El seguimiento de los reductores y oxidativo semirreacciones de una flavina monooxigenasa dependiente del uso de espectrofotometría de flujo detenido
March 18th, 2012
Se describe la utilización de un instrumento de flujo detenido para investigar tanto los reductores y oxidativa semirreacciones de Aspergillus fumigatus Un sideróforo (SIDA), una flavina monooxigenasa dependiente. A continuación, muestran los espectros correspondientes a las especies en la reacción de Sida y el cálculo de las constantes de velocidad de su formación.
Este procedimiento utiliza un instrumento de flujo detenido para detectar las diferentes formas espectrales de SID A y medir las velocidades. La reacción catalizada por SID A se puede dividir en semirreacciones reductoras y oxidativas de FAD. La flavina oxidada se une al N-A-D-P-H y reacciona para formar flavina reducida y NADP, además de la reacción de oxígeno molecular y la unión de la ornitina da como resultado la formación de C cuatro.
Una hidroxiflavina después de la hidroxilación de la ornitina, la hidroxiflavina se deshidrata para formar la enzima oxidada. NA DP plus permanece unido durante todo el ciclo catalítico y es el último sustrato en ser liberado. El instrumento de flujo detenido facilita la mezcla rápida de pequeños volúmenes de reactivos y registros.
El espectrofotómetro de pérdida de material de cambios espectrales a lo largo del tiempo permite medir la tasa de formación y de una reacción catalizada por enzimas, específicamente de intermedios transitorios. Dos miembros de mi laboratorio, Rita Robinson y Enviro Romero, demostrarán estos experimentos utilizando el conjunto A en el sabor monooxigenasa como sistema modelo. Vierta 250 mililitros de tampón de fosfato de potasio de 100 milimolares en un matraz Buchner de 500 mililitros que contenga una barra agitadora.
Selle el matraz con un tapón de goma, luego colóquelo en una placa de agitación y conecte el tubo corto del matraz a una línea de flanco. Desgasificar el tampón al vacío durante una hora a temperatura ambiente con agitación, seguido de un lavado con argonne. Repite cinco veces.
Finalmente, enjuague el matraz con Argonne durante 10 segundos. Desconecte el matraz del colector de vacío y colóquelo dentro de la guantera. Continúe revolviendo vigorosamente con el matraz abierto.
Llene las jeringas del depósito con 18,13 unidades por mililitro de glucosa oxidasa y 100 milimolares de glucosa. Ahora coloque las válvulas de accionamiento en la posición de carga. Llene las jeringas de unidad.
A continuación, gire la válvula F a la posición de accionamiento. Con el software de control de datos profesional, haga clic en vaciar la jeringa de parada, luego empuje el búfer de la jeringa de unidad F a través del circuito de flujo elevando manualmente el ariete de la unidad correspondiente. Continúe con las otras tres jeringas de accionamiento durante una hora.
Ahora vuelva a llenar las jeringas del depósito y repita el lavado del sistema de flujo detenido. Para preparar tampón saturado de oxígeno. Burbujear la solución con oxígeno al 100% durante una hora con agitación.
A continuación, retire la aguja corta del vial y espere 10 segundos. Proceda a retirar la aguja larga y coloque el vial cerrado en la guantera. Para la solución N-A-D-P-H.
Coloque un tubo de einor de 1,5 mililitros que contenga un miligramo de N-A-D-P-H en la guantera. Disolver en 300 microlitros de tampón anaeróbico de fosfato de potasio de 100 milimolares. pH 7,5.
Retire 30 microlitros para determinar la concentración de N-A-D-P-H. Ahora, para eliminar el oxígeno de la reserva de enzimas, transfiera la solución a un vial de 25 mililitros que contenga una tapa de barra agitadora con un tapón y un tapón de trigo y un sello de aluminio. Colocar sobre hielo.
Conéctelo a una línea de schlink, luego desgasifique al vacío durante 20 minutos, seguido de un lavado con argonne. Finalmente, enjuague el vial con Argonne durante 10 segundos y desconéctelo del colector de vacío. Coloque el vial en hielo dentro de la guantera.
En la ventana del panel de control del software de control de datos profesional. Seleccione la matriz de fotodiodos, el disparador externo y la escala logarítmica. Inicie también el software de visualización de datos profesional y defina el directorio para el almacenamiento de archivos de datos.
