Name: Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Aprende un método de cribado fenotípico para aislar mutantes de Toxoplasma gondii con defectos en el egreso sensibles a la temperatura. Esta técnica permite identificar genes involucrados en la salida del parásito de las células huésped.

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Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana del Corazón de Desarrollo Científico Grant 0635480N y los Institutos Nacionales de Salud de becas de investigación AI081220. BIC es apoyado por una Caballeros Templarios Eye Foundation beca de investigación.

Información general Protocolos se proporcionan para definir primero la dosificación de la mutágeno que conduce a una matanza 70% de los parásitos (protocolo 1). El siguiente procedimiento se ofrece para enriquecer los mutantes inducidos por el egreso de un grupo mutagenizado parásito (el protocolo 2, Figura 2). Esto es seguido por un protocolo para probar la incidencia de los mutantes de egreso en la piscina enriquecido, o para validar el fenotipo de salida en los mutantes individuales (protocolo 3). Finalmente, un protocolo se proporciona para generar clones individuales de parásitos de poblaciones enriquecidas por dilución limitante (protocolo 4). 1. La titulación de mutágeno Tenga cuidado especial, como guantes dobles, cuando se trabaja con compuestos altamente mutagénicos y líquidos. Recoger los desechos líquidos por separado para su correcta eliminación. <ol><li> Inocular T25 frascos de cultivo de tejidos confluentes con fibroblastos de prepucio humano (HFF), las células con 1 ml de taquizoitos lisadas y crecer 18-25 horas a 37 °; C bajo 5% de CO 2 en Ed1 medio (D-MEM suplementado con inactivado por calor 1% de suero fetal bovino, 0,2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, estreptomicina 50 mg / ml, y 0,25 g / ml de anfotericina B ). Véase Roos et al. para el crecimiento general y los medios de comunicación de las células HFF y parásitos 21. </li><li> Reemplazar con 10 ml de medio de 0,1% de suero bovino fetal medio (diluido 1:10 Ed1 en D-MEM) y dejar en humidificado incubadora a 37 ° C por debajo del 5% de CO 2 (denominado &quot;37 ° C incubadora&quot; de aquí en adelante) durante 10 minutos . </li><li> Añadir 0, 12,5, 25, 50, 100 o ENU l (1 archivo M en DMSO) o SEM (1 archivo M en DMSO) por frasco (diluciones mutágeno de trabajo será 1,25, 2,5, 5, y 10 mM, respectivamente). Añadir DMSO a 100 l por cada matraz. Incubar durante 4 horas en una incubadora a 37 ° C. </li><li> Lavar tres veces durante 10 segundos a temperatura ambiente mediante enjuague la monocapa con 10 ml de PBS frío (pre-enfriado a 4 ° C). </li><li> Añadir 5 ml de PBS, raspe la monocapa de suelta con una espátula de caucho (células scraper), pasar las células tomadas por raspado a través de una aguja de 26,5 g para eliminar físicamente al parásito de los fibroblastos (clip del eje fuera de la aguja con unas tijeras de trabajo pesado para no exponer a la aguja), y el filtro de 3,0 micras filtro de policarbonato. Pasajes múltiples agujas aumentará la eficacia de la liberación de los parásitos de la célula huésped. </li><li> Contar el parásito concentración utilizando un hemocitómetro. Deje que los parásitos se conforme con 5 minutos en el hemocytomer antes del conteo. </li><li> Diluir los parásitos a 10.000 parásitos por 3 ml de ED1 (de 10 ml 33.333 parásitos son necesarios). </li><li> Se inoculan un pocillo en una placa de 6 pocillos con 3 ml de los parásitos diluidas (que contiene 10.000 parásitos). Serie diluir los parásitos de 10 veces más de 3 pozos en un confluente placa de 6 pocillos con células HFF que contienen 2,7 ml Ed1 mediante la transferencia de 300 l del primer pozo. Deja placas vírgenes en la incubadora a 37 ° C durante 7 días. </li><li> Aspirar medio, fijar 15 minutos con 3 ml / pocillo etanol 100%, manchacon 3 ml / pocillo solución violeta cristal (12,5 g de cristal violeta en 125 ml de etanol se mezcla con 500 ml de oxalato amónico al 1%) durante 15 minutos, enjuague con 3 ml / pocillo de PBS (1 minuto) y aire seco. Todo a temperatura ambiente. </li><li> Contar placas y seleccionar concentración del mutágeno necesaria para lograr una supervivencia de 30% de los parásitos expuestos (70% de destrucción de dosificación: véase la Figura 1). Una dosis de 70% de muerte se ha utilizado históricamente 14 e indujo a menos de 100 mutaciones puntuales por genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrito presentado). </li></ol> 2. Enriquecimiento de mutantes salida (Figura 2) <ol><li> Realizar mutagénesis como se ha descrito anteriormente, utilizando una dosis mutágeno inducir 70% matanza. Crece la población mutado por un pasaje en un nuevo frasco de las células