Medición de actividad de factor V en el plasma humano usando un ensayo de coagulación de microplacas

El objetivo general del siguiente procedimiento fue desarrollar un ensayo de microplaca que mide la actividad de un factor V de proteína de coagulación durante la formación de un coágulo de fibrina en plasma humano. En respuesta a una lesión, el proceso de coagulación de la sangre se activa y da lugar a una serie de reacciones de conversión de ximogen a proteasa que finalmente conducen a la generación de la enzima de coagulación trombina, la trombina convierte el fibrinógeno soluble en monómeros de fibrina, que luego se asocian para formar un coágulo de fibrina insoluble. Normalmente, la sangre permanece como un líquido que fluye libremente durante el estado sano o no lesionado, y la cantidad de fibrina formada es igual a la cantidad de fibrina degradada o descompuesta.

Sin embargo, en ciertas situaciones de enfermedad, demasiada coagulación conduce a enfermedades cardíacas y accidentes cerebrovasculares, mientras que muy poca coagulación conduce a tendencias hemorrágicas, que a menudo se observan en las hemofilias. El factor V es una proteína en el plasma que en su forma activada factor cinco A es un acelerador crítico de la generación de trombina durante la formación de coágulos de fibrina como parte del complejo enzimático de protrombina, la protrombina se compone de cuatro componentes factor 10 A, la proteasa factor cinco A, el cofactor lípido, la superficie y el calcio. El factor meline 5 A aumenta la eficiencia catalítica o kcat del factor 10 A hacia su sustrato protrombina en aproximadamente 3000 veces, mejorando así profundamente la generación de trombina y la formación de coágulos de fibrina.

La plataforma de microplacas es la preferida para medir eventos catalizados por enzimas debido a su conveniencia, costo de tiempo, pequeños volúmenes de muestra, monitoreo continuo y alto rendimiento. El evento de formación de coágulos de fibrina se puede monitorear con un lector de microplacas midiendo el aumento en la absorbancia de luz del plasma a medida que cambia de una apariencia amarilla clara sin coágulo de fibrina presente y con una absorbancia de luz mínima a una apariencia opaca y turbia con un coágulo de fibrina y máxima absorción de luz. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como los ensayos manuales de tubo basculante o los ensayos con analizadores automatizados, es que el método es rápido, económico, tiene requisitos de volumen de muestra pequeños y tiene un alto rendimiento.

El ensayo mide la actividad del factor cinco activado involuntariamente y activado por la trombina para obtener una evaluación cuantitativa completa de su actividad funcional total. La demostración de esa técnica estará a cargo de Derek Tilley, un estudiante de maestría en el laboratorio. Con el fin de medir la actividad del factor cinco en una muestra de plasma, es necesario construir la actividad de una etapa del factor cinco, curvas estándar del tiempo de formación de coágulos de fibrina en el panel A y la tasa inicial de formación de coágulos de fibrina en el panel B utilizando plasma humano normal o NHP como estándar que contiene por definición una unidad de actividad del factor cinco por ML descongelar el plasma deficiente del factor cinco, plasma humano normal, y muestras de plasma desconocido y tromboplastina a 37 grados durante 10 minutos.

Mezcle suavemente la transferencia de plasma y plastia trombo deficiente de factor cinco a bandejas de lavado de plástico separadas e incube en hielo. Almacene el plasma humano normal y muestree los fragmentos de plasma en hielo después de mezclarlo suavemente. Almacene el cloruro de calcio 25 milimolares en agua destilada en una bandeja de lavado separada a temperatura ambiente para las curvas estándar de actividad de una etapa de factor cinco.

Prepare 200 microlitros cada uno de doble dilución en serie de plasma humano normal de 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1, 28, 2, 56 y 512 veces en HBS pH 7.4 usando tubos de microcentrífuga de 1.5 ml, pozo de vórtice e incube en hielo. Para las muestras de plasma desconocidas, prepare 200 microlitros de diluciones de 40 veces de plasma humano normal y plasmas de muestra desconocida en HBS pH 7,4 utilizando tubos de microcentrífuga de 1,5 ML. Coloque cinco tiras de micropocillos en el soporte de la plantilla del lector de microplacas.

Encienda el lector de microplacas y acceda al software de aplicación de microplacas Softmax Pro mediante una pipeta multicanal. Realice adiciones simultáneas de 50 microlitros de plasma deficiente en factor cinco a todos los pocillos de microplacas de muestra utilizando una sola pipeta, agregue 50 microlitros de las 10 diluciones en serie preparadas de plasma humano normal y las 40 diluciones de plasma humano normal y muestras de plasma desconocido para separar los pocillos de MICROPLACA utilizando una pipeta multicanal, agregue 50 microlitros de plastia de trombo a todos los pocillos de muestra. Incubar en el lector de microplacas a 25 grados centígrados durante un minuto agitando durante los 15 a 25 segundos de la incubación de un minuto.

A través del ordenador conectado al lector MICROPLATE, acceda al software de aplicación Softmax Pro Microplate. Configure el lector de microplacas en la longitud de onda de absorbancia a 405 nanómetros, el modo a la temperatura cinética en 25 grados Celsius y programe el lector de microplacas para que se agite durante los primeros cinco segundos después de la adición de cloruro de calcio y mida la absorbancia a 405 nanómetros cada cinco segundos durante seis minutos. A partir de entonces, el intervalo de agitación de cinco segundos no se incluye en los tiempos de coagulación calculados utilizando dos pipetas multicanal que añaden simultáneamente 50 microlitros de cloruro de calcio a las dos tiras de microplaca con muestras.