Ahora reemplace la solución en las jeringas del depósito C y F con tampón anaeróbico de fosfato de potasio de 100 milimolares pH 7.5. Gire las válvulas C y F a la posición de accionamiento. Haga clic en vaciar la jeringa de parada en el software de control de datos profesional.
A continuación, empuje el tampón de ambas jeringas de accionamiento a través del circuito de flujo elevando manualmente el ariete de accionamiento correspondiente. Repita el lavado con las jeringas de depósito C y F tres veces más. Para garantizar la eliminación completa de la glucosa oxidasa del circuito de flujo, proceda a hacer clic en la línea de base en el software de control de datos profesional.
Reemplace la solución de la jeringa de depósito F con la solución enzimática. Gire la válvula F a la posición de accionamiento. Haga clic en vaciar la jeringa de parada en el software de control de datos profesional.
Empuje la solución enzimática desde la jeringa de accionamiento F a través del circuito de flujo elevando manualmente el ariete de accionamiento correspondiente. Regrese al software de control de datos profesional para establecer el tiempo de adquisición en 60 segundos. Verifique que ambas jeringas de accionamiento estén llenas con sus soluciones correspondientes y que los cilindros de accionamiento estén en contacto con la jeringa de accionamiento. Pistones.
Gire ambas válvulas a la posición de accionamiento y haga clic en adquirir en el software de control de datos profesional para realizar el accionamiento. Adquiera datos espectrales de la forma oxidada de la enzima por triplicado utilizando el valor A 4 52 nanómetros obtenido de las unidades. Determine la concentración de enzimas antes de mezclar y prepare cuatro mililitros de solución de N-A-D-P-H.
Llene 1,5 veces más concentrada la jeringa C del depósito con la solución N-A-D-P-H y vacíe y rellene la jeringa de parada tres veces como se muestra anteriormente. Ahora, adquiera espectros durante la reducción del contenido de lavado enzimático del circuito de flujo con tampón anaeróbico de fosfato de potasio de 100 milimolares pH 7.5. Ahora haga clic en la línea de base en el software de control de datos profesional.
A continuación, mezcle 200 microlitros de solución madre de enzimas con 1000 microlitros de tampón anaeróbico de fosfato de potasio de 100 milimolares. pH 7,5. Reemplace la solución de la jeringa reservorio A con la solución enzimática.
Gire la válvula A a la posición de accionamiento en el software de control de datos profesional. Haga clic en la jeringa de parada vacía. Empuje la solución enzimática desde la jeringa de accionamiento A a través del circuito de flujo elevando manualmente el ariete de accionamiento correspondiente.
Establezca el tiempo de retardo en 0,5 segundos y el tiempo de adquisición en 60 segundos. Verifique que todas las jeringas de accionamiento estén llenas con sus soluciones correspondientes y que los cilindros de accionamiento estén en contacto con los pistones de la jeringa de accionamiento. A continuación, gire todas las válvulas de accionamiento a la posición de accionamiento y haga clic en adquirir en el software de control de datos profesional.
Obtener datos espectrales de la forma oxidada de la enzima por triplicado. A continuación, sustituya la solución de la jeringa del depósito B por una solución N-A-D-P-H. 1,5 veces más concentrado que la solución enzimática en la jeringa A. Gire la válvula B a la posición de accionamiento y vacíe y vuelva a llenar la jeringa de parada tres veces como se muestra anteriormente en la ventana del panel de control.
Establezca el tiempo de retardo en 0,5 segundos. Una adquisición a los 20 segundos, reemplace la solución de la jeringa de mar del depósito con el tampón oxigenado. Gire la válvula C a la posición de accionamiento.
Enjuague tres veces en el software de control de datos profesional. Establezca el tiempo de retardo en 15 segundos y el tiempo de adquisición en 900 segundos. Continúe adquiriendo espectros durante la reoxidación de la enzima completamente reducida en el instrumento de flujo detenido.
La reducción anaeróbica de SID A con N-A-D-P-H se puede monitorear midiendo los cambios en el estado redox de la flavina usando absorbente a 452 aquí. Los cambios espectrales se registran a lo largo del tiempo desde el SID A oxidado hasta el último espectro del SID A completamente reducido. La velocidad de este paso enzimático se puede determinar ajustando los datos a la ecuación apropiada. La velocidad de oxidación y los intermedios de la reacción también se pueden determinar utilizando el modo de mezcla doble del flujo detenido en esta reacción por AF Sid A. El intermedio de flavina C four A Hydroxi se detecta claramente con un lambda máximo de tres 80 nanómetros y la enzima oxidada tiene un lambda máximo de 450 nanómetros.
Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro a seis horas si se realiza correctamente. Recuerde asegurarse de que las soluciones sean anaeróbicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar tanto el ion relativo como el ulcerativo de FLA mono independiente más adelante experimenta como un químico rápido.
Quentin puede ayudar a dilucidar la triste naturaleza de los intermedios.
Visión general
Este estudio utiliza un instrumento de flujo detenido para analizar las semirreacciones reductoras y oxidativas de la sideróforo A (SidA) de Aspergillus fumigatus, una monooxigenasa dependiente de flavina. La investigación incluye el análisis espectral de los intermediarios de la reacción y el cálculo de las constantes de velocidad para su formación.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Enzimología
- Espectroscopía
Antecedentes
- Aspergillus fumigatus es un patógeno fúngico importante.
- La sideróforo A (SidA) juega un papel crucial en la adquisición de hierro.
- Las monooxigenasas dependientes de flavina son importantes para varias reacciones bioquímicas.
- Comprender los mecanismos de reacción puede ayudar a desarrollar estrategias antifúngicas.
Propósito del estudio
- Investigar los mecanismos de reacción de SidA.
- Medir las constantes de velocidad de los intermediarios de la reacción.
- Proporcionar información sobre el ciclo catalítico de las enzimas dependientes de flavina.
Métodos utilizados
- Espectroscopía de flujo detenido para mezcla rápida y análisis espectral.
- Preparación de condiciones anaeróbicas para las reacciones enzimáticas.
- Medición de cambios espectrales a lo largo del tiempo para determinar la cinética de la reacción.
- Uso de tampones y reactivos específicos para facilitar las reacciones.
Resultados principales
- Identificación de diferentes formas espectrales de SidA durante las reacciones.
- Cálculo de las constantes de velocidad para la formación de intermediarios de la reacción.
- Demostración del ciclo catalítico que involucra NADP y oxígeno.
- Caracterización de intermediarios transitorios en la vía de reacción.
Conclusiones
- La técnica de flujo detenido es efectiva para estudiar la cinética enzimática.
- Las ideas obtenidas pueden informar futuras investigaciones sobre enzimas dependientes de flavina.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión del metabolismo fúngico.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Stopped-flow spectrophotometry enables precise kinetic dissection of flavin-dependent monooxygenase reactions, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. By resolving reductive and oxidative half-reactions and quantifying transient intermediates, this approach enhances predictive confidence for enzyme-targeted portfolios. The method's adaptability to other flavin-dependent systems positions it as a reusable capability for biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of intrinsic rate constants for mechanistic hypothesis testing.
- Supports identification and characterization of catalytic intermediates for functional target validation.
- Facilitates biological de-risking by clarifying enzyme reaction pathways.
- Improves predictive confidence for advancing enzyme targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated spectral readouts for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative tracking of enzyme redox states for reliable compound evaluation.
- Supports preparation of robust biological systems for downstream screening workflows.
- Allows platform reuse across flavin-dependent monooxygenase targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic insights with disease-relevant enzyme systems when applicable.
- Ensures continuity from discovery-stage kinetic validation to preclinical model selection.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying catalytic mechanisms.
- Supports translational biomarker development through quantitative intermediate detection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing mechanistic clarity before preclinical advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving reductive and oxidative half-reactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spectral outputs for assay readiness.
- Analytics: Enables measurement of rate constants and detection of transient intermediates for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical model selection when enzyme targets are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to other flavin-dependent monooxygenases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enzyme target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and kinetic data analysis.
- Needs access to stopped-flow spectrophotometry and anaerobic handling infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer preparation and instrument calibration.
- Adaptable to various flavin-dependent monooxygenase systems with appropriate optimization.
- Dependent on maintaining strict anaerobic conditions for accurate half-reaction measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Anaerobic Buffer
2:24
Removing Oxygen from the Stopped-flow System
3:22
Key Solutions
4:45
Reductive Half-reaction: Monitoring Flavin Reduction
7:31
Oxidative Half-reaction: Monitoring Flavin Oxidation
10:10
Stopped Flow: Spectral Forms of Af SidA
11:27
Conclusion
