida f pueden ser controlados mediante la medición de los cambios en la absorbancia a 452 nm, que corresponden a los cambios en el estado redox de la flavina. La tasa de este paso se puede determinar mediante el ajuste de los datos a la ecuación apropiada (Figura 2; Paso 8,4). La tasa de reducción obtenida (0,65 s -1) es similar al valor k gato calculado conestado estacionario experimentos 2, lo que sugiere que la reducción es la etapa determinante de velocidad de la reacción. Tomando ventaja del modo de doble mezcla del flujo detenido, la velocidad de oxidación y los productos intermedios en este medio de reacción puede ser determinado (Figura 3; Paso 8,4). En la reacción catalizada por una Sida f, el C4a-hydroperoxyflavin está claramente detectada (λ máximo de 380 nm), y la velocidad de formación y descomposición se puede calcular. El lento ritmo de la reoxidación obtenido (0,006 s -1) indica que el C4a-hydroperoxyflavin es muy estable en ausencia de la ornitina. <img alt="Esquema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Esquema 1. Mecanismo de A f Sida. El anillo isoallozaxine del cofactor FAD se muestra. El oxidado flavina (A) se une a NADPH (B) y reacciona para formar reducido flavina y NADP + (C). Después de la reacción con el oxígeno molecular y la unión deornitina, el C4a-hydroperoxyflavin se forma (D). Esta es la especie hidroxilante. Después de la hidroxilación de la ornitina, la hydroxyflavin (E) debe ser deshidratado para formar la enzima oxidada. NADP + permanece unido a través del ciclo catalítico y es el último producto para ser lanzado (F). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figura 1. El instrumento de flujo detenido. A) Imagen de los componentes de la SX20 Aplicada Fotofísica espectrofotómetro de flujo detenido. B) Imagen de la unidad de manejo de la muestra. C) Esquema del circuito de flujo en el modo de mezcla doble. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figura 2. La reducción anaeróbica de Sida con NADPH en el instrumento de flujo detenido. A) cambios espectrales registradas después de la mezcla de volúmenes iguales de 30 mM Sida y 45 NADPH m. El primer espectro (oxidado Sida) y el espectro de última (totalmente reducida SidA) está resaltada en azul y rojo, respectivamente. B) Absorbancia traza a 452 nm registrados como una función del tiempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figura 3. Oxidación de Sida en el instrumento de flujo detenido. A) cambios espectrales registró después de la mezcla de volúmenes iguales de la ASDI completamente reducido y el tampón oxigenado. Las concentraciones finales fueron de 15 mM Sida, el 22,5 mM de NADPH y oxígeno 0,95 mM. El espectro registrado a 0,034, 4,268, y 727,494 s corresponde a la enzima totalmente reducido, el intermedio C4a-hydroperoxyflavin (λ máximo de 380 nm), y la enzima oxidada (λ máximo de 450 nm), respectivamente. B) traza Absorbancia a 382 nm y 452 registra como una función del tiempo.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Las enzimas que catalizan reacciones redox por lo general contienen cofactores tales como grupos hemos y flavinas que experimentan cambios significativos de absorbancia durante el ciclo catalítico. La forma oxidada del flavina presenta máximos de absorbancia a ~ 360 nm y 450, y su reducción es vigilado siguiendo la disminución de absorbancia a 450 nm 7. En general, algunos intermedios transitorios están presentes, pero la forma y el deterioro demasiado rápido para ser medido en espectrofotómetros regulares. Usando el Aplicadas Fotofísica SX20 espectrofotómetro de flujo detenido (o instrumentos similares), es posible medir los cambios de absorbancia en la escala de tiempo de milisegundos (tiempo muerto, 2 ms). Aquí se estudiaron los reductores y oxidativa semirreacciones de la monooxigenasa flavina-dependiente Una Sida f, sirviendo como un modelo. La tasa de transferencia de hidruro se determinó midiendo el cambio de absorbancia a 452 nm después de mezclar la enzima con NADPH bajo condiciones anaeróbicas. Posteriormente, teniendo advantage del modo de doble mezcla del instrumento de flujo detenido, la enzima se hizo reaccionar primero con NADPH, hasta que se logró la reducción completa, entonces la enzima reducida-NADP + complejo se mezcló con el oxígeno. Siguiendo este procedimiento, es posible detectar transitorios intermedios flavina oxigenados y para medir las tasas de formación y descomposición. La identificación de estos productos intermedios proporciona datos experimentales sobre la naturaleza de las especies reaccionantes en catálisis. En el caso de A Sida f, la formación de la C4a-hydroperoxyflavin (normalmente controla a 370-380 nm), que es la especie hidroxilante. Además, la medición de la constante de velocidad de cada paso permite obtener información acerca de la etapa determinante de velocidad de la reacción y ayudar a aclarar los mecanismos cinéticos y químicas de la enzima. En general, los enfoques similares pueden ser utilizados para otros flavoenzymes, o proteínas para el cual la absorbancia cambios ocurridos, tales como proteínas que contain hemo, piridoxal-fosfato, o no hemo de hierro 8-10. Una limitación de este método es que grandes cantidades de enzima purificada se requiere, pero esto se puede superar mediante el uso de un sistema de expresión con altos rendimientos. Uno determina la concentración de proteína óptima para los espectros de grabación mediante el uso de proteína suficiente para que una señal lo suficientemente fuerte se puede observar, pero no demasiado para que la enzima no se desperdicia. Típicamente, la concentración más baja de enzima flavina contienen enzimas utilizadas en los experimentos de flujo detenido es 6-10 micras (después de la mezcla) y se determina utilizando el coeficiente de extinción molar correspondiente de la enzima. En el caso de A Sida f, el porcentaje de la FAD enzima unido es 50-65% 2. Apo-proteína es considerado como inactivo en estos experimentos debido a un cofactor FAD envolvente es necesario para la catálisis. Otra posible limitación de este método es si los procesos en una enzima ocurrir más rápido que 2 ms (tiempo muerto de la de flujo detenido) no se observará, pero ªantes que se presentan las estrategias que las tasas pueden reducirse a superar este problema. Un ejemplo de esto incluye el uso una concentración de NaCl de alta en la reacción de una ferredoxina-NADP + reductasa 11. El lavado de oxígeno desde el circuito de flujo del flujo detenido es a menudo un paso complicado en este experimento y requiere una atención especial. La glucosa oxidasa de glucosa sistema descrito aquí se utiliza con éxito en la mayoría de los laboratorios, ya que es un método eficaz y barato. Sin embargo, hay algunos inconvenientes que incluyen la producción de H 2 O 2 y para algunas aplicaciones otras alternativas como la protocatechuate dioxigenasa-protocatechuate sistema debe ser considerado 12. La utilización de una caja de guantes anaeróbica hace más fácil asegurar condiciones anaeróbicas, pero no es esencial. El oxígeno debe ser eliminado del circuito de flujo del flujo detenido como queremos que la enzima se reduce en la ausencia de oxígeno o reaccionar con el oxígeno a una concentracións que se especifique. Aunque el flujo detenido se encuentra en la guantera, no hay oxígeno en el circuito de flujo si se utiliza buffers de aeróbicos en los experimentos anteriores. Además de medidas de absorbancia, los ensayos de dicroísmo circular de fluorescencia y se puede realizar en el Applied Photophysics SX20 espectrofotómetro de flujo detenido con los accesorios correspondientes.

