La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

El objetivo general de este procedimiento es generar células IPS humanas a través de la sobreexpresión mediada por retrovirus de OCT four, SOX 2K, LF four y M con un sistema reportero GFP. Esto se logra agregando primero la cantidad adecuada de retrovirus que expresa GFP individual. A continuación, las células infectadas por el virus que expresan GFP se transfieren a placas recubiertas de gelatina al 0,1% con fibroblastos embrionarios de ratón.

El tercer paso del procedimiento es reemplazar el medio con un medio de cultivo de células madre embrionarias humanas. Finalmente, se aíslan colonias de IPS silenciadas con GFP que muestran una morfología similar a las células madre embrionarias humanas. En definitiva, los resultados muestran la expresión de marcadores pluripotentes endógenos mediante tinción inmunofluorescente y R-T-Q-P-C-R.

La principal ventaja de esta técnica de método existente como la tinción de estilo de vida con marcador de superficie pluripotente y la observación de un cambio morfológico es el deseable iPad. Las colonias celulares se pueden aislar fácilmente utilizando la pérdida de expresión de GFP como marcador de las células pluripotentes para comenzar el cultivo. Fibroblastos humanos en medio de fibroblastos un día antes de la placa de infección una vez 10 al quinto fibroblastos humanos en un pocillo de una placa de seis pocillos al día siguiente aspire el medio para eliminar las células muertas y agregue dos mililitros de medio de fibroblastos fresco con cinco microgramos por mililitro de sulfato de protamina.

A continuación, añada cuidadosamente la cantidad adecuada de cada virus que expresa GFP correspondiente a una multiplicidad de infección de cinco. Incubar las células a 37 grados centígrados durante la noche un día después de la infección. Retire el sobrenadante viral lavar tres veces con dos mililitros de PBS.

A continuación, agregue dos mililitros, medio fibroblasto tres días después de la infección. Compruebe la fluorescencia GFP y reponga el pocillo con dos mililitros. Al día siguiente, coloque un plato de 10 a 10 por centímetro cuadrado de células alimentadoras de ratón, fibroblasto embrionario o metanfetamina irradiadas en medio de fibroblastos en una placa de Petri de 10 centímetros recubierta con gelatina al 0,1%.

Incuba las células a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, separar los fibroblastos humanos infectados con un mililitro de 0,05% de EDTA durante cinco minutos a 37 grados centígrados y centrifugar durante cinco minutos a 200 G. Vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio de fibroblastos y vuelva a reproducir las células en gelatina prerrecubierta al 0,1% con mfs. 24 horas después.

Reemplace el medio con un medio de cultivo HESC y cambie el medio diariamente. Las colonias similares a las ESC comenzarán a aparecer de 20 a 27 días después de la infección después de la aparición de colonias similares a las ESC bajo un microscopio de fluorescencia. Comprobar la ausencia de fluorescencia de GFP en una colonia que muestre una morfología similar a las HSC.

Con una pipeta de 10 microlitros. Elija colonias individuales de IPSC y colóquelas en un pocillo de una placa de 12 pocillos recubierta de gelatina y metanfetamina y complementada con medio HESC. Cambie el medio de paso diario de las celdas lavando la placa con un mililitro de DMM F 12.

A continuación, añadir 0,5 mililitros de colagenasa e incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Lave las celdas dos veces con DM A MF 12. A continuación, añade dos mililitros de medio HESC fresco.

Luego, use un elevador de células para dividir las colonias en pedazos pequeños y separar las celdas restantes de la placa. Transfiera los trozos resuspendidos de las colonias a un pocillo de gelatina y seis recubiertos de MEF. Coloque en un pozo e incube a 37 grados centígrados durante dos días.

Controlar las células por inmunofluorescencia. Lávelos tres veces con PBS y fíjelos con 4% de paraldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave suavemente las células tres veces con PBS y séjelas con 0,2%tritton X 100 en PBS durante 30 minutos.

Bloquee la unión inespecífica incubando las células con 3%BSA en PBS durante dos horas. A continuación, incube las células con el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar las células tres veces con PBS e incubarlas con un anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.

Lave las celdas tres veces con PBS durante el último lavado. Agregue el dappy e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Obtenga imágenes de las células utilizando un microscopio fluorescente para obtener imágenes cuantitativas en tiempo real.

La PCR aísla el ARN total de los IPC humanos derivados de fibroblastos humanos. Usando un kit de aislamiento de ARN. Sintetizar el ADNc de la primera cadena utilizando transcriptasa inversa.

A continuación, utilícelo como plantilla para la QPCR para detectar genes de pluripotencia. Los fibroblastos humanos, BJ uno que fueron infectados con un cóctel de retrovirus portadores de OCT cuatro, SOX dos, KLF cuatro y Mick muestran aquí los cambios morfológicos observados durante la reprogramación desde el día cinco. Hoy en día, 10, 14 y 21, las células comienzan a mostrar una morfología similar a la HESC después de 21 días, y las IPC se reconocen por fluorescencia GFP.

Las células madre pluripotentes, como las ESC y las IPC, expresan la maquinaria molecular para reprimir la expresión génica proviral. Sin embargo, los vectores retrovirales utilizados aquí expresan GFP junto con genes de reprogramación por LTR retroviral. Por lo tanto, se considera que las células que expresan GFP continuamente expresan transgenes sin silenciamiento de genes provirales, como se ve aquí fielmente, las colonias de IPSC reprogramadas que adquieren la Red Molecular de Pluripotencia muestran la ausencia de expresión de GFP.

Esta figura muestra el análisis inmunohistoquímico de colonias derivadas de Detroit 5, 51 fibroblastos con anticuerpos contra TRA 180, 1, TRA uno, 60, SSEA, cuatro, T, cuatro y nano, como se puede ver con éxito. Los IPC reprogramados expresan todos estos marcadores. Además, se llevó a cabo un estudio cuantitativo R-T-P-C-R para analizar la expresión génica y reveló que T four SOX two, KLF four M y nano estaban significativamente incrementados en comparación con las células de fibroblastos parentales, pero proporcionales a las de H nine HSCs.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo infectar el virus, identificar y recoger las células IPA completamente programadas con labios mediante microscopía fluorescente.