Medición de actividad de factor V en el plasma humano usando un ensayo de coagulación de microplacas

El objetivo general del siguiente procedimiento fue desarrollar un ensayo en microplaca que mida la actividad del factor de coagulación V durante la formación de un coágulo de fibrina en plasma humano. Como respuesta a una lesión, se activa el proceso de coagulación sanguínea, lo que provoca una serie de reacciones de conversión de zimógenos en proteasas que finalmente conducen a la generación de la enzima trombina; la trombina escinde el fibrinógeno soluble en monómeros de fibrina, los cuales luego se asocian para formar un coágulo de fibrina insoluble. Normalmente, la sangre permanece como un líquido que fluye libremente en estado saludable o no lesionado, y la cantidad de fibrina formada es igual a la cantidad de fibrina degradada o descompuesta.

Sin embargo, en ciertas enfermedades, una coagulación excesiva conduce a enfermedades cardíacas y accidentes cerebrovasculares, mientras que una coagulación insuficiente provoca tendencias al sangrado, que con frecuencia se observan en las hemofilias. El factor V es una proteína en el plasma que, en su forma activada factor cinco A, actúa como un acelerador crítico de la generación de trombina durante la formación del coágulo de fibrina como parte del complejo enzimático de protrombina, el cual está compuesto por cuatro componentes: el factor 10 A, el factor cinco A (proteasa), el lípido cofactor, la superficie y el calcio. El factor cinco A aumenta la eficiencia catalítica o kcat del factor 10 A hacia su sustrato protrombina aproximadamente 3000 veces, mejorando así profundamente la generación de trombina y la formación del coágulo de fibrina.

La plataforma de microplaca es preferida para medir eventos catalizados por enzimas debido a su comodidad, bajo costo de tiempo, pequeños volúmenes de muestra, monitoreo continuo y alto rendimiento. El evento de formación del coágulo de fibrina puede monitorearse con un lector de microplacas mediante la medición del aumento en la absorbancia de luz del plasma, que cambia de una apariencia amarilla clara sin presencia de coágulo de fibrina y con absorbancia mínima de luz, a una apariencia opaca y turbia con coágulo de fibrina y absorbancia máxima de luz. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes, como los ensayos manuales de tubo inclinado o ensayos con analizadores automatizados, son que el método es rápido, económico, requiere pequeños volúmenes de muestra y tiene alto rendimiento.

El ensayo mide la actividad del factor cinco activado involuntariamente y del factor cinco activado por trombina para obtener una evaluación cuantitativa completa de su actividad funcional total. Demostrando esta técnica estará Derek Tilley, un estudiante de maestría en el laboratorio. Con el fin de medir la actividad del factor cinco en una muestra de plasma, es necesario construir la actividad del factor cinco en una etapa, curvas estándar del tiempo de formación del coágulo de fibrina en el panel A y la velocidad inicial de formación del coágulo de fibrina en el panel B utilizando plasma humano normal o PHN como estándar, el cual contiene por definición una unidad de actividad del factor cinco por ml, descongelar el plasma deficiente en factor cinco, plasma humano normal y muestras de plasma desconocidas y tromboplastina a 37 grados durante 10 minutos.

Mezcle suavemente el plasma deficiente en factor cinco y la tromboplastina, y transfiera a bandejas de lavado de plástico separadas; incube en hielo. Almacene el plasma humano normal y las muestras de plasma de concentración desconocida en hielo tras mezclar suavemente. Almacene el cloruro de calcio 25 milimolar en agua destilada en una bandeja de lavado separada a temperatura ambiente para las curvas estándar de actividad en una etapa del factor cinco.

Prepare 200 microlitros de cada dilución seriada al doble de plasma humano normal desde 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 y 512 veces en HBS pH 7,4 utilizando tubos microcentrífugos de 1,5 ml, mezcle bien mediante vortex e incube en hielo. Para las muestras de plasma desconocidas, prepare 200 microlitros de cada dilución 40 veces del plasma humano normal y de los plasmas de muestras desconocidas en HBS pH 7,4 utilizando tubos microcentrífugos de 1,5 ml. Coloque cinco tiras de micropocillos en el soporte de plantilla del lector de microplacas.

Encienda el lector de microplacas y acceda al software de aplicación de microplacas Softmax Pro utilizando una pipeta multicanal. Realice adiciones simultáneas de 50 microlitros de plasma deficiente en factor cinco a todas las pocillos de muestra de la microplaca utilizando una pipeta única; agregue 50 microlitros de las 10 diluciones seriadas preparadas de plasma humano normal y las diluciones 40 veces de plasma humano normal y muestras de plasma desconocidas en pocillos separados de la MICROPLACA utilizando una pipeta multicanal; agregue 50 microlitros de tromboplastina a todos los pocillos de muestra. Incube en el lector de microplacas a 25 grados Celsius durante un minuto con agitación durante los segundos 15 a 25 del minuto de incubación.

Utilice el ordenador conectado al lector de MICROPLACAS para acceder al software de aplicación Softmax Pro Microplate. Configure el lector de microplacas para que la longitud de onda de absorbancia sea de 405 nanómetros, en modo cinético y a una temperatura de 25 grados Celsius, y programe el lector de microplacas para que agite durante los primeros cinco segundos tras la adición de cloruro de calcio y mida la absorbancia a 405 nanómetros cada cinco segundos durante seis minutos. Posteriormente, el intervalo de agitación de cinco segundos no se incluye en los tiempos de coagulación calculados; utilizando simultáneamente dos pipetas multicanal, agregue 50 microlitros de cloruro de calcio a las dos tiras de microplaca con muestras.