<table border="1"><tbody><tr><td> General de Equipos de Laboratorio </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Bomba de vacío </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner frascos </td><td> Pescador </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Revuelva bares </td><td> Pescador </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Revuelva las placas </td><td> Pescador </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk líneas </td><td> Kontes de vidrio </td><td> - </td></tr><tr><td> Argón tanque de </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Tanque de nitrógeno </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Tanque de nitrógeno, el grado de ultra alta pureza </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Tanque de oxígeno </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% de hidrógeno balance de nitrógeno del tanque </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> San SX20op-flow espectrofotómetro </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Guantera </td><td> Tímido </td><td> - </td></tr><tr><td> Baño de agua </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Suministros </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml BD Falcon tubos </td><td> Pescador </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ml BD Falcon cónica tubos </td><td> Pescador </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> Eppendorf de 1,5 ml tubos de microcentrífuga </td><td> Pescador </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 y 25 viales de vidrio mL </td><td> Pescador </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Tapones de goma </td><td> Pescador </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Sellos de aluminio </td><td> Pescador </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico </td><td> Pescador </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Fosfato de potasio dibásico </td><td> Pescador </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Acetato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> La glucosa oxidasa de A. Níger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glucosa </td><td> Pescador </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Pescador </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornitina clorhidrato </td><td> Pescador </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

el seguimiento de los reductores y oxidativo semirreacciones de una flavina monooxigenasa dependiente del uso de espectrofotometría de flujo detenido