huésped. </li><li> Infectar a un T25, HFF confluentes frasco de cultivo de tejidos con 120.000 recién parásitos lisados ​​de una población mutado en 10 ml Ed1. Incubar durante 2 horas en una incubadora 35 ° C bajo 5% de CO2 y húmeda (en adelante denominado &quot;incubadora de 35 ° C&quot;). </li><li> Aspirar medio y enjuague de 10 segundos con 10 ml de PBS frío y luego añadir 10 ml Ed1 medio suplementado con 25 mg / ml de sulfato de dextrano (DS) 13. Incubar durante 26 horas en una incubadora de 40 ° C por debajo del 5% de CO 2 y humidificado (en adelante denominado &quot;incubadora de 40 ° C&quot;). </li><li> Prepare la solución de trabajo de los potenciadores de salida. Diluir el inductor de salida de elección en la concentración de trabajo en un tubo Falcon de 15 ml que contenía 10 ml HBSSc suplementado con 25 mg / ml de DS. Pre-caliente las diluciones de 30 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Ver Tabla 1 para las concentraciones de trabajo. </li><li> Aspirar medio de los matraces infectados por el parásito y añadir pre-calentado solución inductor de salida. Incubar en la incubadora a 37 ° C durante los tiempos indicados en la Tabla 1. </li><li> Aspirar medio y enjuague de 10 segundos con 10 ml de PBS frío y luego añadir 10 ml Ed1 suplementado con 25 mg / ml y DS 50 mM pirrolidina ditiocarbamato (PDTC: anunciod 5 l de 100 mM de archivo PDTC en PBS) 13. Incubar 5 horas en una incubadora 35 ° C. </li><li> Aspirar a medio y enjuague de 10 segundos una vez con 10 ml de PBS (temperatura ambiente) y, a continuación añadir 10 ml Ed1 medio. Ponga frascos de nuevo en la incubadora de 35 ° C hasta que los parásitos destruyen la monocapa: matraces de agitación diaria. Esta recuperación toma alrededor de 7 días. </li></ol> 3. La validación de fenotipos mutantes mediante ensayos de egreso Después de realizar la pantalla de enriquecimiento y crecimiento de la población enriquecida por un pasaje en células HFF, los fenotipos necesitan ser confirmados por un ensayo de salida 11,13. Este ensayo también se debe utilizar para validar los clones individuales después del Protocolo n º 4. <ol><li> Inocular 20.000 parásitos por pozo en una placa de 24 pocillos que contenía células confluentes cultivadas en cubreobjetos HFF (1 ml Ed1 medio por pocillo). Incubar 8 horas en una incubadora 35 ° C y después transferir en una incubadora 40 ° C durante 24 hrs. </li><li> Lavar con 1 ml / pocillo de PBS (10 segundos a temperatura ambiente). Añadir 1 ml inductores de egreso (incluye un solo DMSO control negativo), pre-calentado y se diluye en HBSSc e incubar durante los tiempos que se describen en la Tabla 1. </li><li> Aspirar medio y fijar con 1 ml / pocillo de metanol al 100% durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Si los parásitos de padres que expresan una proteína autofluorescente fueron utilizados para la mutagénesis, vaya al paso # 3.5 13. Si no fluorescentes parásitos que expresan la proteína se utiliza como línea principal, mancha los cubreobjetos fijos con Diff-Quick teñir durante 1 minuto a temperatura ambiente 11. </li><li> Lavar 5 minutos con 1 ml / pocillo de PBS en la placa de 24 pocillos a temperatura ambiente. </li><li> Para los parásitos que expresan proteínas fluorescentes: enjuagar rápidamente el cubreobjetos en ddH2O (inmersión) y montar en las diapositivas en gelmount para proteger la señal de fluorescencia. Para Diff-Quick parásitos manchadas, lavar 10 segundos en el 100% de etanol y dejar secar al aire antes de montar en la diapositiva. </li><li> Utilizando un microscopio (fluorescencia) con un40-60x objetivo contar el porcentaje de vacuolas egresados ​​frente a las vacuolas que permanecían intracelular (ver Figura 4). </li></ol> 4. Clonar mutantes de egreso por dilución límite Después de la validación del fenotipo de la población enriquecida de salida mutante utilizando el protocolo de 3, la población policlonal tiene que ser clonados para obtener clones individuales de parásitos. <ol><li> Contar población de parásitos en un hemocitómetro y se diluye hasta una concentración de 500 parásitos por ml en medio Ed1. </li><li> En una placa de 384-bien que contiene una monocapa confluente de células HFF, reemplazar el medio con 40 l / pocillo de Ed1 medio utilizando una pipeta de canales múltiples. Como se muestra en la Figura 5, cuatro poblaciones policlonales pueden ser clonados por placa como sigue: pipeta 40 l / pocillo de diluida mutante 1 en pocillos de C3-C12, mutante 2 en pocillos C13-C22, mutante 3 en los pocillos H3-H12, y mutante 4 en los pozos H13-H22 (volumen final en los pozos es ahora 80 l). El uso de un multi-canal de la pipeta, la pipeta del sollución arriba y hacia abajo 5 veces, a continuación, transferir 40 l de la fila debajo