Espere 15 segundos y presione inmediatamente el icono de inicio en Softmax Pro desde la computadora para comenzar el ensayo. Para cada muestra de plasma analizada, se determina el tiempo de formación del coágulo y se define como el tiempo en segundos necesario para alcanzar el incremento medio máximo en absorbancia. La velocidad inicial de formación del coágulo se define como la velocidad de aumento en absorbancia durante los primeros cinco puntos temporales de la porción lineal del incremento de absorbancia frente al tiempo.

El grado de formación del coágulo se define como la diferencia entre la absorbancia máxima y mínima alcanzada durante el evento de formación del coágulo al finalizar el ensayo. Utilice los perfiles de absorbancia frente al tiempo en Softmax Pro para determinar el tiempo, la velocidad inicial y el grado de formación del coágulo en la dilución en serie del plasma humano normal. Para construir las curvas estándar de actividad del factor V en una etapa, utilice los tiempos de coagulación del plasma humano normal diluido 40 veces y de las muestras de plasma desconocidas para interpolar la actividad del factor cinco en unidades por mililitro a partir de la curva estándar de actividad del factor cinco en una etapa.

Esto representa la actividad del factor V en una etapa o la actividad sin activación intencional por trombina. Este es un ejemplo representativo de la formación del coágulo de fibrina en el ensayo del factor V a lo largo del tiempo, generado por el lector de microplacas. El perfil representa la formación del coágulo de fibrina utilizando plasma humano normal diluido 32 veces en una sola microplaca.

Bueno, el eje vertical indica el cambio en absorbancia a 405 nanómetros que ocurrió como resultado de la formación del coágulo de fibrina. El tiempo de formación del coágulo se calculó como el punto medio de la curva de absorbancia versus tiempo, 36,4 segundos. La velocidad inicial de formación del coágulo se calculó como 611,88 mil unidades por minuto.

La extensión de la formación de nubes se calculó como 0,35 unidades. El ensayo del factor cinco mide con precisión la velocidad inicial y la extensión de la formación de nubes. La inspección de las pocilas tras la finalización del ensayo confirmó que se produjo la formación de coágulos.

Todas las reacciones alcanzaron aproximadamente el mismo grado de formación de coágulo, con un cambio general en la absorbancia a 405 nanómetros entre 0,35 y 0,45 unidades entre la absorbancia inicial antes y la absorbancia máxima después de la tromboplastina y el cloruro de calcio. Se añaden ejemplos representativos de la actividad del factor V en una etapa, la curva estándar del tiempo de coagulación en segundos frente a la actividad del factor V en unidades por mil y la velocidad inicial de formación del coágulo en miliumidades por minuto frente a la actividad del factor V. La actividad en unidades por mil para plasma humano normal se muestra en el panel A y el panel B, respectivamente.

Dado que el factor cinco se activa normalmente con trombina, es fundamental realizar un segundo ensayo tras la adición e incubación con trombina para medir con precisión la actividad del factor cinco en dos etapas en una muestra de plasma, con activación intencional mediante trombina agregada para el ensayo del factor cinco en dos etapas. Prepare de 200 a 300 microlitros de trombina purificada a una concentración final de cien nanomolar en HBS pH 7,4 e incube en hielo. Diluya 120 microlitros del plasma humano normal anterior y los plasmas de muestra entre 40 y 100 veces con 170 microlitros de HBS pH 7,4 que contenga 2,8 milimolar.

Cloruro de calcio. Añada 10 microlitros de trombina para obtener una concentración final de 10 nanomolar en cada muestra. Agite bien para mezclar e incube a 37 grados durante un minuto. Diluya el plasma humano normal y los plasmas de muestra 500 veces añadiendo 400 microlitros de HBS pH 7,4.

Determine el tiempo de coagulación para el plasma humano normal en cada uno de los ensayos de muestras desconocidas de plasma a partir de los perfiles de absorbancia frente al tiempo en Soft Max Pro. Teniendo en cuenta la dilución 500 veces, utilice el tiempo de coagulación de cada muestra para calcular la actividad de dos etapas del factor cinco a partir de la curva estándar de una etapa del factor cinco, que relaciona el tiempo de coagulación con la actividad. Esto representa la actividad del factor cinco en dos etapas, es decir, aquella con activación intencional por trombina.

La actividad total del factor cinco puede calcularse entonces como la actividad del factor cinco en dos etapas menos la actividad del factor cinco en una etapa. Se utilizó la curva estándar de tiempo de coagulación logarítmico frente a actividad logarítmica del factor cinco para medir la actividad del factor cinco en plasma humano normal y en plasmas de nueve pacientes con coagulación intravascular diseminada o CID; los nueve pacientes con CID presentaron actividades del factor cinco en una etapa y velocidades iniciales de formación del coágulo reducidas en promedio en un 54 % y un 18 %, respectivamente. La actividad del factor cinco en dos etapas y la actividad total se redujeron en los pacientes con CID en un 44 % y un 42 % en promedio, en comparación con el plasma humano normal.

El factor cinco y los pacientes con CID dieron como resultado un tiempo prolongado y una disminución en la tasa de formación de coágulos de fibrina. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo implementar este método en su laboratorio. El método puede adaptarse fácilmente para medir la actividad de cualquier factor de coagulación en plasma, lo que lo hace adecuado para una amplia gama de aplicaciones clínicas e investigativas.

En última instancia, esta información sobre el factor V tendrá un impacto positivo en los entornos sanitarios mediante el diagnóstico y tratamiento tempranos de trastornos trombóticos o hemorrágicos, como la CID.