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Aspergillus fumigatus sideróforo Un (SIDA) es una monooxigenasa que contiene FAD que cataliza la hidroxilación de ornitina en la biosíntesis de sideróforos hidroxamato que son esenciales para la virulencia (por ejemplo ferricrocin o N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. La reacción catalizada por SIDA se puede dividir en reductiva y oxidativa semirreacciones (Esquema 1). En el medio de reacción reductora, el FAD oxidado unido a un Asdi f, se reduce por NADPH 2,3. En el medio de reacción oxidativa , el cofactor reducido reacciona con el oxígeno molecular para formar un intermedio C4a-hydroperoxyflavin, que transfiere un átomo de oxígeno a ornitina. Aquí, se describe un procedimiento para medir las tasas y detectar las diferentes formas espectrales de Sida utilizando un instrumento de flujo detenido instalado en una caja de guantes anaeróbica. En el instrumento de flujo detenido, pequeños volúmenes de reactivos se mezclan rápidamente, y después el flujo se detiene mediante ªjeringa e tope (Figura 1), los cambios espectrales de la solución coloca en la celda de observación se registran en el tiempo. En la primera parte del experimento, se muestra cómo podemos usar el instrumento de flujo detenido en el modo individual, donde es directamente la reducción anaeróbica de la flavina en A f Sida por NADPH medida. A continuación, utilizamos dobles configuraciones de mezcla donde A Sida f es primero anaeróbicamente reducido por NADPH para un período de tiempo designado en un bucle de envejecimiento, y después se hace reaccionar con oxígeno molecular en la celda de observación (Figura 1). Con el fin de llevar a cabo este experimento, tampones anaeróbicas son necesarios porque cuando sólo la reductiva media-reacción se controla, cualquier oxígeno en las soluciones reaccionan con el cofactor flavina reducida y formar un intermedio C4a-hydroperoxyflavin que finalmente se desintegrará de nuevo en el oxidado flavina . Esto no permitiría al usuario para medir con precisión las tasas de reducción, ya que habría rotación completa de la enzima. Cuando el medio de reacción oxidativa se está estudiando la enzima debe ser reducida en ausencia de oxígeno de modo que sólo los pasos entre la reducción y oxidación se observan. Uno de los tampones utilizados en este experimento es oxígeno saturado de manera que se puede estudiar el medio de reacción oxidativa a altas concentraciones de oxígeno. Éstos son a menudo los procedimientos llevados a cabo en el estudio de cualquiera de los reductores u oxidativa semirreacciones con flavina contienen monooxigenasas. La escala de tiempo de los experimentos de pre-estado estacionario realizadas con el flujo detenido es milisegundos a segundos, que permiten la determinación de las constantes de velocidad intrínseca y la detección e identificación de productos intermedios en la reacción 4. Los procedimientos descritos aquí se puede aplicar a otros flavina-dependientes monooxigenasas 5,6.

Se describe la utilización de un instrumento de flujo detenido para investigar tanto los reductores y oxidativa semirreacciones de<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Un sideróforo (SIDA), una flavina monooxigenasa dependiente. A continuación, muestran los espectros correspondientes a las especies en la reacción de Sida y el cálculo de las constantes de velocidad de su formación.

El seguimiento de los reductores y oxidativo semirreacciones de una flavina monooxigenasa dependiente del uso de espectrofotometría de flujo detenido

La siderófora A (SidA) de Aspergillus fumigatus es una monooxigenasa que contiene FAD y que cataliza la hidroxilación de la ornitina en la biosíntesis de...