de la fila de partida (de la fila C a D o H fila I). Continuar estas diluciones en serie 2-plegado a través de la fila G (mutantes 1 y 2) o fila N (mutantes 3 y 4). Deseche el extra de 40 l de la última fila. Incubar en una incubadora 35 ° C durante 7-10 días sin perturbar la placa. </li><li> Ver los pocillos en un microscopio invertido con un objetivo 10-20x para la presencia de placas individuales, visible como &#39;agujeros&#39; en la monocapa. </li><li> Pick 4 pocillos por mutante con una sola placa y transferir los parásitos en un frasco de cultivo confluente tejido con células HFF y lleno de Ed1 medio. Crecer los parásitos en una incubadora de 35 ° C y agitar los frascos diarios para dispersar a los parásitos extracelulares. Esto suele tardar 7 días. </li></ol> 5. Los resultados representativos El ENU mutágenos y EMS no son estables cuando se almacenan durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, poniendo a prueba el poder mutagénico delas poblaciones es fundamental para obtener resultados reproducibles. Los resultados típicos de valoración y matar las curvas tanto para ENU y EMS se muestra en la Figura 1. Sin embargo, se recomienda llevar a cabo ensayos de placa para cada experimento de mutagénesis para determinar la dosificación apropiada que se utilizó. Para mantener la diversidad en la población de parásitos mutagenizado, es importante para proceder con la pantalla mutante salida lo más rápidamente posible. Por lo general, un pasaje de los parásitos en un nuevo frasco se lleva a cabo para permitir que los parásitos supervivientes se recuperen antes de seguir adelante con la pantalla. Se debe tener en cuenta que haciendo esto dará como resultado la división de los mutantes. Por lo tanto, no puede excluirse que varios mutantes aislados clonales después de completar el procedimiento en su conjunto contienen exactamente el mismo genotipo. Para evitar el aislamiento de los mismos tiempos de mutantes múltiples, se recomienda aislar sólo un mutante de salida única por mutagénesis, a menos que sus fenotipos (por ejemplo, la sensibilidad diferencial inductor de salida) sonmuy diferentes entre sí. Por otro lado, no todos los resultados de la pantalla en el aislamiento de mutantes con el fenotipo deseado. En particular, el Ca 2 +-ionóforo A23187 fenotipo de resistencia es poco frecuente y requiere de múltiples experimentos de mutagénesis y pantallas para aislar un mutante de salida única. Por lo tanto, se recomienda realizar mutagénesis 10.05 y los experimentos de la pantalla en paralelo. El poder de enriquecimiento de la pantalla se ensayó mediante la mezcla de un mutante de salida conocido con parásitos de tipo salvaje en diferentes proporciones. Estas mezclas se sometieron a la pantalla y la incidencia del fenotipo mutante en la población enriquecida se evaluó. Mediante el uso de tipo salvaje parásitos que expresan RFP citoplasmática y una línea mutante que expresa YFP citoplasmática las incidencias rápidamente se pudo establecer mediante citometría de flujo (Figura 3) 13. Los resultados muestran que los fenotipos mutantes puede ser rutinariamente enriquecido al 80% de pureza, comenzando con parásito salida 1 mutante por 10.000 de tipo salvaje parasites 13. Sin embargo, cuando la salida mutante: tipo salvaje relación de arranque parásito es 1:100.000 parásitos, la población aislada es sólo el 1-2% (1:100) mutantes de salida. Por lo tanto el poder de enriquecimiento de la pantalla es 1.000 veces. Puesto que la pantalla se inicia con la inoculación de 120.000 parásitos, de los cuales típicamente 70% son viables, se suelen realizar dos rondas de enriquecimiento. Los parásitos aislados han crecido entre las dos rondas de enriquecimiento. Este procedimiento da lugar a una población de 100% mutante, incluso cuando a partir de 1:1.000.000 de egreso: mutantes de tipo salvaje parásitos. El ensayo de salida para validar y caracterizar los fenotipos requiere una multiplicidad de infección de la célula huésped que permite la diferenciación de vacuolas individuales. Esto es especialmente importante cuando se analizan las condiciones con altos porcentajes de egreso ya que los parásitos individuales están esparcidos alrededor. Como se muestra en la Figura 4, si las poblaciones egresados ​​no están bien separadas es fácil subestimar el porcentajede salida contando dos vacuolas egresados ​​como una vacuola. Desde salida y la invasión son procesos relacionados, y algunos fenotipos sensibles a la temperatura mostrar un fenotipo leve a la temperatura más baja, no todos los mutantes tienen eficiencias similares invasión. Estos mutantes por lo tanto, deben ser inoculados en varias veces mayores dosis para obtener una alta densidad vacuola suficiente para una evaluación