Espere 15 segundos e inmediatamente presione el icono de inicio en Softmax Pro desde la computadora para comenzar el ensayo. Para cada muestra de plasma analizada, el tiempo de formación del coágulo se determina y se define como el tiempo en segundos para alcanzar el aumento máximo medio de la absorbencia. La tasa inicial de formación de coágulos se define como la tasa de aumento de la absorbencia en los primeros cinco puntos temporales de la parte lineal del aumento de la absorbencia en función del tiempo.

El grado de formación de coágulos se define como la diferencia entre la absorbencia máxima y mínima lograda durante el evento de formación de coágulos al final de la ejecución. Utilice los perfiles de ABSORBENCIA en función del tiempo de Softmax Pro para determinar el tiempo, la tasa inicial y la extensión de la formación de coágulos para la dilución en serie de plasma humano normal. Para construir las curvas estándar de actividad de una etapa del factor V, utilice los tiempos de coágulo para el plasma humano normal diluido 40 veces y las incógnitas de plasma de muestra para interpolar la actividad del factor cinco en unidades por molino de la curva estándar de actividad de una etapa del factor cinco.

Esto representa el factor cinco de la actividad en una etapa o sin activación intencional por trombina. Este es un ejemplo representativo de la formación de coágulos de fibrina en el ensayo de factor cinco a lo largo del tiempo generado por el lector de microplacas. El perfil representa la formación de coágulos de fibrina utilizando plasma humano normal diluido 32 veces en una sola microplaca.

Bueno, el eje vertical denota el cambio en el absorbente a 405 nanómetros que se produjo como resultado de la formación de coágulos de fibrina. El tiempo de formación del coágulo se calculó como el punto medio de la curva de absorbencia frente al tiempo, 36,4 segundos. La tasa inicial de formación de coágulos se calculó en 611,88 miliunidades por minuto.

La extensión de la formación de nubes se calculó en 0,35 unidades. El ensayo de factor cinco mide con precisión el tiempo, la tasa inicial y la extensión de la formación de nubes. La inspección de los pozos una vez finalizado el ensayo confirmó que se produjo la formación de coágulos.

Todas las reacciones alcanzaron aproximadamente el mismo grado de formación de nubes, con un cambio general en la absorbancia a 405 nanómetros de entre 0,35 y 0,45 unidades entre la absorbancia inicial antes y la absorbancia máxima después de la tropoplastia y el cloruro de calcio. Además, se muestran ejemplos representativos de la actividad del factor cinco en una etapa, la curva estándar del tiempo de coágulo en segundos frente a la actividad del factor cinco en unidades por mil, y la tasa inicial de formación de garras en mili unidades por minuto frente al factor cinco. La actividad en unidades por mil, para el plasma humano normal, se muestra en el panel A y el panel B, respectivamente.

Ya que el factor cinco normalmente se activa con la trombina. El cofactor activo factor cinco A, un segundo ensayo después de la adición e incubación con trombina, es fundamental para medir con precisión la actividad de dos etapas del factor cinco de una muestra de plasma con activación intencional por trombina agregada para el ensayo de dos etapas del factor cinco. Prepare de 200 a 300 microlitros de trombina purificada a su concentración final de cien nano molares en HBS pH 7.4 e incube en hielo, diluya 120 microlitros del plasma humano por encima de lo normal y muestree plasmas de 40 a 100 veces con 170 microlitros de HBS pH 7.4 que contenga 2.8 milimolares.

Cloruro de calcio. Añadir 10 microlitros de trombina para conseguir una concentración final de 10 nanomolares a cada muestra. Vórtice. Bien para mezclar e incubar a 37 grados Durante un minuto, diluya el plasma humano normal y los plasmas de muestra a 500 veces agregando 400 microlitros de HBS pH 7.4.

Determine el tiempo de coagulación para el plasma humano normal en cada uno de los ensayos de incógnitas de plasma de la muestra a partir de los perfiles de absorbancia frente al tiempo en soft max Pro. Teniendo en cuenta la dilución de 500 veces, utilice el tiempo de coágulo de cada muestra para calcular la actividad de dos etapas del factor cinco a partir de la curva estándar de una etapa del tiempo de coágulo frente a la actividad. Esto representa el factor cinco de la actividad en dos etapas o con activación intencional por trombina.

La actividad total del factor cinco puede calcularse entonces como el factor cinco de la actividad de dos etapas menos el factor cinco de la actividad de una etapa. Se utilizó la curva estándar del tiempo de coágulo logarítmico frente a la actividad del factor cinco logarítmico cinco para medir la actividad del factor cinco en plasma humano normal y en plasmas de nueve pacientes con coagulación intravascular diseminada o CID, los nueve pacientes con CID. Mostraron actividades de factor cinco en una etapa y tasas iniciales de formación de coágulos que disminuyeron en promedio en un 54 y 18%El factor cinco, dos etapas y la actividad total disminuyeron en los pacientes con CID en promedio en un 44 y 42% en comparación con el plasma humano normal.

El factor cinco y los pacientes con CID dieron lugar a un tiempo prolongado y una disminución de la tasa de formación de coágulos de fibra. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo implementar este método en su laboratorio. El método puede adaptarse fácilmente para medir la actividad de cualquier factor de coagulación en el plasma, lo que lo hace adecuado para una amplia gama de aplicaciones clínicas y de investigación.

En última instancia, esta información del factor V tendrá un impacto positivo en los entornos sanitarios a través del diagnóstico y tratamiento tempranos de los trastornos trombóticos o hemorrágicos, como la CID.