Este procedimiento utiliza un instrumento de flujo detenido para detectar las diferentes formas espectrales de SID A y medir las velocidades. La reacción catalizada por SID A puede dividirse en las semirreacciones reductora y oxidativa del FAD. La flavina oxidada se une al N-A-D-P-H y reacciona para formar flavina reducida y NADP más, y la reacción con oxígeno molecular y la unión de ornitina dan lugar a la formación de C cuatro.Una flavina hidroxilada tras la hidroxilación de ornitina, la flavina hidroxilada se deshidrata para formar la enzima oxidada. NA DP más permanece unido durante todo el ciclo catalítico y es el último sustrato en liberarse. El instrumento de flujo detenido facilita la mezcla rápida de pequeños volúmenes de reactivos y registra.Los cambios espectrales a lo largo del tiempo en un espectrofotómetro de flujo permiten medir la velocidad de formación y desaparición de intermediarios transitorios en una reacción catalizada por enzima. Dos miembros de mi laboratorio, Rita Robinson y Enviro Romero, demostrarán estos experimentos utilizando la flavina monooxigenasa como sistema modelo. Vierta 250 mililitros de tampón fosfato de potasio 100 milimolar en un matraz Büchner de 500 mililitros que contenga una barra de agitación.Cierre el matraz con un tapón de goma, colóquelo sobre una placa agitadora y conecte el tubo corto del matraz a una línea de vacío. Desgasifique el tampón bajo vacío durante una hora a temperatura ambiente con agitación, seguido de un lavado con argón. Repita cinco veces.Finalmente, enjuague el matraz con argón durante 10 segundos. Desconecte el matraz del sistema de vacío y colóquelo dentro de la caja de guantes. Continúe agitando vigorosamente con el matraz abierto.Llene las jeringas del depósito con soluciones de glucosa a 18,13 unidades por mililitro de glucosa oxidasa y 100 milimolares. Ahora coloque las válvulas de accionamiento en la posición de carga. Llene las jeringas de accionamiento.A continuación, gire la válvula F a la posición de accionamiento. Utilizando el software de control pro data, haga clic en vaciar la jeringa de parada y luego impulse el tampón desde la jeringa de accionamiento F a través del circuito de flujo elevando manualmente el émbolo de accionamiento correspondiente. Continúe con las otras tres jeringas de accionamiento y equilibre durante una hora.Ahora rellene las jeringas del depósito y repita el lavado del sistema con flujo detenido. Para preparar el tampón saturado con oxígeno, burbujee la solución con oxígeno al 100 % durante una hora con agitación.Luego retire la aguja corta del vial y espere 10 segundos. Proceda a retirar la aguja larga y coloque el vial cerrado en la caja de guantes. Para la solución de N-A-D-P-H.Coloque un tubo einor de 1,5 mililitros que contenga un miligramo de N-A-D-P-H dentro de la cabina de guantes. Disuelva en 300 microlitros de tampón fosfato de potasio anaeróbico 100 milimolar, pH 7,5.Retire 30 microlitros para determinar la concentración de N-A-D-P-H. Ahora, para eliminar el oxígeno del stock de enzima, transfiera la solución a un vial de 25 mililitros que contenga una barra de agitación, una tapa con junta y tapón, y un sello de aluminio. Coloque sobre hielo.Conéctese a una línea Schlenk, luego desgasifique al vacío durante 20 minutos, seguido de un purgado con argón. Finalmente, purgue el vial con argón durante 10 segundos y desconéctelo del sistema de vacío. Coloque el vial sobre hielo dentro de la caja de guantes.En la ventana del panel de control del software de control pro data, seleccione matriz de fotodiodos, disparo externo y escala logarítmica. Además, inicie el software pro data viewer y defina el directorio para el almacenamiento de los archivos de datos.Ahora reemplace la solución en las jeringas del depósito C y F con tampón anaeróbico de fosfato de potasio 100 milimolar, pH 7,5. Gire las válvulas C y F a la posición de accionamiento. Haga clic en vaciar la jeringa de parada en el software de control de datos pro.Luego, impulse el tampón desde ambas jeringas de accionamiento a través del circuito de flujo elevando manualmente el émbolo de accionamiento correspondiente. Repita el lavado con las jeringas de reserva C y F otras tres veces. Para asegurar la eliminación completa de la glucosa oxidasa del circuito de flujo, proceda a hacer clic en línea base en el software de control de datos pro.Sustituya la solución del jeringa del depósito F con la solución enzimática. Gire la válvula F a la posición de accionamiento. Haga clic en vaciar la jeringa