precisa de su fenotipo de salida. Por otra parte, algunos inductores de egreso no son eficientes estimular la salida de los cuatro parásitos que contienen vacuolas o menos. Como tal, es importante que las vacuolas contienen ocho parásitos o más cuando se inicia el ensayo de salida. En nuestro laboratorio hemos aislado mutantes de la pantalla con un intensificador particular en contra de salida potenciadores de egreso otros. Al presentar su reactividad cruzada de los mutantes se pueden agrupar en diferentes categorías. Por último, no todos los mutantes de egreso será sensible a la temperatura. En particular, los mutantes aislados con inductores de egreso de disparo pasos antes de la liberación de intracellular Ca 2 + son propensos a no fenotipos sensibles de temperatura. Esto es debido a los caminos paralelos que pueden conducir a la salida antes de la señal converge sobre la liberación de Ca 2 + intracelular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Figura 1. Químico mutágeno titulación de dosificación. Ensayos de A. La placa realizada en una placa de 6 pocillos utilizando diferentes concentraciones de EMS y números diferentes de parásitos por pozo, como se indica. Las manchas blancas son parásitos placas formadas en la monocapa HFF. B, C. curvas de supervivencia de los parásitos a la exposición a diversas dosis de EMS (B) y ENU (C). La supervivencia fue evaluada por ensayos de placa. Una dosis inducir 70% matanza se elige para experimentos de mutagénesis. Los promedios de tres experimentos independientes + / - desviación estándar se muestran. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Representación esquemática de la pantalla de enriquecimiento mutante salida. La temperatura se indica en el eje, mientras que la progresión de tiempo está representado por el eje x. Parásitos verdes reflejan egreso parásitos mutantes, parásitos rojos reflejan los parásitos de tipo salvaje. El momento de cambios en las condiciones y la estimulación de inductor de salida se indican en la parte superior y están marcados por las flechas en la línea azul que refleja el perfil de temperatura. Adoptado de Eidell et al. 13. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Figura 3. Típico de enriquecimiento de egreso fenotipos mutantes. Resultados de enriquecimiento de un mutante de salida mezclada en los de tipo salvaje parásitos en diferentes proporciones (eje X). El porcentaje de egreso fenotipos mutantes en la población creció después de la pantalla se dibuja en el eje y, y se evaluó por citometría de flujo (de egreso parásitos mutantes expresó YFP citoplasmática, de tipo salvaje parásitos expresó cytoplasmic RFP). Los resultados de tres experimentos independientes están representados por puntos de datos de color rojo, azul y verde. Adoptado de Eidell et al. 13. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Figura 4. Los resultados típicos de un ensayo de salida. A Flechas. Marcar cuatro diferentes vacuolas que contienen parásitos intactos 4-8. B. Las flechas señalan cuatro grupos de parásitos aislados que reflejan cuatro vacuolas egresados ​​independientes. Egreso fue inducida por A23187 (B) o DMSO como un control negativo (A). Los parásitos expresar citoplasmática YFP 22. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Figura 5. Diluciones seriadas de las líneas clonales de parásitos. Cuatro poblaciones policlonales (rojo, azul, amarillo, verde) se diluyen en serie en una sola placa confluente de 384 pocillos con células HFF. Fila C y recibo 10 parásitos por pozo yson 2-veces diluido (40 l + 40 l) hasta que las filas H y N, respectivamente. El tono de gris indica la disminución del número de parásitos por pozo. Típicamente, los clones individuales se encuentran en filas DF y JL. <table border="1"><tbody><tr><td> Compuesto </td><td> Valores </td><td> Concentración de Trabajo </td><td> l necesaria para T25 (10 ml) </td><td> Tiempo de incubación (min) </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 1 M en DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> 190 Prueba </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM en DMSO </td><td> 1 mM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericina * </td><td> 2 mM en DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericina no puede ser utilizado en el enriquecimientopantalla de ambiente como los parásitos no sobreviven a la estimulación nigericina, usar solamente nigericina en la validación de los mutantes de salida. Tabla 1. Egress inductores utilizados en los procedimientos. Diluir en 10 ml HBBSc contiene 25 mg / ml para la pantalla de DS o DS no para la validación de mutante (prueba de salida). Todos los compuestos de Sigma-Aldrich.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

<html> El protocolo descrito proporciona un método eficiente para aislar mutantes Toxoplasma con un defecto de salida. Hemos aislado con éxito mutantes a lo largo de diversas etapas de la vía de salida, algunos de los cuales tienen un fenotipo invasión de doble 13. Los efectos potenciales sobre la invasión se puede determinar utilizando el llamado ensayo de rojo-verde, que distingue invadido de no invadido por parásitos tinción diferencial anticuerpo 23,24. Para ambos ensayos de invasión y ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 M en DMSO, almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 M en DMSO, almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> El sulfato de dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 mM de archivo en PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> Merck Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> El soporte del filtro </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 micras filtro de policarbonato </td><td> WhatmanSchleicher y Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadoras de CO 2 </td><td> Varios fabricantes </td><td></td><td> CO humidificado, 5% 2, en 35, 37 y 40 ° C </td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Varios fabricantes </td><td></td><td> Lo ideal sería invertido, de gran campo con el objetivo de aceite de 63x o 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (de acuerdo con Negro et al 11.): <ul><li> 98,0 ml de solución salina equilibrada de Hanks (número de catálogo SH30588 Hyclone) </li><li> 100 l de MgCl 1M 2 (100 mM final) </li><li> 100 l de CaCl 1M 2 (100 mM final) </li><li> 2,0 ml de Hepes 1 M pH 7,3 (20 mM final) </li><li> 84 mg de NaHCO 3 (10 mM final) </li></ul>