de parada en el software de control de datos pro.Empuje la solución enzimática desde la jeringa motriz F a través del circuito de flujo elevando manualmente el émbolo impulsor correspondiente. Regrese al software de control de datos pro y configure el tiempo de adquisición en 60 segundos. Verifique que ambas jeringas motorizadas estén llenas con sus soluciones respectivas y que los émbolos impulsores estén en contacto con los pistones de las jeringas motrices.Gire ambas válvulas a la posición de impulso y haga clic en adquirir en el software de control de datos Pro para realizar el impulso. Adquiera datos espectrales de la forma oxidada de la enzima por triplicado utilizando el valor de 452 nanómetros obtenido de los impulsos. Determine la concentración de la enzima antes de mezclar y prepare cuatro mililitros de solución de N-A-D-P-H.Llene la jeringa del depósito C con una solución de N-A-D-P-H que sea 1,5 veces más concentrada y vacíe y vuelva a llenar la jeringa de parada tres veces, como se mostró anteriormente. Ahora, adquiera espectros durante la reducción de la enzima, lavando el contenido del circuito de flujo con tampón anaeróbico de fosfato de potasio 100 milimolar, pH 7,5. A continuación, haga clic en línea base en el software de control de datos Pro.Luego mezcle 200 microlitros de solución stock de enzima con 1000 microlitros de tampón anaeróbico de fosfato de potasio 100 milimolar, pH 7,5. Reemplace la solución del depósito de la jeringa A con la solución de enzima.Gire la válvula A a la posición de accionamiento en el software de control Pro Data. Haga clic en detener la jeringa vacía. Pase la solución enzimática desde la jeringa de accionamiento A a través del circuito de flujo elevando manualmente el émbolo de accionamiento correspondiente.Establezca el tiempo de retardo en 0,5 segundos y el tiempo de adquisición en 60 segundos. Verifique que todas las jeringas de accionamiento estén llenas con sus soluciones correspondientes y que los émbolos de accionamiento estén en contacto con los pistones de las jeringas de accionamiento. Luego, coloque todas las válvulas de accionamiento en la posición de accionamiento y haga clic en adquirir en el software de control de datos pro.Obtenga datos espectrales de la forma oxidada de la enzima por triplicado. A continuación, sustituya la solución de la jeringa del depósito B por una solución de N-A-D-P-H, 1,5 veces más concentrada que la solución de enzima en la jeringa A. Gire la válvula B a la posición de accionamiento y vacíe y rellene la jeringa de parada tres veces, como se mostró anteriormente en la ventana del panel de control.Establezca el tiempo de retardo en 0,5 segundos. Tras una adquisición de 20 segundos, reemplace la solución del jeringuilla depósito marina con el tampón oxigenado. Gire la válvula C a la posición de accionamiento.Lave tres veces en el software de control de datos. Establezca el tiempo de retardo en 15 segundos y el tiempo de adquisición en 900 segundos. Continúe adquiriendo espectros durante la reoxidación de la enzima completamente reducida en el instrumento de flujo detenido.La reducción anaeróbica de SID A con N-A-D-P-H puede monitorizarse midiendo los cambios en el estado redox del flavina utilizando absorbancia a 452 nm. Los cambios espectrales se registran a lo largo del tiempo desde el SID A oxidado hasta el último espectro del SID A completamente reducido. La velocidad de este paso enzimático puede determinarse ajustando los datos a la ecuación apropiada. La velocidad de oxidación y los intermediarios de la reacción también pueden determinarse utilizando el modo de mezcla doble del flujo detenido en esta reacción por AF Sid A. El intermediario hidroxiflavínico C cuatro A se detecta claramente con un λ máx de 380 nanómetros, mientras que la enzima oxidada presenta un λ máx de 450 nanómetros.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cuatro a seis horas si se realiza adecuadamente. Recuerde asegurarse de que las soluciones sean anaeróbicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar tanto la ionización relativa como la ulcerativa de FLA independiente mediante experimentos posteriores más avanzados, como la química rápida.Quentin puede ayudar a elucidar la triste naturaleza de los intermediarios.

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El seguimiento de los reductores y oxidativo semirreacciones de una flavina monooxigenasa dependiente del uso de espectrofotometría de flujo detenido

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