una pantalla genética para aislar toxoplasma gondii célula huésped-mutantes egress

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

La generalizada, intracelular obligado, protozoo parásito Toxoplasma gondii causa la enfermedad oportunista en pacientes inmunocomprometidos y causa defectos de nacimiento después de la infección congénita. El ciclo de replicación lítica se caracteriza por tres etapas: 1. invasión activa de una célula huésped nucleada; 2. replicación dentro de la célula huésped; 3. salida activa de la célula huésped. El mecanismo de salida está cada vez más apreciado como un proceso único, altamente regulado, lo que aún es poco conocido a nivel molecular. Las vías de señalización que subyacen salida se han caracterizado mediante el uso de agentes farmacológicos que actúan sobre los diferentes aspectos de las vías de 1-5. En este sentido, varios disparadores independientes de egreso se han identificado que todos convergen en la liberación de Ca 2 + intracelular, una señal de que también es crítico para la invasión de la célula huésped 6-8. Esta visión informó a un enfoque de genes candidatos que llevó a la identificacióncación de la planta como el calcio de la proteína quinasa dependiente (CDPK) que participan en salida 9. Además, varios avances recientes en la comprensión de salida se han realizado utilizando (química) los enfoques genéticos 10-12. Para combinar la riqueza de la información farmacológica con el aumento de la accesibilidad genética de Toxoplasma hemos establecido una pantalla que permite el enriquecimiento de los parásitos mutantes con un defecto en la salida de la célula huésped 13. Aunque mutagénesis química utilizando N-etil-N-nitrosourea (ENU) o metanosulfonato de etilo (EMS) se ha utilizado durante décadas en el estudio de la biología Toxoplasma 11,14,15, sólo recientemente se ha mapeo genético de las mutaciones que subyacen a los fenotipos convertido en una rutina 16 -18. Por otra parte, mediante la generación de mutantes sensibles a la temperatura, los procesos esenciales pueden ser analizados y los genes subyacentes identificados directamente. Estos mutantes se comportan como de tipo salvaje en la temperatura permisiva (35 º C), pero no proliferate a la temperatura restrictiva (40 ° C) como un resultado de la mutación en cuestión. Aquí se ilustra un nuevo método de cribado fenotípico para aislar mutantes con un fenotipo sensible a la temperatura de salida 13. El reto para las pantallas de egreso es separar egresados ​​de la no-egresados ​​parásitos, lo cual es complicado por la rápida re-invasión y la rigidez general de los parásitos de las células anfitrionas. Una pantalla de salida previamente establecida se basa en una serie de pasos engorrosos biotinilación para separar intracelular de parásitos extracelulares 11. Este método también no generar mutantes condicionales resultan en fenotipos débiles. El método descrito aquí supera la fuerte adhesión de egressing parásitos mediante la inclusión de un competidor glicano, sulfato de dextrano (DS), que impide que los parásitos se pegue a la célula huésped 19. Por otra parte, los parásitos extracelulares son específicamente exterminados por pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), lo que deja los parásitos intracelularessanos y salvos 20. Por lo tanto, con una nueva pantalla fenotípica para aislar específicamente mutantes con defectos en el parásito de salida inducida por el poder de la genética ahora se puede estar totalmente desplegado para desentrañar los mecanismos moleculares subyacentes de salida de la célula huésped.

Adelante la genética es un poderoso método para desentrañar el nivel molecular de cómo<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egresados ​​de su célula huésped. Protocolos se proporcionan para mutagenizar químicamente parásitos, enriquecer a los mutantes con defectos en la salida inducida, y validar el fenotipo de los mutantes clonados.

Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress

El parásito protozoario intracelular obligado y ampliamente distribuido Toxoplasma gondii provoca enfermedades oportunistas en pacientes inmunocomprometidos y causa defectos congénitos...

Este video ilustra un nuevo método de cribado fenotípico para aislar mutantes con un fenotipo sensible a la temperatura en la salida del parásito. Se aplican un mutágeno y parásitos a cultivos de fibroblastos humanos de prepucio infectados con toxoplasma. Durante dos horas, se eliminan los parásitos no invasores y el frasco se transfiere a 40 grados Celsius para inducir el desarrollo del fenotipo.Después de 26 horas, las vacuolas contienen de ocho a 16 parásitos. A continuación, las células se estimulan con compuestos inductores de la egressión. Los parásitos mutantes con un defecto en la egressión permanecerán intracelulares, mientras que los parásitos de tipo salvaje saldrán al medio.Los parásitos de tipo silvestre se eliminan mediante lavados y las células restantes se incuban nuevamente a 35 grados Celsius para enriquecer la población mutante. Finalmente, se verifica el fenotipo mutante y se aíslan clones individuales de parásitos a partir de la población enriquecida mediante dilución límite. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el método de inhalación bio, es que el enriquecimiento específico de los mutantes de egreso es mucho más eficiente.Tuvimos por primera vez el ID para este método cuando identificamos un mutante de egreso a partir de un panel de mutantes con defectos de crecimiento. Utilizando ese mutante, optimizamos el procedimiento de cribado mezclándolo en diversas proporciones con parásitos de tipo salvaje. El procedimiento lo demostrará Bradley Coleman, un posdoctorado de mi laboratorio.Este procedimiento utiliza compuestos y líquidos altamente mutagénicos, así como el parásito infeccioso. Es esencial el uso de equipo de protección adecuado, incluyendo una bata de laboratorio, guantes dobles y una cabina de seguridad biológica. Cualquier desecho líquido generado debe recogerse por separado para su eliminación adecuada.Comience inoculando células de fibroblastos de prepucio humano o células HFF confluentes con un mililitro de taquizoítos recién lisados en medio uno. Luego, coloque el matraz en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con 5%CO2 durante 18 a 25 horas. Al día siguiente, reemplace el medio con 10 mililitros de medio con 0,1% de suero bovino fetal e incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos.Después de la incubación, agregue cero, 12,5, 25, 50 o 100 microlitros de mutágeno ENU por frasco. Las diluciones de trabajo serán 1,25, 2,5, 5 y 10 milimolares, respectivamente. Añada hasta 100 microlitros de DMSO a cada frasco.Incubar durante cuatro horas en un incubador a 37 grados Celsius. Enjuagar la monocapa con 10 mililitros de PBS frío, 3 veces durante 10 segundos. Añadir cinco mililitros de PBS y utilizar un raspador celular para soltar la monocapa.Luego, utilizando tijeras resistentes, corte el extremo del protector de la aguja para que la aguja no quede expuesta. A continuación, transfiera las células a una jeringa y páselas a través de una aguja de calibre 26,5. Para eliminar físicamente el parásito de los fibroblastos, realizar múltiples pasajes por la aguja aumentará la eficiencia al liberar los parásitos de la célula huésped.Acople un filtro de policarbonato de 3,0 micrómetros a una jeringa. Cargue las células pasadas a través de la aguja en la jeringa y páselas a través del filtro hacia un tubo para depositar los parásitos en un hemocitómetro para su conteo. El aspecto más difícil de este procedimiento es distinguir los parásitos de los residuos.Para asegurar el éxito, es importante que deje asentar a los parásitos antes de contarlos. Después de permitir que los parásitos se asienten durante cinco minutos, cuéntelos. Una vez que se haya determinado la concentración de toxoplasma, dilúyalos a 3.333 parásitos por mililitro en ED uno para 10 mililitros.Se necesitan 33.333 parásitos. Añada tres mililitros al primer pocillo de una placa de seis pocillos con células HFF para inocularlos con 10.000 parásitos. Luego, diluya seriamente los parásitos de forma diez veces mayor en los siguientes tres pocillos transfiriendo 300 microlitros de un pocillo al siguiente.Deje las placas sin perturbar en el incubador a 37 grados Celsius durante siete días. Luego de transcurrida una semana, aspire el medio y fije las células añadiendo tres mililitros de etanol al 100 % a cada pocillo durante 15 minutos. Después de eliminar el etanol, tiña las células añadiendo tres mililitros de solución de violeta de cristal a cada pocillo durante 15 minutos.Finalmente, lave cada pocillo con tres mililitros de PBS durante un minuto. Una vez que la placa esté seca, cuente las placas y seleccione la concentración del mutágeno necesaria para lograr la supervivencia del 30 % de los parásitos expuestos. Históricamente se ha utilizado una dosis que provoca una mortalidad del 70 % y que induce menos de 100 mutaciones puntuales por genoma.El siguiente paso del procedimiento consiste en enriquecer los mutantes de egreso en la población. Una vez que la población se haya expandido, añada 120.000 parásitos recién lisados a células HFF confluentes en 10 mililitros. Incube ED uno durante dos horas a 35 grados Celsius.Esto sincronizará la población limitando el tiempo de invasión. Tras la incubación, aspire el medio y enjuague las células durante 10 segundos con 10 mililitros de PBS frío; agregue 10 mililitros de medio ED uno suplementado con 25 miligramos por mililitro de sulfato de dextrano.Esto saturará las proteínas de superficie de unión a glicanos en los parásitos para que puedan volver a unirse e invadir la célula huésped. Incube el matraz durante 26 horas en una incubadora humedecida a 40 grados Celsius con 5%CO2. Durante este tiempo, la proteína normalmente plegada será reemplazada por una proteína sensible a la temperatura mal plegada.Al día siguiente, diluya el inductor de egreso de elección hasta la concentración de trabajo en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros. H-B-S-S-C suplementado con 25 miligramos por mililitro de sulfato de dextrano. Colóquelo en un baño de agua para precalentar la solución durante 30 minutos.Aspire el medio de los frascos infectados con parásitos y agregue la solución inductora de egreso precalentada. Incube a 37 grados Celsius según se indica en el documento adjunto. A continuación, aspire el medio y enjuague durante 10 segundos.Con 10 mililitros de PBS frío, añada 10 mililitros de ED uno suplementado con 25 miligramos por mililitro de sulfato de dextrano y 50 micromoles de carbamato de piridina DIO, luego incube durante cinco horas a 35 grados Celsius. Tras la incubación, aspire el medio y enjuague una vez con PBS durante 10 segundos.Luego agregue 10 mililitros. EED un medio, devuelva el matraz al incubador de 35 grados Celsius. Agite diariamente para dispersar los parásitos en egreso.Continúe la incubación hasta que los parásitos destruyan la monocapa. Aproximadamente siete días después de la selección de enriquecimiento, la población se propaga para un paso. Luego, los fenotipos se confirman mediante un ensayo de egreso.Inocule 20.000 parásitos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga células HFF confluentes cultivadas sobre cubreobjetos, e incube durante ocho horas en un incubador a 35 grados Celsius para permitir la invasión de todos los parásitos en el medio a la temperatura permisiva. Luego transfiera la placa a un incubador a 40 grados Celsius durante 24 horas para inducir el fenotipo y cultivar oles que contengan de ocho a 24 parásitos tras lavar cada pocillo con un mililitro de PBS durante 10 segundos. A temperatura ambiente, añada un mililitro de inductor de egreso previamente calentado y diluido en H-B-S-S-C e incube durante los tiempos descritos en el protocolo escrito adjunto.Aspire el medio y fije añadiendo un mililitro de metanol al 100 % a cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego lave con un mililitro de PBS a temperatura ambiente. Tras el lavado y el montaje de las laminillas, utilice un microscopio con un objetivo de 40 a 60 x para contar el porcentaje de egreso de S frente a las vacuolas intracelulares. Tras la validación del fenotipo de la población enriquecida de mutantes de egreso, se realiza la clonación de la población policlonal para obtener clones individuales de parásitos.Después de determinar la concentración del parásito diluido a 500 parásitos por mililitro en medio ED uno en una placa de 84 pocillos que contiene una monocapa confluente de células HFF. Reemplace el medio con 40 microlitros por pocillo de medio ED uno utilizando una pipeta multicanal. Cuatro poblaciones policlonales representadas como roja, azul, amarilla y verde.En esta ilustración se puede clonar en una placa para lograrlo con esta pipeta. 40 microlitros por pozo de mutante diluido uno en los pozos C3 a C12, mutante dos en los pozos C13 a C22, mutante tres en los pozos H3 a H12, y mutante cuatro en los pozos H13 a H22. El volumen total en cada pozo ahora debe ser de 80 microlitros.Luego, utilizando una pipeta multicanal, aspire y expulse la solución cinco veces arriba y abajo, y transfiera 40 microlitros a la fila debajo de la fila inicial. Continúe estas diluciones seriadas por dilución doble hasta la fila H, mutantes uno y dos, o hasta la fila N, mutantes tres y cuatro. Deseche los 40 microlitros adicionales de la última fila.Incubar en una incubadora a 35 grados Celsius durante siete a 10 días sin perturbar la placa. La semana siguiente, revisar las pocillos en un microscopio invertido con un objetivo de 10 a 20 x para detectar la presencia de placas individuales visibles como orificios en la monocapa. Seleccionar cuatro pocillos por mutante que contengan una sola placa y transferir los parásitos a un frasco de cultivo de tejidos T 12.5 confluente con células HFF y lleno con cinco mililitros.ED un medio, haga crecer los parásitos en una incubadora a 35 grados Celsius. Agite los frascos diariamente para dispersar los parásitos extracelulares. Esto generalmente toma siete días.Los ensayos de placas se realizaron en una placa de seis pocillos utilizando diversas concentraciones del agente mutagénico EMS y diferentes números de parásitos por pocillo. Como se muestra en este video, las manchas blancas en los pocillos que se observan aquí son placas de parásitos formadas en la monocapa de HFF en placas tratadas con EMS. Los resultados de estos ensayos de placas se utilizaron para generar curvas de supervivencia de parásitos expuestos a dosis crecientes de EMS y ENU.A continuación, se eligió la dosis que inducía un 70% de mortalidad para los experimentos de mutagénesis. En un experimento diferente, se evaluó mediante citometría de flujo el porcentaje de fenotipo mutante de egreso en la población tras el enriquecimiento, como se muestra aquí. Cuando la proporción inicial de parásitos mutantes de egreso respecto al tipo silvestre fue de uno en 10.000, se logró una pureza del 80% mediante enriquecimiento.Sin embargo, cuando la proporción inicial era de uno en 100.000 parásitos, la población aislada representó solo del uno al 2%. Estos datos sugieren que la capacidad de enriquecimiento de la prueba es mil veces mayor. En un tercer experimento, se indujo la salida mediante el ion calcio A23187. En estas imágenes, las flechas indican cuatro VAE diferentes que contienen de cuatro a ocho parásitos que expresan YFP en los controles.Sin embargo, las flechas marcan cuatro grupos de parásitos dispersos que reflejan cuatro eventos independientes de egress VA. Por lo tanto, la proporción entre fenotipos mutantes y de tipo salvaje puede determinarse fácilmente mediante conteo siguiendo este procedimiento. Pueden realizarse métodos adicionales como complementación cósmica o secuenciación del genoma completo para identificar la mutación causal y, por ende, el gen de interés.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo titular un mutágeno de interés, generar mutaciones en una población de parásitos Toxoplasma y aislar mutantes individuales sensibles a la temperatura para la egressa a partir de esa población mutagénica. No olvide que trabajar con parásitos Toxoplasma resistentes a la parametamina puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

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Forward genetics es un poderoso enfoque para identificar genes en patógenos intracelulares importantes para la resistencia a la inmunidad celular autónoma. El enfoque actual utiliza células inmunitarias innatas, concretamente macrófagos, para identificar nuevos genes de Toxoplasma gondii importantes para la evasión inmunitaria.

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Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Los detalles se presentan sobre cómo mapeo QTL con un mapa genético basado en la secuencia del genoma completo se puede utilizar para identificar un gen de resistencia a los medicamentos en Toxoplasma gondii y cómo esto se puede verificar con el sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente un objetivo genómico, en este caso el Gen de resistencia a fármacos.

QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em&gt; Toxoplasma gondii</em

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Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress

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